医学科研入门科研设计和撰写申报书PPT

第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY医学科学研究入门2.科研设计与课题申请书的撰写第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITYBackground–minireviewUnclearControversialNotreportedFurtherinvestigationShortcomingsHypothesisExperimentsConclusionFutureInvestigationSignificanceMethodResultsDiscussion第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY科研设计*科研设计是在纸上做实验计划和实验。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY科研设计 概论 医学科研的基本要素 科研设计的基本原则 科研设计的基本步骤 统计学设计第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY定义医学科研设计是研究医学科学研究中如何科学、合理地安排实验因素，提高实验效应，及如何排除影响实验的非处理因素。考虑周全、设计合理的研究方案可收事半功倍之效，而设计不佳的研究方案常招致失败及时间、经费的浪费。专业设计：指运用专业理论知识和技术进行设计,主要是解决研究的有用性、独创性和科学性,以回答、解决科学问题，验证专业假说。统计学设计：运用数理统计学理论和方法进行设计,包括资料的收集、整理、分析全过程的统计学设想和科学安排，以保证样本的代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 性和样本间的可比性,以最少的调查、实验观察例数进行高效率的统计分析，得出准确的结果和可靠的结论。*专业设计是科研是否有用、是否先进、是否科学的前提。而统计学设计是科研结果可靠性和经济性的保证。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY专业设计错误 苏联一神经论权威设计了免疫抗体形成的神经反射机制的实验：他将动物后肢与躯体分离，仅保留由肢体传入躯体的神经干，然后在“离体”后肢注射抗原，不久将该神经干切断。过些时候动物血中出现特异性抗体。该权威认为特异性抗体是由于抗原作用于神经感受器经反射而形成的。 设计用动物急性感染实验模型研究Th1/Th2细胞在炎症中的作用。*专业设计：例如，苏联一神经论权威设计了免疫抗体形成的神经反射机制的实验：他将动物后肢与躯体分离，仅保留由肢体传入躯体的神经干，然后在“离体”后肢注射抗原，不久将该神经干切断。过些时候动物血中出现特异性抗体。该权威认为特异性抗体是由于抗原作用于神经感受器经反射而形成的。这个专业设计存在严重缺陷，因为神经干存在有内淋巴组织结构。后有人用同位素示踪研究证实，注入“离体”后肢的抗原可经神经干的内淋巴直接进入体内，从而否定了该权威的错误结论，而该结论则是由于错误的专业设计导致的。后一例是错误的专业设计导致得不出实验结果。专业设计错误主要因为专业理论基础知识掌握得不好造成的。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY定义医学科研设计是研究医学科学研究中如何科学、合理地安排实验因素，提高实验效应，及如何排除影响实验的非处理因素。考虑周全、设计合理的研究方案可收事半功倍之效，而设计不佳的研究方案常招致失败及时间、经费的浪费。专业设计：指运用专业理论知识和技术进行设计,主要是解决研究的有用性、独创性和科学性,以回答、解决科学问题，验证专业假说。统计学设计：运用数理统计学理论和方法进行设计,包括资料的收集、整理、分析全过程的统计学设想和科学安排，以保证样本的代表性和样本间的可比性,以最少的调查、实验观察例数进行高效率的统计分析，得出准确的结果和可靠的结论。*专业设计是科研是否有用、是否先进、是否科学的前提。而统计学设计是科研结果可靠性和经济性的保证。以最经济的方法设计实验，保证结果分析的可靠性。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY实　验　设　计　　实验设计主要为了保证科研结果符合四个性：　－有用性：目的性和可行性　－独创性：先进性　－可重复性　－经济性*前2项与专业设计相关，而后2项与统计设计相关。实验结果的重复性，是排除实验误差的重要手段第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY科研设计 概论 医学科研的基本要素 科研设计的基本原则 科研设计的基本步骤 统计学设计第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY是否主动施加干预?1.实验研究(干预):受试对象：人——临床试验（clinicaltrial）动物——动物实验（animalexperiment）临床试验：治疗——临床疗效实验预防——社区干预实验（communityinterventiontrial）2.调查研究(无干预):被动地观察、如实记录联系：调查研究可为实验研究提供线索，而实验研究还需要通过调查研究加以证实。*调研中吸烟和肺癌有密切的关系，需在实验中加以证实。如中国妇女吸烟少，但肺癌发病率与男性相似，推测可能与油烟相关，用实验证实后，应反过来做调研。调查研究放到统计学里讲第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY实验研究的基本要素降压药高血压病人血压值三要素：1.处理因素；2.受试对象；3.实验效应其他因素其他效应*如利尿剂与降压药合用，观察尿量与血压的关系第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY处理因素(studyfactor，treatment)例：药剂、手术方法、毒物 抓住主要处理因素 区分处理与非处理因素 处理因素必须标准化处理因素是指外界施加于受试对象的因素，是在实验中需观察并阐明其效应功能的因素。*主要处理因素：在选择处理因素时，研究者易犯的错误是抓不住实验中的主要处理因素，选择过多或过少的处理因素。前者使实验分组及受试对象的例数增多，实验误差难以控制；后者则因处理因素过少使研究工作缺乏深度与广度。研究者在实验研究开始前，应首先熟悉所研究领域的相关信息和本人前期研究工作的发现，通过大量阅读文献而为确定主要处理因素奠定基础。控制非处理因素：科学研究中除确定的处理因素外，凡是影响实验结果的其他因素均须明确，这些因素被称为非处理因素，或称混杂因素。非处理因素可产生混杂效应，影响处理因素效应的对比和分析。因此，实验设计时应设法控制这些非处理因素，消除其干扰作用，减小实验误差。应考虑的非处理因素有年龄、性别、营养状况等，溶解媒介等。科研设计中，对处理因素的标准化应给予规定和说明。所谓处理因素的标准化，即如何保证处理因素在实验全过程始终如一，保持不变，按同一标准进行。研究中施加于受试对象的处理因素的强度、频率、持续时间及施加方法等，均应通过查阅文献和预试验确定其最佳条件，并使之在整个研究中相对固定，以消除其对评价试验结果产生影响的可能性。如处理因素是细胞因子，须正确选择批号，且分装储存方法、施加处理方式、剂量及时间等均应标准化和相对固定化。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY单因素单水平表3-1细菌脂多糖对人外周血单个核细胞干扰素γ分泌的影响组别目的LPS观察LPS（1μg/ml）刺激后人外周血单个核细胞干扰素γ分泌水平对照溶剂（PBS），其他条件与实验组一致，排除非处理因素引起的变化第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY单因素多水平孕激素对滋养细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响组别目的孕激素1×10-7mol/L观察不同浓度的孕激素对滋养细孕激素1×10-6mol/L胞表达基质金属蛋白酶-9的影响孕激素1×10-5mol/L空白对照排除非处理因素的干扰*第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY多因素单水平美托康对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用组别脑缺血再灌注美托康目的处理组++观察美托康对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用对照A假手术+观察美托康的影响对照B+-观察脑缺血再灌注的影响对照C假手术-排除手术的影响对照D不手术-排除其他因素的影响第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY多因素多水平地塞米松抗过敏效应实验研究组别口服肌注目的处理组A0.1mg/kg口服小剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组B0.5mg/kg口服中剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组C1.0mg/kg口服大剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组D0.1mg/kg肌注小剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组E0.5mg/kg肌注中剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组F1.0mg/kg肌注大剂量地塞米松对过敏反应的作用对照组G溶剂排除口服因素造成的影响对照组H生理盐水排除肌注因素造成的影响对照组I排除其他因素的影响第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY受试对象(studysubjects)病例的选择：纳入标准、剔除标准动物的选择：种类、品系、年龄、体重、窝别、营养……离体器官、组织细胞分子 须对处理因素敏感 反应须稳定 体内外实验相结合invitro，invivo，exvivo*如对原发性高血压病人的临床试验：纳入标准：符合原发性高血压的诊断标准；剔除标准：继发性高血压等（1）须对处理因素敏感：根据不同研究目的，对实验动物的选择有不同要求，须针对性地注意种类、品系。以速发型过敏性呼吸道疾病动物实验研究为例，实验动物对过敏原敏感性的高低依次为：豚鼠﹥家兔﹥犬﹥小鼠﹥猫﹥蛙。因此，开展相关研究制备动物模型时，须选择敏感性高的动物，还须注意年龄(月龄)、性别、体重、窝别、营养状况及生活环境等因素。（2）反应须稳定：例如：为研究某药对高血压患者的降压效果，宜选用II期高血压患者作为受试对象，因I期高血压患者本身血压波动较大，而III期高血压患者对药物的敏感性低。此外，受试对象应诊断明确(依照国内或国际统一的诊断标准)、具有典型性临床表现、病史记录全面（心理状况、情绪起落、病情程度、病程长短、生活习惯、个人嗜好、饮食状况、家族史等），上述因素均可能不同程度地影响疗效，须严格加以控制，尽量使组间均衡化。体内外实验相结合：如体外实验一般都是可以人为控制，研究单一因素的作用，但是在体内常常是个网络作用；因此，体外实验有效，体内实验则未必一定能获得好反应。如某药物在体外可杀伤肿瘤细胞，但是在体内必须加以验证是否同样有效。反之，体内实验的结果常需要体外实验的验证。例如体内实验证实肝缺血再灌注损伤中性粒细胞在肝脏积聚，同时趋化因子IL-8和细胞因子产生增加，但是趋化因子是否是中性粒细胞在肝脏聚集的原因，就要用体外实验证实；将缺血再灌注损伤的肝脏提取液在体外趋化中性粒细胞，并用抗体阻断实验证实是否是IL-8的作用。此外，动物实验证实有效，未必在人体有效。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY人体实验常见的设计类型 病例报告为疾病的发病表现、机理及诊治提供详尽的感性资料。病例报告往往是识别新出现或不常见的疾病或疾病罕见表现的第一线索。 横断面研究包括普查和抽样调查。 病例对照研究回顾病例组暴露因素，通过与对照组进行比较，研究这些暴露因素的发生频率与某疾病之间的关系。(由果到因） 队列研究按照所研究人群是否暴露于某种因素将受试对象分为实验组和对照组，随访观察两组人群某病的发病率，判断暴露因素与疾病发病率的关系。分为前瞻性队列研究(由因到果）和回顾性队列研究。 临床试验临床试验中的受试对象一般采用随机化原则分为治疗组和对照组，观察治疗手段的疗效。*医学科研中，以人体作为受试对象进行临床科研的设计类型众多，依据其研究目大致可分为描述性研究和分析性研究两大类。每一类又可分为不同研究类别：描述性研究包括病例报告、病例分析和横断面研究等；分析性研究包括病例对照研究、队列研究和临床试验等。1．病例报告指通过对某种罕见病例进行记录和描述，为疾病的发病表现、机理及诊治提供详尽的感性资料，从而可能形成某种新的假设。病例报告往往是识别新出现或不常见的疾病或疾病罕见表现的第一线索。许多疾病均通过病例报告而被发现，如艾滋病、军团病、孕妇服用反应停所致新生儿先天畸形、口服避孕药增加静脉血栓栓塞的危险等。2．横断面研究包括普查和抽样调查。普查指对某地区或者某单位所有人员进行全面调查，以了解该地区或该单位某种疾病的发病情况。抽样调查指从被研究人群中随机抽取一部分具有代表性的病例作为研究对象，描述这部分病例的患病情况。3．病例对照研究属回顾性研究的一种方法，回顾病例组暴露因素，通过与对照组暴露因素进行比较，研究这些暴露因素的强度与该疾病之间的关系。如肺癌和非肺癌人群，抽烟和不抽烟的百分比，以及抽烟的根数，判断抽烟人群患肺癌的危险系数是多少，该研究通常是由果到因。4．队列研究按照所研究人群是否暴露于某种因素将受试对象分为实验组和对照组，随访观察两组人群某病的发病率，判断暴露因素与疾病发病率的关系。队列研究可分为前瞻性队列研究和回顾性队列研究，二者的区别在于前者是根据暴露因素进行分组，研究对象是未患所研究疾病的人群；而后者根据结果进行分组，研究对象是患有所研究疾病的人群。该类研究是因到果。如抽烟人群和非抽烟人群其患肺癌的发生率是多少？5．临床试验临床试验中的受试对象一般采用随机化原则分为治疗组和对照组，研究者根据实验目的给予处理因素，并尽量控制非处理因素对实验结果的影响。按照对照组设置方法不同，临床试验可分为随机对照试验、交叉试验、自身前后对照试验、非随机同期对照试验和序贯试验等。研究者可根据实验目的的不同对受试对象进行合理分组。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY动物分类 按微生物学要求，实验动物可分为4个等级：I级：普通动物II级：清洁动物III级：无特殊病原体动物（SPF）IV级：无菌动物（GF） 按照遗传学特性要求，实验动物也可分为4类：I类：近交系或称为纯系动物II类：突变系动物，包括转基因动物和基因敲除动物III类：远交系动物，又称封闭群IV类：杂交群或称异系杂交*按微生物学要求，实验动物可分为4个等级：①I级，即普通动物，是微生物控制要求中级别最低的动物，可用于教学示教及预实验，但须不存在可能传染给人类的各种疾病，如皮肤真菌、寄生虫、结核杆菌等；②II级，即清洁动物，用于开展一般动物实验，其除不带有普通动物应排除的病原体外，还应不携带可能危害动物和干扰科学实验结果的病原体，如流行性腹泻病毒、丝虫病、球虫病、蠕虫（除蛔虫外）病等；③III级，即无特殊病原体动物（specialpathogen-freeanimals,SPF），动物为剖宫产或子宫切除产，均按纯系要求进行繁殖，在隔离环境下饲养，动物体内无致病菌，此类动物是目前国际公认的标准级别实验动物，适用于所有科研实验；④IV级，即无菌动物（germ-freeanimals,GF）和悉生动物，前者指在全封闭条件下饲养的纯系动物，采用当前手段无法检出任何病原体。后者又称已知菌动物，指用与无菌动物相同的方法饲养，但明确体内所给予的已知微生物的动物，一般将1～3种已知微生物植入无菌动物体内获得。IV级实验动物一般用于具有特殊目的和要求的实验，如病原研究、宿主与微生物之间关系研究、抗肿瘤研究等。按照遗传学特性要求，实验动物也可分为4类：①I类即近交系或称为纯系，其经20代以上全同胞或亲子交配而成，基因纯合程度达98％以上，故动物个体间在遗传特征上高度一致，对处理因素反应的离散性较小，实验组间可比性强；②II类为突变系动物，指通过基因变异而具有某种遗传缺陷的纯系动物，常用于制备疾病模型（如裸鼠、糖尿病小鼠、侏儒症小鼠等），目前借助转基因技术或基因敲除技术，可制备高表达特定基因或使特定基因缺陷的动物，以观察动物发育及其生理功能改变；③III类为远交系动物，又称封闭群，是通过非近亲交配方式进行繁殖一定代次的实验动物生产群体，如我国昆明种小鼠多为采用随机交配而成的远交系，常用于制备单克隆抗体的BALB/C小鼠也属远交系小鼠，大鼠远交系常用Wistar大鼠和SD大鼠；④IV类为杂交群或称异系杂交，由不同品系间交配而产生。杂交一代动物不仅遗传背景清楚，且由于杂种优势，其适应性强，反应较均一，是使用极为广泛的实验动物。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY*（2）生物医学实验须选用与人的机能、代谢及疾病特点相似的动物，利用实验动物与人类某些相近的特性，通过动物实验对人类疾病的发生、发展及规律进行推断和探索。例如，不同哺乳动物其机体各系统组成、组织结构均存在许多相似点，其生命活动的基本功能具有相近的特性。从进化角度，猩猩和猴与人类最接近，其在解剖学、组织器官功能、白细胞抗原及染色体带型等方面与人类非常相似，故选用这些动物所获实验结果来推测于人具有很强的说服力，但这些动物的研究成本昂贵。（3）实验动物选择中须充分利用不同品种、品系实验动物存在的某些特殊反应，选择解剖、生理特点符合本实验目的要求的实验动物。例如：家兔对体温变化十分敏感，宜选用做发热、解热及致热源检查实验；观察避孕药对排卵影响的实验宜选用兔、猫；以高胆固醇膳食饲喂兔、鸡、猪、狗、猴等动物，均可诱发高脂血症或动脉粥样硬化，而猴和猪的心脏冠状动脉前降支还形成斑块及大片心肌梗死，情况与人更为相似，故动脉粥样硬化实验多选用猪、猴及兔；家犬的胰腺、胃较小，宜用于胰腺摘除术及胃肠道生理的研究；大鼠无胆囊，不会呕吐，故不能用于胆功能观察；狗、猫、猴等动物呕吐反应敏感，适宜用于呕吐实验；对具有雌激素活性的药物进行避孕药效研究，不能选用小鼠与大鼠。同一品种不同品系的动物还存在某些特殊反应，应根据实验目的而选择应用，例如：BALB/c小鼠与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大，对放射线甚为敏感，故常用于制备单克隆抗体；C57BL/6小鼠具有干扰素产量高、对放射物质中等耐受、补体活性高、易诱发免疫耐受等特性，是肿瘤学及免疫学研究的常用品系。此外，某些易感自发性疾病的动物能局部或全部地反映人类相似疾病过程，借助遗传育种可将这类动物培育成疾病模型动物供研究使用，如遗传性高血压大鼠、糖尿病小鼠、自身免疫病小鼠等。还可利用某些特殊缺陷型小鼠，如胸腺缺陷的裸鼠，由于缺乏T细胞，故可接种人肿瘤，用以筛选抗肿瘤药等。因此，欲成功地进行动物实验研究，须扎实地掌握动物学知识。（4）首先选择结构简单且能反映研究指标的动物。进化程度高或结构功能复杂的动物虽其实验结果更易被认可，但由于此类动物对实验条件的控制要求高、价格昂贵等原因，常对实验结果的获得造成难以预料的困难。因此，在能反映实验指标的情况下，宜尽量选用结构功能简单的动物，如被作为模式生物的果蝇，其生活史短（仅12天左右)、饲养简便、染色体数少(只有4对)，同时具有较复杂的生命现象，不仅成为遗传学研究的绝好材料，在抗感染免疫及肿瘤侵袭特性等研究中也具有广泛应用前景。（5）选择适龄实验动物。许多疾病模型的建立对动物年龄有要求，若选择不当，则不能成功建模。例如诱导免疫耐受，一般需使用胎鼠或幼龄鼠；慢性实验或观察动物生长发育，应选择幼龄动物；开展老年医学研究，通常选用代谢和功能反应接近老年的老龄动物。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY 家兔对体温变化十分敏感，宜选用做发热、解热及致热源检查实验。 观察避孕药对排卵影响的实验宜选用兔、猫；对具有雌激素活性的药物进行避孕药效研究，不能选用小鼠与大鼠。 以高胆固醇膳食饲喂兔、鸡、猪、狗、猴等动物，均可诱发高脂血症或动脉粥样硬化，而猴和猪的心脏冠状动脉前降支还形成斑块及大片心肌梗死，情况与人更为相似，故动脉粥样硬化实验多选用猪、猴及兔。 家犬的胰腺、胃较小，宜用于胰腺摘除术及胃肠道生理的研究。 大鼠无胆囊，不会呕吐，故不能用于胆功能观察；狗、猫、猴等动物呕吐反应敏感，适宜用于呕吐实验。 BALB/c小鼠与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大，对放射线甚为敏感，故常用于制备单克隆抗体。 C57BL/6小鼠具有干扰素产量高、对放射物质中等耐受、补体活性高、易诱发免疫耐受等特性，是肿瘤学及免疫学研究的常用品系。 如遗传性高血压大鼠、糖尿病小鼠、自身免疫病小鼠等。 还可利用某些特殊缺陷型小鼠，如胸腺缺陷的裸鼠，由于缺乏T细胞，故可接种人肿瘤，用以筛选抗肿瘤药等。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY细胞 原代细胞：经特殊分离方法从胚胎、组织器官及外周血等初分离的细胞在体外培养。 传代细胞：经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。 细胞株：单细胞大量扩增后形成生物学特性稳定的克隆化细胞群，称为细胞株。包括正常细胞株和肿瘤细胞株。 基因缺陷和转基因细胞株。 悬浮细胞和贴壁细胞。*3．原代细胞、传代细胞、细胞株机体组织细胞来源多样，培养方法各异。经特殊分离方法从胚胎、组织器官及外周血等初分离的细胞在体外培养，该类细胞被称为原代细胞，相应培养技术称为原代培养技术。离体时间越短，原代培养细胞性状与体内相似性越大，故将原代细胞作为受试对象应注意处理因素和作用时间。对原代细胞经进行分散接种的过程称为传代，经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。一般在一代中，细胞倍增3～6次，传代后细胞经历游离期、指数增生期和停止期。细胞接种后2～3天分裂增殖旺盛，称指数增生期，是细胞活力最好的时期，适宜进行各种实验，若条件允许可开展单细胞克隆、纯化。单细胞大量扩增后形成生物学特性稳定的克隆化细胞群，称为细胞株或克隆细胞，此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。悬浮细胞和贴壁细胞：传代的不同、基因转染效率不同、利用这两种细胞的特点做细胞与细胞的相互作用，可排除贴壁细胞的影响。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY用细胞做实验的优缺点 不受机体内环境因素影响，从而避免个体差异，有利于探讨各种物理、化学和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 便于同时从细胞、分子与基因三个水平研究肿瘤细胞的结构、功能及癌变发生机制。 能长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 能快速筛选抗癌药物，适宜进行耐药机制、信号转导的研究。 研究周期较短，经济。缺点： 不能完全反映体内状况，常与体内实验互相验证。 长期培养易改变原有的性状。 易发生支原体感染。优点：第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY细胞库资源 ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，即美国细胞、菌种保藏中心，目前能提供3000余种细胞系、15000余种细菌和噬菌体、2500余种动植物病毒、700余种人癌细胞系。 CascadeBiologics,Inc.：该公司主要产品为人原代细胞，包括正常人皮肤细胞、心血管内皮细胞、角膜上皮细胞、黑色素细胞等。网址：http://www.cascadebio.com 第四军医大学实验动物中心：该中心保存多种肿瘤细胞株。网址：http://www.fmmu.sn.cn/web/anim 武汉大学中国典型培养物保藏中心：是国内较大且保存品种较多的细胞保藏中心。E-mail:cctcc@whu.edu.cn 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库：是国内较大且保存品种较多的细胞保藏中心。网址：http://www.cell.ac.cn/cellbank/homepage.htm 中山医科大学实验动物中心。 中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY分子研究DNA、RNA和蛋白质常用的重要数据库为： 基因数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/） 非编码RNA数据库（http://biobases.ibch.poznan.pl/ncRNA/） 蛋白质数据库（http://www.expasy.ch/spot/或http://www.ebi.ac.uk/swissprot/） 蛋白质组分析数据库（http://www.ebi.ac.uk/proteome/）第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY分子研究 基因与蛋白分子的检测：单个、几个与芯片的检测； 基因多态性研究、SNP、微卫星等 基因组、蛋白组和代谢酶组的变化 基因和蛋白的调控、分子表观遗传学 基因和蛋白的结构 基因和蛋白的关系、蛋白与蛋白的相互作用*基因和蛋白的调控：蛋白的合成、蛋白的修饰、磷酸化和去磷酸化；乙酰化和泛素化表观遗传学是研究没有DNA序列变化并且可以遗传的基因功能变化之学科,就其中的X染色体剂量补偿、DNA甲基化、组蛋白密码、基因组印记等第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY实验效应(experimentaleffect)处理因素作用于受试对象的结果，通过观察指标表达。观察指标应相关联、客观、精确、灵敏、特异。1.客观性：主观指标和客观指标。2.精确性：准确度(accuracy)或真实性（validity）：观察值与真值的接近程度，受系统误差的影响(如灵敏度、特异度)。精密度(precision)或可靠性（reliabiliy）或重复性（repeatability）：重复观察时观察值与其均值的接近程度，受随机误差的影响（如一致百分率、Kappa值）。3.灵敏性和特异性：指标的互补性、可靠性和稳定性（标准化）*（1）实验标本的采集处理与保存：实验过程中标本的采集、处理及保存须严格标准化。如提取组织总RNA时，所采集的新鲜组织应立即处理或置液氮中保存，所使用的实验用品须无RNA酶污染并经高压灭菌。（2）指标的检测方法应标准化：实验过程中，要保证实验仪器、实验方法和所用试剂固定不变，尽量减少其对实验结果的干扰。尤其是对同一实验指标进行重复验证时，若采用不同实验方法，实验结果往往出现显著性差别。例如，临床血小板计数试验中，若检测标本采用不同抗凝剂，则可能因抗凝剂促血小板聚集程度的不同而影响实验结果。（3）多种检测指标相互补充：医学科研中，由于单一指标的局限性，往往难以全部体现处理因素的作用效应，而须选用不同检测指标，以相互验证和互为补充。例如，临床上采用多项指标判断肝功能。但强调多指标联合检测并非意味所选择的检测指标越多越好，应根据实验目的，按照指标选择的基本原则确定合理的实验指标。如检测凋亡，AnexinV与PI，有时不能分清凋亡与坏死，可检测Caspase活化或DNAladder,相互验证。（4）检测指标的可靠性和稳定性：确定检测指标后，实验过程中须对该指标进行多次重复检测，以保证指标的可靠性和稳定性。临床试验进行新药疗效评价时，也须确定剂量与效应间的关系。根据研究目的不同，在最小有效剂量与最大安全剂量范围内，剂量选择也应有所不同。若实验的目的是为研究影响药物作用的因素，一般应选用半数有效量，因为在这个水平药效曲线的斜率最大，可灵敏反映出所研究因素对药效的影响；若进行药效筛选实验，应选择最大安全剂量，通常采用半数致死量的1/10左右；但若进行药物毒性检测，则应选择超过最大安全量的不同剂量，以确定半数致死量和最大致死量。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY科研设计 概论 医学科研的基本要素 科研设计的基本原则 科研设计的基本步骤 统计学设计第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY试验设计的原则 对照的原则：　-意义：消除系统误差，鉴别处理和非处理因素的差异　-类型：空白对照、阳性对照、阴性对照、自身对照、相互对照 随机的原则：　-对照组和处理组除处理因素不同外，其余应全部相同。　-动物实验随机分组；观察切片也应随机选择视野 重复的原则：　-随机原则可排除大部分非处理因素的影响，但不能全部消除；因此，有必要重复，以反映客观真实性。　-表现为一定的试验样本数（人、动物、细胞株）*阳性对照：已知某因素可诱导某种效应，如TNF杀伤效应；阴性对照：如做免疫组化或间接荧光，必须做阴性对照，排除二抗的非特异性效应自身对照：用药前后相互对照：几种不同的药相互比较疗效，但必须定同一比较因素，否则不可比。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照(control)的原则对照的意义：①区分处理因素与非处理因素的效应，是比较的必要基础②消除和减少实验误差处理组：对照组：比较结果第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY直接凝集和间接凝集试验 诊断血吸虫、RA、钩端螺旋体阳性对照和阴性对照可监控方法的正确性和特异性*间接凝集：将可溶性抗原吸附在与免疫无关载体（RBC或乳胶颗粒）诊断血吸虫、RA、钩端螺旋体第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照的形式㈠空白对照(blankcontrol)：对照组不加任何处理因素。例如：试剂空白、血样空白、无酶解空白、底物空白等。包括：空白对照、实验对照、标准对照、自身对照、相互对照、历史对照第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照的形式实验对照(experimentalcontrol)：施加每一因素均需设置对照+非处理因素对照（安慰剂对照）。含赖氨酸面包+非处理因素→赖氨酸效应+面包效应+非处理因素效应面包+非处理因素→面包效应+非处理因素效应赖氨酸赖氨酸效应非处理因素→+非处理因素效应第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照的形式标准对照(standardcontrol)：以现有的标准或正常值作对照。例①某种新的方法能否代替传统方法的研究；②某病患者与正常人的某生理、生化指标是否相同。—— 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 应用较多第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照的形式自身对照：实验在同一受试对象上进行特点：简单易行，使用广泛。但若试验前后某些环境或自身因素发生改变，并且会影响试验结果，就难以说明问题。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照的形式相互对照：几个实验组互相对照例如：比较几种药物治疗同一疾病的疗效常用半数有效量、半数致死量比较几种药物之间的效应和毒性。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照的形式历史对照：以过去的研究结果作对照。与本人或他人过去的研究结果作比较——不好！！！！！！随时间改变，细胞变化，气候变化，等多种非处理因素的影响*第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对照设置方法 配对对照法：节省样本数，抽样误差最小，统计效率最高自体配对：指在同一个体处理前后或不同部位作为对照组和处理组，比较两组间差异。异体配对：选择同窝，性别、体重一致的动物，或相同疾病、性别、年龄、病情等相当的病人配对，在每个对子内部随机分至对照组和实验组，比较两组间差异。 组间对照法：组间对照是将条件基本一致的不同个体随机分组，分别接受对照处理与实验处理，比较两组或几组间差异。 交叉对照法：即先接受对照处理的个体随后接受试验处理，先接受试验处理的个体随后接受对照处理，通过交叉而减少个体差异。*1．配对对照法　配对对照包括同源配对与异体配对两种，其可节省样本数，故有条件时应优先选用。配对对照的抽样误差最小，其统计学效率最高。（1）自体配对：指在同一个体比较处理前后不同时间结果的差异，或同一个体左右两部位或器官(如眼睛、肢体)分别作为对照组和处理组，比较两组间差异。由于是在同一个体进行试验，个体差异为零，可最大限度减少个体抽样误差。但对有短期自愈倾向(如感冒)或有周期性发作倾向的疾病，则不可采用同一个体处理前后对照比较，否则会将疾病自愈或周期性发作误为处理的效果。（2）异体配对：选择同窝，性别、体重一致的动物，或相同疾病、性别、年龄、病情等相当的病人配对，在每个对子内部随机分至对照组和实验组，比较两组间差异。由于所有研究对象均通过细致配对，较组间对照法的抽样误差小。若研究对象为人，最理想的异体配对是选用同卵双胎者；若为小鼠，最好选择纯系小鼠。上述两种情况下，配对的组别间遗传基因完全相同，生活环境一致，不同个体从外表到体内代谢、甚至对疾病易感性都基本相同，药物代谢动力学表现也相差无几，甚至可视为同一个体的配对分组。2．组间对照法　组间对照是将条件基本一致的不同个体随机分组，分别接受对照处理与实验处理，比较两组或几组间差异。因各组间同时进行，又称为平行对照，适用于不能应用配对对照的情况。其缺点是：由于存在个体差异，尽管所选定的受试对象基本条件一致，仍然存在抽样误差，此法得到统计学显著性所需样本数较多。3．交叉对照法　即先接受对照处理的个体随后接受试验处理，先接受试验处理的个体随后接受对照处理，通过交叉而减少个体差异。交叉法适合于实验对照，不宜设置空白对照。用同一批动物或人做两种甚至两种以上处理，适合比较短期作用的药物，且两次用药须间隔足够时间(洗脱期)，以避免前一阶段的处理效应影响后一阶段。病情等条件须基本不变，否则即失去可比性。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY试验设计的原则 对照的原则：　-意义：消除系统误差，鉴别处理和非处理因素的差异　-类型：空白对照、阳性对照、阴性对照、自身对照、相互对照 随机的原则：　-对照组和处理组除处理因素不同外，其余应全部相同。　-动物实验随机分组；观察切片也应随机选择视野 重复的原则：　-随机原则可排除大部分非处理因素的影响，但不能全部消除；因此，有必要重复，以反映客观真实性。　-表现为一定的试验样本数（人、动物、细胞株）*阳性对照：已知某因素可诱导某种效应，如TNF杀伤效应；阴性对照：如做免疫组化或间接荧光，必须做阴性对照，排除二抗的非特异性效应自身对照：用药前后相互对照：几种不同的药相互比较疗效，但必须定同一比较因素，否则不可比。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY随机化(randomization)分组的原则随机化原则：随机≠“随便”,指每个受试对象以机会均等的原则随机地分配到试验组和对照组。目的是使各组非实验因素的条件均衡一致，以消除对实验结果的影响。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY随机化分组方法1. 抽签等2.随机数字表3. 计算器或计算机第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY随机数字表分组例试将10头动物应用随机数字表分配到甲、乙两组。⑴按动物体重编号⑵从随机表的第21行，第21列往上查10个随机数⑶规定双号为甲组，单号为乙组⑷调整：再接着查一个“6”以内的随机数，以决定甲组中哪一号拨到乙组。本例查得随机数为4，将甲组第4个（5号）调到乙组。 动物编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 随机数字 6 9 2 6 4 7 2 9 9 8 组别 甲 乙 甲 甲 甲 乙 甲 乙 乙 甲第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY计算(器)机随机化分组例用电脑产生随机数将10头动物随机分到甲、乙两组（1）动物编号（2）产生随机数（3）事先规定随机数者小为甲组，大者为乙组（4）按随机数排序，分组 编号 7 2 10 1 8 3 9 5 4 6 随机数 0.01 0.10 0.14 0.38 0.41 0.60 0.86 0.88 0.90 0.96 分组 甲组 甲组 甲组 甲组 甲组 乙组 乙组 乙组 乙组 乙组第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY试验设计的原则 对照的原则：　-意义：消除系统误差，鉴别处理和非处理因素的差异　-类型：空白对照、阳性对照、阴性对照、自身对照、相互对照 随机的原则：　-对照组和处理组除处理因素不同外，其余应全部相同。　-动物实验随机分组；观察切片也应随机选择视野 重复的原则：　-随机原则可排除大部分非处理因素的影响，但不能全部消除；因此，有必要重复，以排除偶然因素的影响。　-表现为一定的试验样本数（人、动物、细胞株）*通过对照和随机原则，能在很大程度上抵销非特异性因素对试验结果所造成的偏性，但还不能完全消除其影响。因此，重复又是一个很重要的原则。因为在实验过程中，很难排除偶然因素的影响。例如：苏格兰外科医生亨特（JohnHunter）故意让自己染上淋病，以观察淋病是否是一种与梅毒有显著区别的疾病。但是，他用以接种的物质同时含有梅毒菌，以至他感染了两种疾病,从而长时间内形成一种错误概念：二者都是同一疾病的表象。此乃偶然因素影响实验结果的典型例子，要避免类似错误的发生，须独立地重复相同的实验，以排除偶然因素的影响。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY重复的原则重复(replication)是指各处理组与对照组要有一定样本含量(samplesizes)。无限地增加样本含量，将加大实验规模，延长实验时间，浪费人力物力，反而增加系统误差出现的可能性。样本含量不足，检验效能（Power，1－β）偏低，导致总体中本来具有的差异无法检验出来。*通过对照和随机原则，能在很大程度上抵销非特异性因素对试验结果所造成的偏性，但还不能完全消除其影响。因此，重复又是一个很重要的原则。因为在实验过程中，很难排除偶然因素的影响。例如：苏格兰外科医生亨特（JohnHunter）故意让自己染上淋病，以观察淋病是否是一种与梅毒有显著区别的疾病。但是，他用以接种的物质同时含有梅毒菌，以至他感染了两种疾病,从而长时间内形成一种错误概念：二者都是同一疾病的表象。此乃偶然因素影响实验结果的典型例子，要避免类似错误的发生，须独立地重复相同的实验，以排除偶然因素的影响。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY科研设计 概论 医学科研的基本要素 科研设计的基本原则 科研设计的基本步骤 统计学设计第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY　　　最有成就的实验家常常是这样的人：他们事先对课题加以周密思考，并将课题分成若干关键的问题，然后，精心设计为这些问题提供答案的实验．第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY实验设计步骤 研究目标 主要实验内容 实验路线的设计 实验方案的设计第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY 确定研究目标：即该课题解决的科学问题　-不要定的目标太大：如解决肿瘤治疗问题　-不要定的目标太多：最多2-3个目标。一个课题最好集中解决某个问题（总目标），如TNF在内毒素性休克中的作用　-不要定不可达到的目标 主要研究内容：善于把要解决的问题分支成若干小的问题，从不同角度进行研究。　如研究某因素杀瘤作用：杀伤肿瘤谱、杀伤效率、诱导死亡方式，体内外试验、杀伤机制等。　*研究中胰岛素中枢抵抗第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY 研究路线的设计：根据研究内容不同而不同：　－对某基因表达的研究：mRNA、蛋白表达、定位及功能　－基因调控：EMSA、报告基因等　－新基因的研究：差显表达、RACE、基因克隆、蛋白表达、功能研究　－蛋白组研究：二维电泳、资料比对、消化、酶解、质谱 实验方案： 　－试验对象（包括试验模型）：人、动物、细胞、分子等 　－处理因素：高糖、LPS、激素、细胞因子等；单因素　多水平、多因素单水平、多因素多水平 　－检测指标：关联性、客观性、灵敏性、精确性、稳定性 　*动物：基因背景、是否易患某病；转基因或敲基因动物细胞：原代细胞、细胞系（了解某种细胞的表型、特征，适应做何种实验等）例如：澳洲西部出现一种羊群的神经性疾病，原因多年不明。根据某种理由，H.W.Bennetts怀疑该病乃铅中毒所致。为证实该假说，他根据专业知识设计用抗铅毒剂（氯化铵）治疗羊群。第一次试验效果很好，但后来却不能被重复。他意识到可能第一次所用氯化铵中可能混有少量物质是羊缺乏的，根据这一线索他很快发现该病是由缺铜所致。然后，再用统计设计处理分组、样本含量、检测指标数据的收集方法和统计学处理方法、设计实验观察表格等。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY　　　尼科尔属于那种在制定实验方案之前周密考虑，精心构思，从而取得成功的人．他绝不象第二流人物，做那种心思来潮而常常是考虑不周的实验，自己急得如热锅蚂蚁。…相对来说，尼科尔做的实验很少，很简单。但是，他做的每一个实验都是长时间智力孕育的结果，要考虑到一切可能的因素，并要在最后的实验中加以检验。然后，他单刀直入，不做虚功。这就是巴斯德的方法，也是我们这个职业中所有伟大人物的方法。他们简单的、结论明确的实验，对于那些能够欣赏的人来说，是一种莫大的精神享受。　　－津泽（美国细菌学家）*尼科尔是法国大细菌学家第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY试验设计方案 简述Fas和FasL的作用。请设计一个实验方案，说明肿瘤细胞表达FasL后，可逃避免疫系统的攻击。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY*CAD:caspase-activatableDnase,I-CAD:Inhibitor第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITYTumorcellsinduceapoptosisinTlymphocytesviaFASactivation CancercellsexpressFASligand BindtoFASreceptoronTlymphocytesleadingtoapoptosis肿瘤细胞表达FasL后，可逃避免疫系统的攻击。*Tumorcellscanactivatemacrophage,neutrophilandDCtoreleasecytokinesandchemokinesinducinginflammation.第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY 实验目的：表达FasL的肿瘤细胞可逃避免疫攻击 实验内容：　－肿瘤细胞是否表达FasL　－肿瘤细胞对活化的淋巴细胞是否具有杀伤作用　－体内实验观察表达和不表达FasL的肿瘤细胞的致瘤率 实验方案：　－FACS:检测肿瘤细胞是否表达FasL－凋亡检测：肿瘤细胞对活化的淋巴细胞是否具有杀伤作用（活化淋巴细胞、肿瘤细胞＋活化淋巴细胞、肿瘤细胞＋非活化淋巴细胞、肿瘤细胞＋活化淋巴细胞＋抗FasL抗体） 体内实验　第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY课题申请书（开题报告）的撰写第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY课题设计书的撰写 对课题评价的标准 立论依据 研究目的与研究内容 研究路线和研究方案 项目的创新性和特色 研究的前期工作 研究团队和研究条件第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY国家自然科学基金的资助方向 基础理论研究2.应用基础研究以实验医学为基础的第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY国家自然科学基金的主要种类常规基金： 面上项目（青年基金和地区基金） 重点项目 重大项目 杰出青年基金特殊基金： 主任基金 专项基金 创新群体基金 合作基金（海外，港澳） 第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY国家自然科学基金的评审程序初审（函审）评审专家1评审专家2评审专家5评审专家3评审专家4终审（会审）选择超出拟批准项目120-130%的预选项目进行评审学部批准第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY 申请人是否具有科研能力？ 课题是否有科学意义、创新性和可行性？ 是否具备研究条件？课题评审者主要考虑的问题第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY课题设计书的撰写 对课题评价的标准 立论依据 研究目的与研究内容 研究路线和研究方案 项目的创新性和特色 研究的前期工作 研究团队和研究条件第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY 所研究的是重要领域的重要问题 具有重要的理论价值或应用前景课题研究的意义第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY科学性研究的背景：国内外目前的研究现状；包括自己前期实验结果与数据存在的问题：提出研究的切入点与假说研究设想：研究目标及思路*研究背景包括自己直接相关的工作及实验数据。第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY对国内外研究现状的了解 广度和深度：近5年的主要研究进展 研究中存在的主要问题 参考文献： 国外文献 近5年 数量：20-30 杂志等级第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY学术思想及创新性 理论创新：新学说或理论 方法创新：新方法 技术创新：技术改进或完善第四军医大学FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY立项依据（2-2.5张） 该研究项目的重要性：2-3行即可常见问题：写得太多！ 介绍在这个领域的国内外进展，包括自己的工作，并引用自己发表的SCI文献（注意围绕主题）常见问题：写得太多/太少、重点不突出、介绍与主题无关的进展 凝练科学问题，提出假说（创新性、科学性及实用性）常见问题：不知道问题在哪儿？或提与主题无关的问题根据自己前期工作（最好已发表SCI文章）提出假说常见问题：没有形成假说、无逻辑性 简介本项目拟开展的工作、思路及意义常见问题：不写*1．项目的重要性概述所申请项目的科学意义或应用价值，尤其是研究与国民经济发展相关的重要问题，与危害人类健康的重大疾病的相关问题，体现该项目研究的问题属于重要领域的重要问题，并简要说明本研究的重要价值及研究的发展趋势，是否属学科的基本理论与应用问题，如重大疾病的发病机制、诊断、治疗与预防等。2．项目相关国内外进展确定项目题目后，首先须全面检索相关的文献资料，遗漏重要文献资料可能导致项目申请的前功尽弃。充分掌握文献资料不仅可避免重复性研究，更能开阔眼界，准确把握研究方向。文献资料的掌握非一日之功，应培养长期阅读本专业文献的习惯，分别进行精读或泛读。专业杂志内容如浩瀚的海洋，研究团队可坚持定期进行JournalClub或文献报告，分工阅读、集中报告相关权威杂志的最新进展，从而在有限时间内掌握最大量信息。切忌偶尔查到若干篇新论文，遂依此为模板，成段直译，作为所谓“国内外进展”。阐述国内外进展，须把握“项目相关”的精髓，围绕拟开展的研究项目介绍国内外相关研究，区分哪些属成熟的研究结果，哪些尚未经时间检验，哪些仅是推测。推测并非事实，一般不用于作为立项依据。若国外尚无相关研究报道，或虽然有研究，但有待在某个层面进一步深入，或引申出一系列有价值的问题进行探讨，这些均