总DNA提取(蛋白酶K法)改进蛋白酶K法提取环境微生物样品总DNA(Zhu S)
所需试剂:
0.15M NaCl
0.1M EDTA
1% SDS
NaAc (3M, pH 5.2)
蛋白酶K溶液20mg/ml (用无菌水配制)
溶菌酶溶液50mg/ml (用无菌水配制)
液氮
实验步骤:
(1)将适量环境样品(如土壤或污泥)装入1.5 ml Eppendorf管;
(2)加入1 ml 0.15M NaCl-0.1M EDTA;
(3)加入溶菌酶(sigma)至终浓度为2mg/ml并置于37℃水浴中温育1h;
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改进蛋白酶K法提取环境微生物样品总DNA(Zhu S)
所需试剂:
0.15M NaCl
0.1M EDTA
1% SDS
NaAc (3M, pH 5.2)
蛋白酶K溶液20mg/ml (用无菌水配制)
溶菌酶溶液50mg/ml (用无菌水配制)
液氮
实验步骤:
(1)将适量环境样品(如土壤或污泥)装入1.5 ml Eppendorf管;
(2)加入1 ml 0.15M NaCl-0.1M EDTA;
(3)加入溶菌酶(sigma)至终浓度为2mg/ml并置于37℃水浴中温育1h;
(4)冻融三个循环(液氮3 min-65℃干热器3min);
(5)分别加入蛋白酶K溶液和SDS至终浓度为0.02和0.5%(wt / vol每一百ml 溶
液中溶质克数),65℃温育1h;
(6)裂解液依次用等体积的酚、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)、氯仿抽提;
(7)加入1/4体积的NaAc (3M, pH 5.2)和2体积冷的纯乙醇沉淀核酸;-20℃放
置1h;
(8)离心收集12000prm,10min,回收DNA沉淀;
(9)DNA沉淀用70%乙醇和无水乙醇洗涤后风干;
(10)每管加入30-50ulTE(Tris-HCl缓冲液)回溶及电泳检测,-20℃保存。
注:这种方法比较适合提取土壤环境微生物样品的总DNA。因为本法没有利用机械力量破碎细胞,因而所提取到的总DNA受机械剪切的程度较少,故用这种方法提出的DNA进行PCR扩增,其产物通常含有较少的嵌合体(chimera)。
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