[精品]《天然药物化学实验讲义》

[精品]《天然药物化学实验讲义》 华北煤炭医学院药学系 吴少杰 编 生药与天然药物化学教研室 2006年12月 目 录 实验须知………………………………………………………………………………1 实验一 薄层板的制备、活度测定及应用…………………………………………2 天然药物化学成份预试验…………………………………………………5 实验二 实验三 辣椒红色素的分离…………………………………………………………8 实验四 茶叶中咖啡因的提取与分离……………………………………………10 实验五 粉防己生物碱的提取分离与鉴定………………………………………12 实验六 大黄中大黄素的提取、分离和鉴定………………………………………16 实验七 槐花米中芦丁的提取、分离和鉴定……………………………………19 实验八 从洋金花中提取分离东莨菪碱和莨菪碱………………………………24 实验九 丹皮酚的提取、分离和制剂鉴别………………………………………27 附录一 常用试剂及配制 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ……………………………………………………30 附录二 各类天然成分的鉴别方法………………………………………………34 实验须知 天然药物化学实验教学是天然药物化学课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和检定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力。养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。 天然药物化学实验课实验周期长、使用有机溶剂品种多，用量较大，所用的药品多数是挥发性、易燃、有腐蚀性、刺激性，实验操作经常在加温、减压下进行，需要使用各种热源和电器，再加上实验室较为拥挤，若操作不慎，易引起着火、触电、中毒、爆炸等事故，为确保实验安全顺利进行，特作如下要求: 1(遵守实验室 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 ，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。 2(实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ，争取准时结束。实验开始前应检查仪器是否完整，装置是否正确，检查合格后方可开始实验。实验过程应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录。 3(实验室中保持安静，穿戴整齐。不许大声喧嚷，不许抽烟、吃东西，实验课不迟到、实验进行时不得擅自离开。 4(实验时要做到整齐、清洁、节约用水、用电、药用试剂。用过的仪器要及时清洗并收入仪器柜内，保持水、仪器、桌面、地面四洁。公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。严格药品用量。废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。 5(不得擅自使用明火，需使用明火时，实验台周围不得放置易燃有机溶剂，如发生火情应保持镇静，立即报告指导教师同时切断火源，移走易燃品，用湿布闷盖或用灭火器进行灭火，切勿轻易用水，以免扩大火势。 6(回流、蒸馏有机溶剂时，注意检查冷凝水是否通畅，装置不得密闭，接收有机溶剂时不得使用广口仪器，溶剂瓶不得敝口存放。在进行减压操作时，必须使用安全瓶，弄清操作程序，以免造成回水等事故。 7(使用电器设备(如水浴锅、紫外灯、旋转蒸发仪、循环水泵等)一定要按操作规程进行，不得在烘箱内干燥带有易燃性有机溶剂的仪器或物品，仪器发生故障时及时报告指导教师，不得擅自拆卸。 8(使用挥发性试剂或喷显色剂时，应在窗口或通风橱内操作，不慎溅在桌面上的化学药品必须立即清除。身体直接接触化学物品后应及时用肥皂及大量水冲洗，如碱性试剂可用1%HAc溶液冲洗，酸性试剂可用3%NaHCO3溶液冲洗。不要用酒精、丙酮等洗涤皮肤上的有机物，以免增加皮肤对有毒物质的吸收，眼睛内溅入化学试剂后，应立即用大量水冲洗，及时到校医室就诊。 9(实验完毕后，每次实验结果后的产品，应妥善包装好，贴上标签(写明实验人、日期、样品名称、纯度、mp、bp、TLC、重量等)。放入干燥器内保存，不得随意丢失。课后认真总结，按时完成实验报告。 10(采取学生轮流值日，每次实验完毕，值日生负责整理公用仪器、药品，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，查看水、电和门窗是否关闭，经教师检查后方可离去。 1 实验一 薄层板的制备、活度测定及应用 实验目的 1(掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法 2(了解吸附剂活度测定的原理及方法 实验方法 一、薄层板的制备 1(不加粘合剂的薄层涂布法 (1)氧化铝薄层 将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑，直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为0.3~1mm的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。 (2)纤维素薄层 一般取纤维素粉1份加水约5份，在烧杯中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于100?2?干燥30~60分钟即得。 (3)聚酰胺薄层 取锦纶丝(无色干净废丝即可)用乙醇加热浸泡2~3次，除去腊质等。称取洗净的锦纶丝1克，加85%甲酸ml，在水浴上加热使溶，再加70%乙醇6ml。继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的，用清洁液洗净的玻璃片上，并自然向周围推匀，厚度约0.3mm，薄层太厚时，干后会裂开。将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上，使盘中的水蒸汽能熏湿薄层，盘子加玻璃板盖严密，薄板放置约1小时完全固化变不透明白色，再放数小时后，泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中0?恒温加热活化15分钟，冷后置干燥器中贮存备用。 2(加粘合剂薄层的涂布法 (1)硅胶G薄层 取硅胶G或硅胶GF一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中，推动涂布)，均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100?活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。 (2)硅胶(H)羧甲基纤维钠(CMC-Na)薄层 取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用硅胶(颗粒度10~40μm的约6~8g)。激光照排系统混成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，或取0.8%羧甲基纤维纳10ml，倒入广口瓶(高约10~12cm)中，然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克，不断振摇成均匀的稀糊，把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上， 2 让其自然阴干，100?下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。 氧化铝薄层，氧化铝羧甲基纤维钠薄层的制备方法同上，一般所需要氧化铝比硅胶稍多。目前国内外市场有预先制好的薄层板，底板用玻璃、塑料、铝片等。可按需要用玻璃刀划割，也有用剪刀剪成所要的大小，使用方便，价格贵些。 3(特殊薄层的制备 根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。 (1)酸、碱薄层和pH缓冲薄层 为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液(如0.1~0.5N草酸溶液)代替水制成酸性氧化铅薄层使用，硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液(如0.1~0.5N氢氧化钠溶液)代替水制成碱性的硅胶薄层。当用醋酸钠、磷酸盐等不同pH的缓冲液代替水铺层，制成一定pH缓冲的薄层。 羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5~1%浓度，宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。常用0.8%浓度。CMC-Na系中粘度。300~500厘泊(粘度单位)。CMC-Na系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。活化温度不应过高，防止碳化。 (2)络合薄层 硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105?活化半小时后避光贮存，制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。 二、吸附剂的活度测定 1(氧化铝活度的测定 一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。 染料试剂的配制:取偶氮苯(Azobenzene)50mg，对甲氧基偶氮苯(P-Methoxyuzobenzene),苏丹黄(Sudan I, Benzeneazo-β-naphthol)，苏丹红(Sudan ? Tetrazobenzol-β-naphthol)，对氨基偶氮苯(P-Aminoazobenzene)各20mg，分别溶于50ml重蒸馏的四氯化碳(经氢氧化钠干燥)中。 常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3 cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点，各吸取约0.02ml染料试剂分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40?之间，展开后测出各斑点的Rf值，从表1确定氧化铝的活度(一般高活性氧化铝?~?级活度使用本法时，结果往往偏低)。 表1 氧化铝活度与偶氮染料外值关系 氧化铝活度级Rf值 偶氮染料 二级 三级 四级 五级 偶氮苯 0.59 0.72 0.85 0.95 对甲氧基偶氮苯 0.16 0.45 0.69 0.89 苏丹黄 0.02 0.25 0.87 0.98 苏丹红 0.00 0.10 0.35 0.50 对氨基偶氮苯 0.00 0.05 0.08 0.19 另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出， 3 按上述方法测定活度。观察有无变化。 2(硅胶活度的测定 一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。 欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄(Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene)。苏丹红(Sudan ?)，靛酚蓝(Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline)的苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm(约20分钟)，三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。 国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标 G是Gypsum石膏的缩写。表示加了石膏)，硅胶H(H明的意思是:硅胶G( 表示不加石膏)，硅胶GF254(F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰)。硅胶GF365(表示加石膏和波长365nm显黄色荧光的硫化锌镉)。氧化铝则类推。 四、薄层层析的应用 薄层层析法在天然药物化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。 例一:湖北贝母生物碱成分的TLC检识 吸附剂:硅胶CMC- Na薄层 样品:湖北贝母总生物碱氯仿溶液 展开剂:C6H5-EtoAc-NHEt2(6:4:1) 显色剂:改良碘化铋钾喷雾 例二:丹参色素的TLC检识 吸附剂:硅胶G-CMc-Na板 样品:丹参乙醚提取液 展开剂:石油醚-醋酸乙酯(9:1) 记录TLC结果 4 实验二 天然药物化学成份预试验 (共4学时) 实验目的 一、熟悉各类天然药物化学成分的理化性质 二、掌握天然药物化学成分的鉴别方法 三、了解各种不同的中药材所含的主要化学成分 设备与材料 中药材粉末、各种检测试剂、水浴槽、回流装置、抽滤装置、蒸发皿、试管等。 实验项目 中药中所含的化学成分种类很多，因此在研究一种中草药的有效成分，首先应大致知道其中含有哪些类型的化学成分，如生物碱、皂苷、黄酮类等。一般可先进行简单的预试验，以便对今后的提取分离工作提供一定的参考。预试验的方法一般可分为两大类:一类是根据研究的需要，重点检查某类成分，进行单项预试验，例如需要寻找含生物碱类成分，仅需进行生物碱的定性反应，以检查生物碱的存在与否;另一类是系统试验法，即选用简单的定性方法对中草药中各类成分进行较为全面的试验。 预试验室采用中草药初步提取、分离后加入检出各类化学成分的试剂，观察反应现象以判定结果。 由于植物提取液颜色大多较深，各种检出反应的颜色变化在试管内观察时难以判明正或负反应、有些定性反应常为几类成分所共有，有时又可由于成分间的相互干扰或由于定性反应本身的局限性(如反应的灵敏度较差等)等原因，所以预试验的结果只能作为参考，尚需进行薄层或纸层析，将各类成分展开后，再喷定性的显色剂加以判断，灵敏度可进一步提高。 一、试液的制备预试验项目 1、水浸液:取中草药粗粉5g，加水50ml，在50-60?的水浴上加热1小时后，抽滤得滤液，做以下实验: 苷或多糖 有机酸 酚类 鞣质 氨基酸 蛋白质 皂苷 生物碱 糖 酚醛缩pH滤纸茚三酮双缩脲酚醛缩泡沫试碘化铋1.1% 1.1% FeCl FeCl 合反应 检验 试剂 反应 合反应 验 钾试剂 33 试剂或费林试溴甲酚明胶试硅钨酸 6N盐酸 反应 剂 绿试剂 验 试剂 林氏试 剂 2、乙醇提取液:取中菜肴粗粉10g，加5-12倍量的95%乙醇，在水域上加热回流提取1小时，过滤得滤液(如果原料含有很多叶绿素，可将乙醇滤液加水稀释成70%的浓度，摇匀后倒入分液漏斗中，加少量石油迷或汽油震荡，使叶绿素转到上层石油醚中，分出70%乙醇液)。滤液留2ml作(1)项试验，其余回收乙醇至无醇味，并浓缩成浸膏状，浸膏分为二部分，加少量2%HCl溶解，溶液作(3)项实验，烧瓶内的一部分再以少量乙酸乙脂溶解，溶液置分液漏斗加适量 5 5%NaOH振摇，使酚性物质及有机酸等转入NaOH水溶液中，剩下的乙酸乙脂为中性部分，用蒸馏水洗去碱性即可备用，将乙酸乙脂液2-3ml在水浴上蒸干，以1-2ml乙醇溶解作(1)项实验。 (1)项实验 检查项目 酚类 糅质 有机酸 试剂名称 1%FeCl 1%FeCl 溴甲酚绿试剂 33 (2)项实验 检查项目 生物碱 碘化铋钾试剂 试 硅钨酸试剂 剂 名 糅酸试剂 称 苦味酸试剂 (3)项实验 检查项目 黄酮 蒽醌 1.1% AlCl 10%KOH 3试 剂 盐酸镁粉反应试剂 0.5%Mg(Ac)试剂 名 称 氨气 (4)项实验 检查项目 香豆素与萜类内酯 强心苷 开环与闭环反应试剂 Kedde试剂 试 剂 氨基安替比林-铁氰化钾 三氯醋酸试剂 名 称 羟氨反应试剂 苦味酸试剂 3、石油醚提取液:取中草药粗粉1克，加10ml石油醚(沸程60-90?)，放置2-3小时，过滤，滤液静置表面皿上任其挥发，残留物做下述实验: 检查项目 甾体或三萜类 挥发油和油脂 试 醋酐-浓硫酸实验 剂 石油醚提取液滴于滤纸片上，观察 名 有无油斑并在加热后能否挥发 25%磷钼酸试剂 称 二、圆形滤纸层析预试法 取一张圆形滤纸，在距离圆心1.0-1.5cm周围用毛细管加样品。一张滤纸可同时点8-10个样品，待溶液挥发后，在滤纸中心穿入一纸芯，然后放在培养皿中，使纸芯与展开剂接触，滤纸上面再覆盖另一培养皿，进行层析。当溶剂前沿接近培养皿边缘时，取出滤纸，挥干溶剂，将滤纸各层析带剪开，各纸片喷上不同的显色剂，根据滤纸上出现的颜色斑点来确定样品的成分。 展开剂:先以甲醇或95%乙醇为展开剂，展开后喷以显色剂，如发现有生物碱、黄酮类、皂苷等化合物的存在，可用长滤纸重新点样，分别用以下几种专用展开剂展开并显色，以确认这些化学物的存在。 6 专用展开剂: 1、生物碱:氯仿-甲醇(96:4) 2、黄酮类化合物:15%的乙酸 3、皂苷、强心苷和糖类:正丁醇-乙酸-水(4:1:1) 4、其它化合物:苯-无水乙醇(8:2) 显色剂: 常用的显色剂如下表: 酯类、香检查 甾体和蒽醌及生物碱 酚类 有机酸 豆素及黄酮类 强心苷 氨基酸 项目 三萜 其苷 其苷 碘化铋2%铁氰0.1%溴5%磷钼异羟钨紫外(荧氨气熏 先喷2%0.2%茚 钾试剂 化钾与酚兰试酸乙醇蒜铁试光)，再二硝基苯三酮醇 2%FeCl剂 溶液 剂 喷加酸乙醇溶液 3 等量混1%AlCl溶液，再3 合 显色剂喷 (荧光增4%NaOH 强与否) 乙醇溶液 显 5%KOH 盐酸乙1%硫酸氨气熏 色 醇 铈试剂 剂 3% FeCl 1%乙酸3乙醇溶镁甲醇 液 溶液 1%乙酸 镁甲醇 溶液 思考题 1、中药材的水提液、醇提液和石油醚提取液可能提取出何类成分, 2、如何提高中草药化学成分与实验的检测灵敏度, 7 实验三 辣椒红色素的分离 (共4学时) 红辣椒是辣椒Capsicum annum的成熟果实，含有几种色泽鲜艳的色素，主要为红色素。在红辣椒色素的薄层色谱中，可观察到一个大的鲜红色的斑点。红辣椒的深红色主要由此色素产生。研究结果证实这种红色素由辣椒红的脂肪酸酯组成。 实验目的 1、掌握薄层色谱板、色谱柱的制作及用以分离天然化合物的技术; 2、了解红辣椒所含色素的性质; 3、熟悉柱色谱的操作。 设备与材料 红辣椒粉，二氯甲烷，柱层析用硅胶，薄层层析用硅胶，色谱柱(2×20cm)，TLC层析板、层析槽，棉花，磁蒸皿，等。 实验方法 提取 称取红辣粉0.5g放入25ml或50ml圆底烧瓶中，加2粒沸石，加10mlCHCl，22回流20分钟，放至室温，过滤，得滤液，备用。 柱色谱分离红色素 1〉装柱:取色谱柱洗净，干燥，放一小块脱脂棉在基底部，然后慢慢加入层析硅胶10克，同时用一段木条轻轻敲柱，以利于硅胶均匀沉降，至硅胶顶面不再下降为止，装柱完毕。这是干法装柱的一种方法。此外还有湿法装柱。 2〉拌样:取一洗净、干燥的磁蒸皿称重，然后在磁蒸皿中放入0.2克层析硅胶，将此装有硅胶的磁蒸皿置于水浴上，同时滴入辣椒色素提取液拌匀，挥干溶剂至磁蒸皿恒重。 3〉上样:将样品轻轻放在柱顶(注意不能破坏柱顶面)，敲打色谱柱至样品带厚薄均匀，表面平滑，然后再在样品带上轻轻铺一层白硅胶及一块脱脂棉，以保护样品带。 4〉色谱分离:缓缓倒入CHCl(或氯仿)约10 ml进行洗脱，洗脱剂展至柱底22 即停止层析。可见硅胶柱上呈现两条明显的色带。将两色带分别挖出，用CHCl22分别洗脱，即得红色素。 红色素的鉴定 1〉薄层色谱鉴定:用毛细管将滤液点于色谱板上(注意斑点直径不得大于0.3crn)，薄层板斜放于盛有少量展开剂(CHCl)的层析槽内(注意点样斑点)。 22 不要浸在展开剂中)，盖上盖子后开展层析，待展开剂行至薄层板顶端时，取出、立即划出溶剂前沿线，记录各斑点颜色，计算Rf值，(辣椒红Rf值约为0.6)。 操作要点 8 1〉装柱过程不能间断，装好的色谱柱不应有气泡、裂痕。 2〉吸附剂的置一般不超过色谱柱长度的3,4。 3〉装好的柱子其吸附剂的顶面一定要平。 4〉上样时，样品厚度要一致，表面平滑。 思考题 1)辣椒红素是什么类成分, 9 实验四 茶叶中咖啡因的提取与分离 (共4学时) 咖啡因(Caffeine)即咖啡碱，属黄嘌岭类生物碱，分子式C8H11O2N4，分子量195，熔点238?，于178?升华。存在于茶叶，咖啡、可可及其制成品中。为人们普遍服用。药物咖啡因用作心脏、呼吸器官和神经兴奋剂，过度使用咖啡因会增加抗药性和产生轻度上瘾。 实验目的 1、掌握咖啡因的提取分离方法。 2、了解咖啡因的生物活性 3、熟悉咖啡因的性质及鉴定方法。 实验原理 本实验以茶叶为原料即山茶科植物茶(Camellia sinensiso. Ktze)的芽叶。(茶叶中含咖啡因一般在2,,4,，咖啡因的PKa1(22)。用热水提取，加碳酸钙沉淀鞣质及黄酮类，重结晶即得咖啡因，并用混合熔点法、红外光谱等进行鉴定。 设备与材料 茶叶、碳酸钙粉、圆底烧瓶、蒸馏水、水浴槽、回流装置、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、三氯甲烷、旋转蒸发仪、丙酮、烧杯、熔点测定仪或毛细管法熔点测定装置，等。 实验方法 咖啡因的提取与分离 取茶叶30g，碳酸钙粉30g，加入500ml圆底烧瓶内，再加入250ml蒸馏水，水浴90?加热回流25分钟，溶液趁热过滤，滤渣弃去，滤液用水浴冷却，然后将此滤液用三氯甲烷萃取三次，每次三氯甲烷25ml，萃取液倒入圆底烧瓶内，于水浴上加热蒸馏回收三氯甲烷。粗咖啡因即残留在烧瓶内，称重并记录咖啡因的近似重置，计算干茶叶中粗咖啡因的含量。 粗咖啡因的纯化 在上述烧瓶内加入约10ml丙酮，水浴上加热至沸，使咖啡因粗品完全溶解，将此溶液倒入的50ml烧杯中，放冷，滤出晶体，再用丙酮作溶剂进行重结晶，直至得到纯净的白色晶体。(注:由于咖啡因在丙酮中很容易溶解，所以每次用丙酮重结晶时，要保持沸腾到热溶液中开始有晶体形成。)称重，计算收率。 咖啡因的升华 咖啡因在常压情况下加热能升华而不分解，所以由茶叶中提取咖啡因可以采用升华法。将茶叶烘干，磨成粉末，且平底锅内，均匀摊成约2寸厚的落层，锅上加帽形的木制锅盖，盖上有一小孔，于锅下用直炎均匀地加热，起初茶叶中的含有的挥发性成分和有机物因破坏而生成的焦油蒸出，随后咖啡因缓缓升华，至升华完毕后(可用一纸条放人木盖的孔中，借以观察生成的焦油，至油稀少时， 10 咖啡因升华也已完毕)，停止加热，冷后，去盖，冷凝在茶叶末表面约1厘米厚的白色针状结晶体，即为精制咖啡因。取出晶体，再经脱色和重结晶可得纯品。表面一层茶叶末可能仍含有少量咖啡因，可供第二次再升华用。 咖啡因的鉴定: (1)测定熔点:在b型管内用甲基硅油为加热介质，测定所得产品熔点，如有咖啡因 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品和产品做混合熔点测定。 操作要点 )实验安排:需4学时，视情况可做适当增删。 (1 (2)熟悉咖啡因提取分离中的溶剂萃取法及重结晶法。 思考题 (1)咖啡因的碱性如何,为什么, (2)咖啡因采用什么提取分离方法,怎么鉴定 11 实验五 粉防己生物碱的提取分离与鉴定 (总共16学时) 粉防己为防己科千金藤属物粉防己(Stephania tetrandra S. Mcore)的干燥块根，又名汉防己、倒地拱、百木香，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱。主要是粉防己甲素和汉防已乙素。临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用，此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。 目的要求 1、掌握总生物碱的提取及脂溶性生物碱和水溶性生物碱的分离、纯化方法 2、了解脂溶性和水溶性生物碱的薄层色谱鉴定方法 3、熟悉生物碱衍生物的制备方法 已知生物碱的结构和性质 汉防已根中总生物碱含量为1.5~2.3%，主要为汉防已甲素，含量约1%，汉防已乙素，含量约0.5%;轮环藤酚碱，含量为0.2%;以及其它数种微量生物碱。 1(粉防已甲素(Tetrandrine，粉防已碱，粉防已碱) 无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯，mp 216?，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150?左右熔后加热又固化，至213?复熔。 OCHCH3O3 NNCHCH3OR3OHH O OCH3 R=CH3 汉防己甲素 汉防己乙素R=H 2(粉防已乙素(Fangchinoline, 又称防已诺林碱，去甲粉防已碱) 溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。籍此可以相互分离，用不同溶剂重结昌时，其晶形和溶点不同: 乙醇 细棒状结晶 mp 245~40? 甲醇 细棒状结晶 mp177~9? 丙酮 六面粒状晶 mp134? 吡啶-甲醇 mp 121~2? 环已烷-EtocAc mp 156? 3(轮环藤酚碱(Cylanoline) 12 为水溶性季铵生物碱，不溶于极性溶剂，氯化物为无色，八面体状结昌，mp 214~6?，碘化物为无色绢丝状结晶，mp185?;苦味酸盐为黄色结晶，mp154~6?。 CHO3 OHNCHHO3 OH OCH3 实验原理 利用乙醇提取总生物碱，回收乙醇得总生物碱的浸膏，利用脂溶性生物碱在酸性条件下成盐后，溶于水不溶于极性小的有机溶剂;在碱性条件下成游离生物碱，溶于极性小的有机溶剂不溶于水的特点，反复处理，藉此使脂溶性的粉防己甲及粉防己乙素与水溶性的轮环藤酚碱分开，并去除部分杂质。 生物碱的提取 第一次实验 粉防己中粉防己总 设备与材料 粉防己、圆底烧瓶、乙醇、水浴槽、回流装置、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、旋转蒸发仪，等。 实验方法 称取粉防己粗粉100g，置于500ml圆底烧瓶中，加80%~95%乙醇浸没药材(约需300ml)，水浴加热回流1~2小时，过滤，滤液置1000ml三角烧瓶中。药渣再加乙醇浸没，如上法再提取2次。合并3次乙醇提取液，如有絮状物析出，再过滤1次，澄清溶液浓缩至糖浆状，放在冰箱中保存备用。 第二次实验 亲脂性生物碱和亲水性生物碱的分离 设备与材料 三角烧瓶、1%盐酸、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、生物碱沉淀试剂(如碘化铋钾等)或生物碱沉淀试纸、500ml分液漏斗、氯仿、500ml三角瓶、浓氨水、pH试纸、表面皿、1%NaOH、无水硫酸钠、旋转蒸发仪、丙酮、冰箱，等。 实验方法 将糖浆状总提取物置三角烧瓶中，逐渐加放100ml左右1%盐酸液，同时充分搅拌，促使生物碱溶解，不溶物则呈树脂状析出。静置，滤出上清液，用1%盐酸少量多次洗涤不溶物，直至洗液对生物碱沉淀试剂反应微弱为止。合并洗液和酸性溶液，移置于分液漏斗中用氯仿洗3次，每次取用酸水液的1/3量。氯仿洗液合并，用1%盐酸洗1~2次。将洗涤氯仿液的酸液和总酸水液合并，留取8ml作沉淀反应，其余酸液移入500ml的三角烧瓶中，滴加浓氨水中和至pH9~10，此时亲脂性的叔胺碱游离出来。如有发热现象，应设法冷却，加氯仿50ml，再移置500ml分液漏斗中，振摇萃取，分取氯仿层，上层碱水液再以新 13 鲜氯仿萃取数次，每次用氯仿50ml，直至氯仿抽提液生物碱反应微弱时为止(试验时取氯仿溶液置表面皿上待溶剂挥发，残留物中加稀盐酸2滴使溶解，再加生物碱沉淀试纸试之，或做薄层板点滴反应)合并氯仿溶液并置分液漏斗中，先以1%NaOH液洗2次后，再用水洗2~3次。碱水洗液和氨性碱水液合并，不要丢弃、放冰箱中留待下节课分离水溶性生物碱～氯仿液用无水硫酸钠脱水，回收氯仿至干，抽松，加丙酮约30ml热溶，必要时抽滤，丙酮液冷后，析晶，抽滤，得脂溶性生物碱(粉防己甲素和乙素的混合物)。 第三次实验 粉防己甲素和乙素及轮环藤酚碱的分离纯化 设备材料 天平、25ml三角烧瓶、苯、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、95%乙醇、活性碳、回流装置、旋转蒸发仪、TLC层析板与硅胶、固体NHCl、分液漏斗、正4 丁醇、生物碱沉淀试剂(如碘化铋钾等)或生物碱沉淀试纸、稀盐酸、95%乙醇、旋转蒸发仪、烧杯，等。 实验方法 粉防己甲素和粉防己乙素的分离 称取粗总碱，置于25ml三角烧瓶中，加5~6倍苯冷浸，室温放置30min后(其间，开始做第二项实验)，抽滤，苯不溶物主要含乙素，可用95%乙醇溶解，加少量活性炭回流脱色，乙醇液浓缩，析晶，抽滤，得粉防己乙素。苯液回收至干，加20倍量95%乙醇，适量活性炭回流加热30min，抽滤，乙醇液放置，析晶，抽滤，得粉防己甲素，干燥，称重，用丙酮(1:40，W/V)重结晶，(热溶，抽滤)得粉防己甲素精制品，待作TLC检查。 季胺生物碱——轮环藤酚碱的分离纯化 将上节课的碱水液用NHCl固体中和至pH7，置分液漏斗中，用正丁醇提4 取数次，直至碱水液生物碱反应微弱为止(取数滴碱水液于试管中，用稀HCl酸化后，再加生物碱沉淀试剂试之，或作薄层板点滴反应)。正丁醇液减压浓缩至干，用95%乙醇溶解，滤除不溶物，乙醇液浓缩至小体积，放置，析晶。反复数次，可得轮环藤酚碱精制品，待作TLC检查。 TLC层析板的准备 按照试验项目一中的方法准备TLC层析板。 第四次实验 粉防己生物碱的鉴定与衍生物的制备 设备与材料 TLC层析板、烘箱、层析槽、电吹风、标准品(粉防己甲素、粉防己乙素、轮环藤酚碱)、改良碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂、苦味酸试剂、丙酮、苦味酸饱和水溶液、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、蒸馏水、乙醇、乙醚、熔点测定仪、电子天平、甲醇、碘甲烷、回流装置，等。 实验方法 薄层色谱 将上节课铺好干燥后的TLC层析板置于110?活化1小时。 14 A、粉防己生物碱: 吸附剂:硅胶-CMC-Na板 展开剂:氯仿-乙醇(10:1)氨饱和; 甲苯-丙酮-甲醇(4:5:1)氨饱和 对照品:粉防己甲素乙醇液、粉防己乙素乙醇液 显色剂:改良碘化铋钾试剂(展开后用电吹风吹干再喷显色剂，以免二乙胺干扰) 现象:甲素显色后呈淡棕色，2小时左右就褪色，而乙素呈棕色，久置不褪色，可帮助其辨认。 B、轮环藤酚碱: 吸附剂:硅胶-CMC-Na板 展开剂:甲醇-氨水(7:3) 对照品:轮环藤酚碱水液 显色剂:改良碘化铋钾试剂 粉防己生物碱的鉴定 (1)生物碱沉淀反应:取粉防己酸水液分别置小试管中，每份1ml，分别滴加下列各试剂2~3滴，观察有无沉淀及颜色变化。 A、碘化铋钾试剂; B、硅钨酸; C、苦味酸试剂(先将酸水液调至中性，再滴加试剂) 衍生物的制备 (1)苦味酸盐:取粉防己碱200mg溶于2ml丙酮中，滴加苦味酸的饱和水溶液，即析出黄色沉淀，滴加试剂至沉淀完全，抽滤，收集沉淀，依次以少量水、乙醇、乙醚洗涤，再经乙醇重结晶，可得苦味酸盐，mp241~246?。 (2)粉防己甲素二碘甲烷盐(汉肌松)的制备:取粉防己甲素200mg，加甲醇10ml溶解，加碘甲烷1ml，回流加热15min，蒸去甲醇，残留物以水或乙醇重结晶，得白色鳞片状结晶，即粉防己甲素二碘甲烷盐(汉肌松)，mp216.5?。 操作要点 1、 提取总碱时，回收乙醇至稀浸膏即可。过干时，当加入1%盐酸水后，会结成胶状团块，影响提取效果。 2、 滴加浓氨水中和至pH9~10时，若有发热现象，应设法冷却，以免加入的氯仿挥发。 3、 去甲粉防己碱虽然也有酚羟基，但不溶于一般浓度的NaOH液，故称之为隐性酚羟基，用2%NaOH萃提时，仍留在CHCl液中。 3 4、 纯化时，若溶剂量太大，不易析晶，可再蒸去一些溶剂后，放置，以利结晶析出。 思考题 1、提取总生物碱的常用方法有哪几种,各有何缺点, 2、粉防己碱和去甲粉防己碱在结构上有哪些异同点,实验中如何利用它们的共性和个性, 3、什么叫生物碱的假阳性反应,能消除吗, 15 4、萃取操作的好坏对实验结果有什么影响,怎样防止产生乳化,怎样消除乳化, 5、为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置, 16 实验六 大黄中大黄素的提取、分离和鉴定 (共10学时) 大黄为蓼科多年生草本植物掌叶大黄，药用大黄和唐古物大黄的根茎。具有泻下、健胃、抗菌、清热、解毒、收敛和利胆等作用。此外，还有止血、降低血清胆甾醇的作用。大黄中含有多种羟基蒽醌类化合物，其中有较少量的游离羟基蒽醌(约为大黄的0.5%左右)，它们在植物中主要以苷的形式存在。 1(大黄素(Emodin):橙黄色长针晶(丙酮中结晶为橙色，甲醇中结晶为黄色)， ?。几不溶于水，对于下列溶剂的溶介度分别为:四氯化碳0.01%，mp256-257 氯仿0.0718%，二硫化碳0.009%，乙醚0.14%，苯0.0415。易溶于乙醇，可溶于氨水，碳酸钠和氢氧化钠水溶液。 OHOOH CH3HO O 2(大黄酚(Chrysophanol):金黄色六角型片状结晶(丙酮中结晶)或针状结晶(乙醇中结晶)。mp 196?，能升华。易溶于乙醚、氯仿、苯、冰乙酸、乙醇, 稍溶于甲醇，难溶于石油醚，不溶于水、碳酸氢钠和碳酸钠水溶液。可溶氢氧化钠水溶液及热碳酸钠水溶液。 OHOHO CH3 O 3(大黄素6-甲醚，(Emodinmonomethl ether):金黄色针晶，mp207?，能升华。可溶于氢氧化钠水溶液，溶解度与大黄酚相似。 OOHOH OCH3CH3 O 4、芦荟大黄素mp223,5? 5、大黄酸 mp321? 实验目的 1、 掌握PH梯度萃取法的原理和操作技术 2、 熟悉用硅胶柱色谱法分离精制大黄素 3、 了解羟基蒽醌类化合物的鉴定方法 实验原理 根据大黄中蒽醌类成分酸性强弱不同的特性，以乙醚提取脂溶性成分后，利用碱度递增的碱水液，自乙醚提取液中萃取酸度递减的游离蒽醌类成分，本实验主要分离其大黄素。 酸性: E > B > D > C、A 17 极性: E > D > B > C > A 实验准备 由于实验准备时间较长，可组织学生科技兴趣小组参与该实验的准备工作。 酸水解 取大黄粉10g(每组的份量，根据组数加倍)，加20%硫酸水溶液100ml，在水浴上加热3~4小时，抽滤，滤饼水洗后于70?左右干燥。 总羟基蒽醌苷元的提取 滤饼经干燥后，置索氏提取器中，加入乙醚150ml，回流提取3~4小时，得乙醚提取液1。乙醚提取液1经薄层色谱检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。 第一次实验 大黄素的pH梯度萃取分离 设备与材料 250ml分液漏斗、2.5%碳酸氢钠、薄层色谱板、石油醚(沸程60~90?)、乙酸乙酯、稀盐酸、2.5%碳酸钠、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、5%碳酸钠水溶 0.5%氢氧化钠水溶液，等。 液、 方法 大黄酸的分离 置乙醚提取液1(保留少量作为TLC对照，以下同)于250ml分液漏斗中，以2.5%碳酸氢钠水溶液120ml分3次萃取，分别合并三次含碳酸氢钠的碱水层(碱水层1)，得乙醚层2。乙醚层2经薄层色谱检查。薄层板为硅胶-CMC-Na，展开剂为石油醚(沸程60~90?)-乙酸乙酯(7:3)，近水平或直立展开，同时用乙醚提取液1做对照。在可见光下可看到乙醚提取液1有4个斑点，Rf为0.9的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚混合物，在此条件下分不开，其余3个斑点，依Rf值由大到小分别为大黄素(橙色斑点)、芦荟大黄素(黄色斑点)、大黄酸(黄色斑点)。通过对照乙醚提取液1，可知大黄酸己除去。碱水层1经酸化析出沉淀，抽滤后可得大黄酸沉淀和酸化液1。 大黄素的分离 经2.5%碳酸氢钠水溶液萃取后的乙醚层2，以2.5%碳酸钠水溶液120ml分3次萃取，得乙醚层3。合并三次碳酸钠萃取液，得碱水层2。乙醚层3经薄层色谱检查，知大黄素己除去。碱水层2经酸化析出沉淀，主要为大黄素沉淀，另含有少量大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素等，留待本项目第三次实验用柱色谱作进一步分离精制。沉淀过滤，得沉淀和酸化液2，水洗沉淀物至洗出液呈中性，低温干燥后作为柱色谱样品。 芦荟大黄素的分离 经2.5%碳酸钠水溶液萃取后的乙醚层3，继续用5%碳酸钠水溶液120ml分4次萃取，乙醚层4经薄层色谱检查，知芦荟大黄素己除去。合并4次碳酸钠萃取液得碱水层3，酸化，得芦荟大黄素沉淀。 大黄酚和大黄素甲醚的分离 18 经5%碳酸钠水溶液萃取后的乙醚层4，再以0.5%氢氧化钠水溶液100ml分4次萃取至碱水层无色为止，合并氢氧化钠萃取液(碱水层4)，酸化得沉淀，为大黄酚和大黄素甲醚混合物。 第二次实验 硅胶柱色谱分离精制大黄素 设备与材料 石油醚(沸程60~90?)、乙酸乙酯、层析柱、柱层析硅胶(100~200目)、 吸管、15ml试管、硅胶薄层板、旋转蒸发仪、NaOH试液、醋酸镁试液、熔点测定仪，等。 实验方法 硅胶柱色谱分离精制大黄素 (1)装柱:取100~200目的硅胶约10g，按干法装柱 (2)加样:将样品溶解于5ml石油醚(沸程60~90?)-乙酸乙酯(7:3)中，用吸管吸取样品溶液于色谱柱柱床顶端。 (3)洗脱:用石油醚(沸程60~90?)-乙酸乙酯(7:3)为洗脱剂洗脱，分段收集，每份10ml，用硅胶薄层板跟踪检查(被洗脱的成分先后顺序为:大黄酚和大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素等)。合并大黄素部分，适当浓缩，放置析晶，过滤，即得纯品大黄素。 大黄素的鉴定 (1)在薄层板上用点滴反应检查大黄素对NaOH、MgAc试液的反应 2 (2)测定大黄素的熔点。 操作要点 1、本实验多次使用乙醚，因此需注意安全防火，绝对禁止有明火的情况下使用乙醚。 2、采用梯度pH萃取法分离萃取各游离蒽醌成分时，操作不宜过分剧烈振摇，以免乳化，难以分层。 3、硅胶柱色谱整个操作过程硅胶柱表面应保持一定高度的洗脱剂，不使柱面溶液流干。 4、柱色谱洗脱时流速不应太快，以免柱交换来不及达到平衡，影响分离效果。 5、柱色谱时所用的仪器要干燥。 思考题 1、大黄中五种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列,为什么, 2、梯度pH萃取法的原理是什么,适用于哪些中药化学成分的分离, 3、试分析薄层色谱图谱中各羟基蒽醌类成分的结构与Rf值的关系。 19 实验七 槐花米中芦丁的提取、分离和鉴定 (16学时) 槐花米系豆科槐属植物槐树(Sophora japonica L)的花蕾，自古用作止血药物。治疗吐血，痔疮便血、子宫出血、鼻血等症，所含主要成分为芸香苷，又称芦丁(Rutin，维生素P)，其含量高达12,16%，有调节毛细血管渗透性之作用，临床用作毛细血管止血药，如复方芦丁，也作为高血压的辅助治疗药物。此外，芦丁对于放射线伤害所引起的出血症亦有一定作用。芦丁广泛存在于植物界，已发现的含芦丁植物至少在70种以上，其中以槐花米和荞麦叶含量较高，可作为提取芦丁的原料。 重要成分 1( 芦丁(芸香苷，rutin) 淡黄色针晶，水中结晶者含3分结晶水，C27H30O16?3H2O 100mmHg和110?加热12小时后，变为无水物，无水物于25?变棕，115,7?软化，214,5?发泡分解，1g芦丁溶于约300ml冷水，200ml沸水，7ml沸甲醇，溶吡啶，甲酰胺和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。 2( 槲皮素(Guereetin) 为芦丁的苷元，C15H10O7，MW302.23;含二分子结晶水为黄色针晶，(稀乙醇)，5,7?失水，314?解，1g溶于290ml无水乙醇、23ml沸乙醇，溶于冰醋一般在碱水中溶解显黄色，几不溶于水。 OH HOOOH ORglurhaR=芦丁 OHOR=OH槲皮素 3( 皂苷(Saponin) 粗品为白色粉末，mp 210?,20?(dec)。易溶于吡啶。能溶于200倍的甲醇，酸水解得下列两种苷元及糖。糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸内酯。 (1)白桦酯醇(Betulin)无色针晶，mp215,2?，能溶于醋酸，丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等;难溶于石油醚和水。 (2)槐花二醇(Sophoradiol)无色针晶，mp219~20?或224?，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇、难溶于水。 OHOHCH2 HOHO 实验目的 1、以芦丁为实例，了解黄酮类化合物的提取分离方法 2、掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的鉴定方法 20 3、通过槲皮素的乙酰化反应，要求得到纯品槲皮素五乙酰化物 4、熟悉纸色谱和薄层色谱的方法及黄酮类化合物的色谱特点 实验原理 1、芦丁可溶于热水，难溶于冷水。其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱中易溶解，而在酸性条件下易析出沉淀。故可采用碱提酸沉法提取芦丁。 2、利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖。通过纸色谱和薄层色谱及苷元的乙酰化衍生物进行鉴定和确认。 第一次实验 芦丁的提取与精制 设备与材料 1000ml烧杯、蒸馏水、电炉、天平、槐花米(粗粉)、石灰乳、pH试纸、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、浓HCl，等。 实验方法 芦丁的提取 于1000ml烧杯中加入500ml蒸馏水，煮沸2~3min后，称取40g槐花米(粗粉)，投入沸水中，直火加热煮沸约5min，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH8~9，加热微沸30min后，注意添加水，保持原体积并维持pH8~9，趁热过滤，滤渣再 ，煮10min，趁热过滤，合并滤液，稍冷加入200ml水，加石灰乳调pH8~9 (60~70?)，用浓HCl调至pH4~5，放置后析出沉淀，抽滤，用水洗3~4次，置空气自然干燥得淡黄色粗制芦丁。 芦丁的精制 将芦丁粗品置500ml烧杯中，加适量(约100ml)蒸馏水，再用石灰水调至pH8。加热煮沸数分钟，使充分溶解。趁热抽滤，滤液滴加3mol/L HCl调至pH7。放置18小时以上，即析出沉淀。 第二次实验 芦丁的水解 设备与材料 抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、蒸馏水、乙醇、烘箱、熔点测定仪、500ml圆底烧瓶、2%HSO溶液、电炉、95%乙醇，等。 24 实验方法 芦丁的水解 将放置18小时以上，析出的沉淀减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2~3次。然后用少量乙醇洗1次。尽量抽干，于70~80?干燥30~60min，即得精制芦丁。称重，计算产率，测mp。取精制芦丁2g，研细，置于500ml圆底烧瓶中，加2%HSO24溶液150ml，于直火上加热微沸30~60min(要补充蒸发掉的水分)，析出的黄色沉淀为槲皮素，趁热抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。沉淀经水洗后再用95%乙醇重结晶1次，得黄色针状结晶，于70~80?以下干燥，即得精制槲皮素。测mp。 21 第三次实验 糖与芦丁、槲皮素的鉴定及槲皮素五乙酰化物的制备 设备与材料 Ba(OH) 或BaCO细粉、滑石粉、旋转蒸发仪、新华一号层析滤纸、葡萄23 糖水溶液、鼠李糖水溶液、正丁醇、乙酸、蒸馏水、苯胺-邻苯二甲酸盐试剂、显色喷瓶、电吹风、15%乙酸水溶液、紫外灯、氨气、三氯化铝试剂、聚酰胺薄层板、圆底烧瓶，等。 实验方法 糖的纸色谱鉴定 取水解母液20ml，用Ba(OH)的细粉(约2.6g)中和至pH7，滤去生成的2 BaSO沉淀(可用滑石粉助滤)，滤液浓缩至约2~3ml，供纸色谱点样用。或于4 水浴上加热，同时于搅拌下加BaCO细粉中和至中性，滤除BaSO后，滤液浓34缩至2~3ml，得样品液。 样品:水解浓缩液 色谱滤纸:新华一号滤纸 对照品:葡萄糖、鼠李糖水溶液 -水(4:1:5上层) 展开剂:正丁醇-乙酸 显色:苯胺-邻苯二甲酸盐试剂喷后105?烘10min，显棕色和棕红色斑点。 苯胺-邻苯二甲酸的配制:将1.66g苯二甲酸和0.93g的苯胺溶于100ml水饱和的正丁醇中。 芦丁、槲皮素的纸色谱鉴定 样品:自制芦丁、槲皮素的乙醇溶液 色谱滤纸:新华一号滤纸 对照品:芦丁、槲皮素的乙醇溶液 展开剂:(1)正丁醇-乙酸-水(4:1:5上层) (2)15%乙酸水溶液 显色:(1)可见光下观察及紫外灯下观察 (2)经氨气薰后再观察 (3)喷三氯化铝试剂后再观察 聚酰胺薄层鉴定 用90%乙醇或乙醇-水(7:3)展开，在紫外灯下观察斑点颜色，或采用纸色谱的显色方法。 第四次实验 槲皮素衍生化、糖脎的制备与黄酮的紫外光谱鉴定 设备与材料 无水吡啶、乙酸酐、空气冷凝管、水浴槽、回流装置、冰水、95%乙醇、熔点测定仪、45%NaOH、盐酸苯肼、显微镜、丙酮、无水甲醇、甲醇钠溶液、氢氧化钠溶液、三氯化铝溶液、醋酸钠、硼酸饱和液，等。 实验方法 槲皮素五乙酰化物的制备 取槲皮素结晶200mg，置于圆底烧瓶中，加4ml无水吡啶溶解，再加5ml 22 乙酸酐摇匀，接上空气冷凝管，水浴上加热回流30min，放冷。将反应液在搅拌下倾入100ml冰水中，一直搅拌至油滴消失，白色固体沉淀析出为止，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥后用95%乙醇重结晶，得针状结晶，测其熔点(文献值为193~195?)。 糖脎的制备及鉴定 余下的水解母液小心用45%NaOH液中和、滤除棕红色沉液物，水浴上加热浓缩至约30ml，滤后加1g盐酸苯肼和2gNaAC，沸水浴上加热30~40分钟，析出黄混合糖脎，停止加热冷却，取结晶少许，于是显微镜下观察，鼠李糖脎为簇状针晶，葡萄糖脎扫帚状聚针晶，滤取糖结晶，水洗，干燥后，溶于丙酮，滤除不溶物。滤液加水使呈30%丙酮液，即析出葡萄糖脎抽滤后以少量丙酮重结晶一次，mp209?，母液加水稀释，析出鼠李糖脎，稀乙醇重结晶，mp135?。 紫外光谱鉴定 利用紫外吸收光谱，测定黄酮化合物在加入各种电解质或络合剂后吸收峰的位移，根据位移的情况，以判断化合羟基的位置。 1(试剂配制 (1)无水甲醇:用分析纯的甲醇，加入10%CaO，放置24小时后，加热回流1小时，回流时冷凝管顶端应安装CaCl2干燥管，然后蒸馏得无水甲醇。 (2)甲醇钠溶液:取金属钠0.25g，切碎，小心加入无水甲醇10ml中，此溶液贮存于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。 (3)氢氧化钠溶液:取2.0g NaOH，加10ml水溶解。 (4)三氯化铝溶液:2.5g无水三氯铝小心地加入无水甲醇550ml中，放置24小时后全溶即得。 (5)醋酸钠:用无水粉状醋酸钠。 (6)硼酸饱和液:将无水硼酸加入适量无水甲醇，制成饱和溶液。 依照上述方法制备的各贮备液，可存放使用6个月。 2(测定方法 精密称取黄酮样品(槲皮素)约1.2mg，用无水甲醇溶解，再稀释至100ml。 (1)黄酮光谱:取样品溶液约3ml置于石英杯(1cm)中，在200~500nm波段内进行扫描，重测一次，视光谱的重现性。 (2)氢氧化钠光谱:取样品溶液约3ml置于石英杯中，加入氢氧化钠2~3滴后，立即进行测定。放置5分钟后，再测定一次。 (3)甲醇钠光谱:取样品溶液约 3ml置于石英杯中，加入甲醇钠溶液5~7滴后，立即进行测定。放置5分钟后，再测定一次。 (4)三氯化铝光谱:在盛有约3ml样品溶液的石英杯中，加入AICI3溶液6滴，放置一分钟后进行测定。测定后，加入3滴盐酸溶液(浓盐酸:水=1:1)，再测定一次。 (5)醋酸钠光谱:取样品溶液约3ml置于石英杯中，加入适量的无水醋酸钠固体，杯底剩有约2mm的醋酸钠时，二分钟内进行测定。 操作要点 1、提取中加入硼砂，既能调节水溶液的pH，又有与芦丁分子中的邻二酚羟基结合，达到保护芦丁减少氧化的目的。但硼砂价格较贵，工业上用较大量的石灰加少量的硼砂，同样能达到提高质量的要求。 23 2、搅拌下用石灰乳调节pH8~9，既可达到碱溶解芦丁的目的，又可除去槐花米中含有的大量果胶、粘液质、多糖等，使这些成分生成钙盐沉淀不致溶出。但pH不可过高，否则钙离子能与芦丁形成螯合物析出而降低收率。 3、用浓盐酸酸化调pH4~5，pH不宜过低，以免芦丁形成珜盐，重新溶解，降低收率。 4、槲皮素五乙酰化衍生物制备中，所有仪器均要干燥。 思考题 1、提取芦丁 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 中影响产量与质量的因素是什么,为什么要加硼砂水沸溶液, 2、使用去离子水或蒸馏水的目的,为什么, 3、芦丁水解不完全时将产生什么结果, 4、黄酮类化合物有哪些提取方法,芦丁的提取还可以用什么方法, 5、芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开，将出现什么结果,为什么, 6、芦丁和槲皮素聚酰胺薄层将出现什么结果,为什么, 7、槲皮素乙酰化衍生物的制备应注意什么, 8、如何证明芦丁分子中只含有葡萄糖和鼠李糖,如何证明苷元、葡萄糖、鼠李糖的连接位置, 24 实验八 从洋金花中提取分离东莨菪碱和莨菪碱 (共10学时) 洋金花又名蔓陀罗花、大闹杨花、酒醉花，主产于江苏、浙江、福建、广东、广西、湖北、四川等地，为茄科植物毛花蔓陀罗(Datum innoxia Miller)的花。洋金花为中药麻药方剂中的主药，三国时代的华佗就用洋金花加乌头等药配制成“麻沸散”，施行全身麻醉，成功地进行了肿瘤切除、胃肠吻合、开颅等高难度的外科手术。洋金花还有定喘，祛风，麻醉止痛等功效。现代临床上主要用于治疗 并用作外科手术麻醉剂。 哮喘，惊癎，风湿痹痛，脚气，疮疡疼痛， 主要化学成份 CHN3 O H OOH OCCPh l、东莨菪碱(Scopolamine)又名:莨菪胺、天仙子碱mp59?(一水合物)。 RN H H OOH OCCPh R=CH 莨菪碱 3 R=H 去甲莨菪碱 2、莨菪碱(Hyoscyamine)又名:天仙子胺mp108.5? 3、去甲莨菪碱(Norhyoscyamine) mp142? 4、莨菪酸(Tropic acid) mp118? 5、曼陀罗碱(Meteloidine) mp141? 实验目的 l、熟悉生物碱的一般提取分离方法。 2、掌握氧化铝柱色谱分离莨菪碱和东莨菪碱的实验方法，从而了解柱色谱的一般实验操作技术。 3、了解东莨菪碱和莨菪碱的检识方法。 实验原理 本实验是利用游离生物碱及其盐均能溶于乙醇的性质，用乙醇回流提取总生物碱，再利用东莨菪碱和莨菪碱碱性强弱不同，与碱性氧化铝吸附力强弱不同，用氧化铝柱色谱进行分离。 第一次实验 总碱的提取 设备与材料 洋金花(粗粉)、园底烧瓶、95,乙醇、水浴槽、回流装置、抽滤瓶、布氏 25 漏斗、真空泵、旋转蒸发仪、1,盐酸、氯仿、10,NaOH、无水硫酸钠，等。 实验方法 取洋金花粗粉10克，置园底烧瓶中加95,乙醇60毫升，置水浴上回流提取1小时，倾出提取液，药渣再用95,乙醇40毫升水浴回流提取30分钟，倾出提取液，药渣再用95,乙醇40毫升回流提取30分钟，倾出提取液，三次提取液合并，用布氏漏斗过滤，滤液回收乙醇至无醇味，浓缩液加1,盐酸20毫升使溶解，抽滤，滤液用氯仿(20，10，10毫升)萃取脂溶性杂质，酸水液用10, ，10，10毫升)四次，氯仿液用无水硫NaOH调至pH9一l0，用氯仿萃取(20，15 酸钠脱水干燥，回收氯仿得总碱。 第二次实验 莨菪碱与东莨菪碱的氧化铝柱层析分离 设备与材料 小色谱柱、铁架台、棉花、滤纸、碱性氧化铝(100-120目)、漏斗、氯仿、(石英砂)、15毫升试管、旋转蒸发仪、TLC板、丙酮、无水乙醇、碘化铋钾试剂、发烟硝酸、稀HCl、白瓷板、10,KOH乙醇，等。 实验方法 柱色谱分离 这两种生物碱我们用碱性氧化铝干柱色谱进行分离，其操作步骤如下: 1、装柱:将色谱柱垂直固定在铁支架上，柱底填一块棉花，打开活塞，称取100—120目碱性氧化铝10克，经漏斗慢慢装入柱中，一边装填，一边用橡皮塞轻轻敲击色谱柱，使其装填均匀紧密，最后使吸附剂表面形成一水平面。 2、上样:将上述所得总生物碱用少量氯仿溶解，用吸管小心将氯仿溶液加在吸附剂表面上，切勿破坏吸附剂平面，为了防止平面被损坏，可剪一直径同色谱柱内径大小一样的滤纸，小心放在吸附剂平面上，或在其上面加1—2厘米厚的石英砂，把氯仿溶液加到滤纸片上或石英砂上。 3、展开(洗脱):加样完毕，立即小心加入氯仿(也应注意防止破坏吸附剂平面)，展开洗脱，当溶剂前沿到达柱底部时，用15毫升试管收集洗脱液，并控制流速，使每分钟流出液为10-15滴，每管收集10毫升，更换试管，编上序号，并在柱上经常添加氯仿，使溶剂面始终高于吸附剂表面，东莨菪碱先洗脱下来，莨菪碱后洗脱下来。 4、溶剂回收，按序号分别回收溶剂后，再氧化铝薄层检查，以氯仿—丙酮—乙醇(8:2:1)展开，改良碘化铋钾试剂显色。相同部分合并。 检识反应及薄层检查 1、生物碱沉淀反应 分别取东莨菪碱，莨菪碱少量，置白瓷板中蒸发到干，加2滴稀HCl溶解， 分别加以下生物碱沉淀试剂: (1)碘—碘化钾试液 (2)改良碘化铋钾试液 (3)苦味酸试液 观察结果: 2、Vitali反应:分别取东莨菪碱和莨菪碱少量，置于白瓷板中，加发烟硝酸5滴，于水浴上蒸干，放冷后，加10,KOH乙醇溶液2—3滴，观察颜色变化，并加 26 以解释。 3、薄层色谱 吸附剂:碱性氧化铝150一180目，干法铺板。 展开剂:氯仿—丙酮—乙醇(8:2:1) 样品:东莨菪碱氯仿溶液 莨菪碱氯仿溶液 东莨菪碱标准品 莨菪碱标准品 显色剂:改良碘化铋钾，喷洒 操作要点 l、装柱还可采用湿法:将洗脱剂加到吸附剂中，搅拌成稀糊状，加到层析柱中，使吸附剂依重力自然下沉到柱底部，打开活塞使洗脱剂流出，但要保证溶剂表面始终高于吸附剂表面。干法装柱操作简便、迅速、不受洗脱剂的限制，但柱效不高。 2、柱色谱和薄层色谱用的氧化铝要注意活度，一般?—?级即可，活度不够就不能将样品中成分分开。 思考题 1、洋金花的主要化学成分是什么, 2、利用氧化铝柱层析分离洋金花中的各种成分的原理是什么, 3、干法装柱与湿法装柱各有什么优缺点, 27 实验九 丹皮酚的提取、分离和制剂鉴别 (共10学时) 牡丹皮为毛莨科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。本品具有清热凉血，活血化瘀的作用，用于温毒发斑，吐血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，肿痛疮毒，跌打损伤等症。其主要成分有:丹皮酚 (含量l.9,一2,)、牡丹酚甙(丹皮酚甙)、牡丹酚原甙(丹皮酚原甙 (含量5,一6,)、牡丹酚新甙、芍药甙。尚含挥发油约0.15,—0.4,及植物甾醇等。除此外，含丹皮酚的植物还有矮牡丹Paeonia suffruticosa Andr(var spontanea Rehd(的根皮，紫斑牡丹 papaveracea Andr(的根皮，黄丹皮Ppotanini Kom，四川牡丹Pszechuanica P(((Fang，徐长卿Cynanchum pariculatum(Bge)Kitag。 主要成分 l、丹皮酚 (paeonol):CHO，白色针状结晶，mp49.5?—50.5?，稍溶于水，9103 具有挥发性，能随水蒸气蒸馏，能溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、苯等。UVλ EtOH(max)nm(1g ε):29l(4.01)，274(4.17)，316(3.84) 2、丹皮酚甙(paeonoside):CHO，无色柱状结晶(乙醇)，mp8l?—82?，[α]2015208 为—39.33?(c,6.0，H20)，可溶于水、醇、丙酮、乙酸乙酯，微溶于氯仿、苯等。 3、丹皮酚原甙(paeonolide):CHO，无色柱状结晶(乙醇—乙酸乙酯)，202812 mpl57?—158?，〔α〕20为18.20。(c,0.36，H20)，可溶于水、醇、丙酮、乙酸乙酯，难溶于苯、石油醚等。 OR HCOCOCH33 丹皮酚 R,H 丹皮酚甙 R,葡萄糖 丹皮酚原甙 R,葡萄糖—阿拉伯糖 实验目的 l、掌握用水蒸气蒸馏法提取丹皮酚的方法。 2、了解丹皮酚的色谱检识和定性检识。 3、熟悉杞菊地黄丸中主要成分丹皮酚的鉴别方法。 实验原理 1、丹皮酚具有挥发性，可随水蒸气蒸馏，又因在冷水中难溶故放冷后析出结晶。 2、杞菊地黄丸中含有8味中药，牡丹皮中的丹皮酚为有效成分之一，利用丹皮酚溶于乙醚的性质，用乙醚提取，并将醚提取液用酚类的显色反应检识，与丹皮药材提取液和丹皮酚标准品对照鉴别。 第一次实验 丹皮酚的提取分离 设备与材料 丹皮(粉碎)、蒸馏水、乙醇、氯化钠、水蒸气蒸馏装置、乙醚、无水硫酸 28 钠、旋转蒸发仪、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、天平、5,三氯化铁醇溶液、浓硝酸、硅胶层析板、环己烷、乙酸乙酯、电吹风，等。 实验方法 提取分离 取市售丹皮?150g，粉碎，加入700m1蒸馏水、10ml乙醇?和40克氯化钠?，浸润后，进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约300ml，将蒸馏液放冷，静置过夜，有白色针状结晶析出，滤取结晶，干燥，称重。如结晶不纯，可加入95,乙醇 )，抽滤，滤液中加入4倍量的蒸馏水，使溶液呈至全部溶解(约为粗晶的15倍 乳白色，静置后则有大量白色针状结晶析出，若在提取过程中得不到白色结晶，只有油珠状物质沉出，可在蒸馏液中加入少量晶种，摩擦瓶壁后，即有较大量的丹皮酚结晶析出。也可用乙醚萃取蒸馏液几次，合并萃取液后，加无水硫酸钠脱水，回收乙醚至少量，放置析晶，抽滤，结晶用少量水洗2—3次，置干燥器中干燥后称重。 丹皮酚的鉴定 l、显色反应 (1)三氯化铁反应 取丹皮酚结晶少许，滴加5,三氯化铁醇溶液，观察现象。 (2)与浓硝酸反应 取丹皮酚结晶少许，滴加浓硝酸数滴，观察现象。 2、薄层色谱鉴别 薄层析:硅胶G—CMC—Na板 点 样:丹皮酚供试品和对照品的乙醇溶液 展开剂:环己烷—乙酸乙酯(3:1) 展开方式;上行展开，展距10cm。 显 色:喷以盐酸酸化的5,三氯化铁醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。 观察记录:记录图谱及斑点颜色。 第二次实验 制剂的薄层色谱鉴别——杞菊地黄丸中丹皮酚的鉴别 本品为蜜丸或水蜜丸，具有滋肾养肝的功效，由枸杞子、菊花、熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻八味中药组成。 设备与材料 杞菊地黄丸、硅藻土、乙醚、水浴槽、回流装置、抽滤瓶、布氏漏斗、真空泵、乙醇、硅胶层析板、环乙烷、乙酸乙酯、5,三氯化铁醇溶液，等。 实验方法 预处理 (1)供试液的制备 取本品大蜜丸9g(水蜜丸6g)，切碎，加硅藻土4g研匀(水蜜丸研碎)，加乙醚40m1，水浴加热回流1h，过滤，滤液挥去乙醚，残渣加乙醇lml使之溶解，即为供试液。 (2)对照液的制备 自制丹皮酚及丹皮酚对照品加乙醇，各制成1m1含1mg丹皮酚的溶液。 薄层色谱鉴别 薄层析:硅胶G—CMC—Na板 点 样:供试液、自制丹皮酚及丹皮酚对照品的乙醇液各点样10μl。 29 展开剂:环乙烷—乙酸乙酯(3:1)。 展开方式:上行展开，展距10cm。 显色:喷以盐酸酸化的5,三氯化铁醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。 观察记录:记录图谱及斑点颜色。 操作要点 ?丹皮因产地、采收季节的不同，丹皮酚含量差异较大，春秋季节采收含量高，以四川产的含量较高，实验时可以根据含量加减提取的药材量。 ?丹皮酚易溶于热水而难溶于冷水，若采用一般装置，由于初馏液中的丹皮酚浓度过大，遇冷易析出结晶，固着于冷凝管内壁，加入乙醇可把固着于冷凝管内壁的丹皮酚溶解而流人接收瓶中。 ?加入氯化钠可明显提高蒸馏速度，缩短摄取时间。 思考题 1、丹皮酚还可用什么方法提取分离? 2、水蒸气蒸馏法适用于提取什么样的成分?操作中应注意哪些问题? 3、如何利用原药材鉴定成药中的某一成分? 30 附录一 中草药化学成分检出试剂配制法 一、生物碱沉淀试剂: 1(碘化铋钾(Dragendorff)试剂:取次硝酸铋3g溶于30%硝酸(比重1.18)17ml中，在搅拌下慢慢加碘化钾浓水溶液(27克碘化钾溶于20ml水)，静置一夜，取上层清液，加蒸馏水稀释至100ml。 附:改良的碘化铋钾试剂: 甲液:0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。 8g碘化钾溶于20ml水中。 乙液: 溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间，可作沉淀试剂用，如作层析显色剂用，则取上述混合液1ml与醋酸2ml，混合即得。 目前市场上碘化铋钾试剂可直接供配制:7.3g碘化铋钾，冰醋酸10ml，加蒸馏水60ml。 2(碘化汞钾(Mayer)试剂:氯化汞1.36g和碘化钾5g各溶于20ml水中，混合后加水稀释至100ml。 3(碘一碘化钾(Wagner):试剂:1g碘化钾液于50ml，加热，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。 4(硅钨酸试剂:5g硅钨酸溶于100ml水中，加盐酸少量至pH2左右。 5(苦味酸试剂:1g苦味酸溶于100ml水中。 6(鞣酸试剂:鞣酸1g加乙醇1 ml溶解后再加水至10ml。 7(碱酸铈——硫酸试剂:0.1g硫酸铈混悬于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加热至沸，逐滴加入浓硫酸至澄清。 二、苷类检出试剂: (一)糖的检出试剂: 1(碱性酒石酸铜(Fehiling)试剂:本口分甲液与乙液，应用时取等量混合。 甲液:结晶硫酸酮6.23g，加水至100ml。 乙液:酒石酸钾钠34.6g，及氢氧化钠10g，加水至100ml。 2(ɑ-萘酚(Molisch)试剂。 甲液:ɑ-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。 乙液:浓硫酸 3(氨性硝酸银试剂:硝酸银1g，加水20ml溶解，注意滴加适量的氨水，随加随搅拌，至开始产生的沉淀将近全溶为止，过滤。 4(ɑ-去氧糖显色试剂 (1)三氯化铁冰醋酸(Keller-Kiliani)试剂 甲液:1%三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。 乙液:浓硫酸。 (2)占吨氢醇冰醋酸(Xanthydrol)试剂:10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸(含1%的盐酸中) (二)酚类 1(三氯化铁试剂:5%三氯化铁的水溶液或醇溶液。 2(三氯化铁一铁氰化钾试剂: 甲液:2%三氯化铁水溶液 乙液:1%铁氰化钾水溶液 应用时甲液、乙液等体积混合或分别滴加。 31 3、4一氨基氨替比林一氨氰化钾(Emerscn)试剂: 甲液:2%4-氨基安替比林乙醇液 乙液:3%铁氰化钾水溶液，(或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水 溶液)。 4(重氮化试剂:本试剂系由对硝基苯胺和亚硝酸钠在强酸下经重氮化作用 而成，由于重氮盐不稳定很易分解，所本试剂应临用时配制。 甲液:对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml，加水至50ml。 乙液:亚硝酸钠5g，加水至50ml 应用时取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。 5(Gibb试剂: 0.5%2，6-二氯苯醌-4氯亚胺的乙醇溶液。 甲液: 乙液:硼酸一氯化钾一氢氧化钾缓冲液(pH9.4)。 [注]试剂配制法中:1.水是指蒸馏水;2.不指出溶剂的即为水溶液;3.醇指 95%;4.试剂配制后应澄清，如不澄清可过滤。 (三)内酯、香豆素类 1(异羟肟酸铁试剂 甲液:新鲜配制的1N羟胺盐酸盐(M=69.5)的甲醇液。 乙液:1.1N氢氧化钾(M=56.1)的甲醇液 丙液:三氯化铁溶于1%盐酸中的浓度为1%的溶液。 应用时甲、乙、丙三液体按次序滴加，或甲、乙两液混合滴加后再加丙液。 2(4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂(见二一(二)-3)。 3(重氮化试剂:(见二一(二)-4)。 进行2、3试验时样品应先加3%碳酸钠溶液加热处理，再分别滴加试剂。 4(开环一闭环试剂 甲液:1%氢氧化钠溶液。 乙液:2%盐酸溶液。 (四)黄酮类: 1(盐酸镁粉试剂:浓盐镁和镁粉 2(三氯化铝试剂:2%三氯化铝甲醇溶液 3(醋酸镁试剂:1%醋酸镁甲醇溶液 4(碱式醋酸铅试剂:饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液。 5(氢氧化钾试剂:10%氢氧化钾水溶液。 6(氧氯化锆试剂:10%氧氯化锆甲醇溶液。 7(锆一枸橼酸试剂: 甲液:2%氧氯化锆甲醇液。 乙液:2%枸橼酸甲醇液。 (五)蒽醌类: 1(氢氧化钾试剂:10%氢氧化钾水溶液。 2(醋酸镁试剂:105醋酸镁甲醇溶液。 3(1%硼酸试剂:1%硼酸水溶液。 4(浓硫酸试剂:浓硫酸。 5(碱式醋酸铅试剂:(见二一(四)一4)。 (六)强心苷类 1(3，5-二硝基苯甲酸(Kedde)试剂。 32 甲液:2%3，5-二硝基苯甲酸甲醇液。 乙液:1N氢氧化钾甲醇溶液: 应用前甲、乙两液等量混合。 2(碱性苦味酸(Baljet)试剂: 甲液:1%苦味酸水溶液。 乙液:10%氢氧化钠溶液。 3(亚硝基铁氰化钠一氢氧化钠的(Legal)试剂: 甲液:吡啶 乙液:0.5%亚硝基铁氰化钠溶液。 丙液:10%氢氧化钠溶液 (七)皂苷类: (溶血试验:2%血球生理盐水混悬液:新鲜兔血(由心脏或耳静脉取血)，1 适量，用洁净小毛刷迅速搅拌，除去纤维蛋白并用生理盐水反复离心洗涤至上清 液无色后，量取沉降红血球用生理盐水配成2%混悬液，贮冰箱内备用(贮存期 2~3天)。 2(醋酐一浓碱酸(Liebermann)试剂: 甲液:醋酐。 乙液:硫酸。 3(浓硫酸试剂，浓硫酸。 (八)含氰苷类: 1(苦味酸钠试剂:适当大小的滤纸条，浸入苦味酸饱和水溶液;浸透后取 出晾干，再浸入10%碳酸钠水溶液内，迅速取出晾干即得。 2(亚铁氰化铁(普鲁士兰)试剂: 甲液:10%氢氧化钠液。 乙液:10%硫酸亚铁水溶液，用前配制。 丙液:10%盐酸。 丁液:5%三氯化铁液。 三、萜类、甾体类检出试剂 1(香草醛一浓硫酸试剂:5%香草醋浓硫酸液(或0.5g香草醛溶于100ml 硫酸一乙醇(4:1)中)。 2(三氯化锑(Carr-Price)试剂:25g三氯化锑溶于15g氯仿中(亦可用氯 仿或四氯化碳的饱和溶液)。 3(五氯化锑试剂:五氯化锑一氯仿(或四氯化碳)1:4，用前新鲜配制。 4(醋酐一浓硫酸试剂:(见二一(七)一2)。 5(氯仿一浓硫酸试剂: 甲液:氯仿(溶解样品)。 乙液:浓硫酸。 6(间二硝基苯试剂: 甲液:2%间二硝基苯乙醇液。 乙液:14%氢氧化钾甲醇液。 用前甲、乙两液等量混合。 7(三氯醋酸试剂:3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，加入1~2溶过氧化氢。 四、鞣质类检出试剂: 1(三氯化铁试剂 33 2(三氯化铁一铁氰化钾试剂 3(4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂 4(明胶试剂:10g氯化钠，1g明胶，加水至100ml。 5(醋酸铅试剂:饱和醋酸铅溶液。 6(对甲基苯磺酸试剂:20%对甲基苯磺酸氯仿溶液。 7(铁铵明矾试剂:硫酸铁铵结晶(FeNH(SO)HO)lg，加水至100ml。 44122五、氨基酸多肽、蛋白质检出试剂 1(双缩脲(Biuret)试剂: 甲液:1%硫酸铜溶液。 乙液:40%氢氧化钠液。 应用前等量混合。 (茚三酮试剂:0.3g茚三酮溶于正丁醇100ml中，加醋酸3ml(或0.2g茚2 三酮溶于100ml乙醇或丙酮中)。 3(鞣酸试剂:(一6) 六、有机酸检出试剂 1(溴麝香草酚兰试剂:0.1%溴麝香酚兰(或溴酚兰、或溴甲酚绿)乙醇液。 2(吖啶试剂:0.005%吖啶乙醇液。 3(芳香胺一还原糖试剂，苯胺5g，水糖5g溶于50%乙醇溶液中。 七、其它检出试剂 1(重铬酸钾一硫酸 5g重铬酸钾溶于100ml 40%硫酸。 2(萤光素一溴: 甲液:0.1%萤光素乙醇液 乙液:5%溴的四氯化碳溶液。 甲液喷、乙液熏。 3(碘蒸气 4(硫酸液:5%硫酸乙醇液，或15%浓硫酸正丁醇液。或浓硫酸一醋酸(1: 1)。 5(磷钼酸、硅钨酸或钨酸试剂:3~10%磷钼酸或钨酸乙醇液。 6(碱性高锰酸钾试剂: 甲液:1%高锰酸钾液。 乙液:5%碳酸钠液，用时等体积混合。 7(2，4-二硝基苯肼试剂:取2，4-二硝基苯肼配成0.2% 2N盐酸溶液或0.1 2%盐酸乙醇液。 34 附录2 各类天然成分的鉴别方法 生物碱的鉴别 1(检品溶液的制备: 取粉碎的植物样品约2g，加蒸馏水20~30ml，并滴加数滴盐酸，使呈酸性。在60?水浴上加热15分钟，过滤，滤液供作以下试验。 2(生物碱类成分的鉴别: 生物碱类成分(除有少数例外)均与多种生物碱沉淀试剂在酸性溶液(水液或稀醇液)中产生沉淀反应。操作如下: (1)取上备酸水浸液四份(每份1 ml左右即可),分别滴加碘-碘化钾)碘化汞钾试剂)碘化铋钾试剂)硅钨酸试剂。若四者均有或大多有沉淀反应，表明该样品可能含有生物碱，再进行下项试验，进一步识别。 (2)取上备其余酸水浸液，加Na2CO3溶液呈碱性，置分液漏斗中，加入乙醚约10ml振摇，静置后分出醚层，再用乙醚3ml，如前萃取，合并醚液。将乙醚液置分液漏斗中，加酸水液10ml振摇，静置分层，分出酸水液，再以酸水液5ml如前提取，合并酸水液，如此酸提液四份，分别作以下沉淀反应。 a(碘化汞钾试剂(Mayer试剂):酸水提液滴加碘化汞钾试剂，产生白色沉淀。 b(碘化铋钾试剂(Dragendorff试剂):酸水提液滴加碘化铋钾试剂，产生桔红色或红棕色沉淀。 c(碘-碘化钾试剂(Wagner试剂):酸水提液滴加碘-碘化钾试剂，产生棕色沉淀。 d(硅钨酸试剂:酸水提取液滴加硅钨酸试剂产生淡黄色或灰白色沉淀。 此酸水提液与以上四种试剂均(或大多)产生沉淀反应，即预示本样品含有生物碱。 (3)备注:以上(1)、(2)沉淀反应结果:沉淀的多少以“+++”，“++”，“+”表示，无沉淀产生则以“—”表示。若(1)项试验全呈负反应，可另选几种生物碱沉淀试剂(可参考有关资料)进行试验，若仍为负反应，则可否定样品中有生物碱的存在，不必再进行(2)项试验。 苷类的鉴别 苷的一般鉴别反应 1(检品溶液的制备: 中草药水浸液:取中草药碎块或粉末2g，加蒸馏水约20ml 70??水浴，浸渍10分钟，过滤，滤液供鉴别用。 中草药醇浸液:取中草药碎块或粉末少许于试管中，加乙醇10ml，在温水浴上浸渍10分钟，过滤，滤液供鉴别用。 2(鉴别试验: (1)α-萘酚试验(Molish)反应 取醇浸液1ml，加10%α-萘酚醇液1滴，摇匀，沿管壁缓慢加入浓H2SO4 10滴，不振摇，观察两液介面间是否出现紫红色杯(此反应检识糖、苷类化合物，反应较灵敏。若有微量滤纸纤维或中草药粉末存在于溶液中，都能产生上述反应，故在过滤时应加以注意)。 (2)水解反应: 取水浸液3ml于试管中，加10%HCl 1ml在沸水浴上加热20分钟，观察是否有絮状沉淀产生, (3)碱性酒石酸铜(斐林试剂Fehling’s test solution)试验 35 取水浸液2ml，加入新配制的斐林试剂(甲+乙等量混合)1ml，在沸水浴上加热数分钟，如产生红色的氧化亚铜沉淀，则行过滤，滤液中加10%HCl调成酸性，置水浴上加热10分钟。进行水解，如有絮状沉淀则滤去。然后用10%NaOH中和，再加入斐林试剂1ml，仍置沸水浴上加热5分钟，观察是否有黄色，砖红或棕色沉淀产生,(此反应试多糖，苷类)从反应结果说明供试中草药中是否含有苷,(此试验法亦可采用同体积同浓度的中草药浸液两份，一份先经酸水解过滤碱化后，另一份再同时进行如上的还原反应，对比生成的氧化亚铜量，两份是否有差异来判断，具体方法见系统预试实验)。 注:中草药对苷的一般鉴别是正反应，还可进一步作个别苷类的鉴定。具体方法如后。 蒽苷的鉴别 1(检品溶液的制备: 取大黄粉末2克，加乙醇20ml，在沸水浴上回流浸提10分钟，过滤供鉴别用。 2(鉴别试验: (1)与碱成盐显色反应(Borntrager反应):取1ml乙醇提取液，加入1ml 10% NaOH溶液，如产生红色反应，加入少量30%过氧化氢液，加热后红色不褪，加酸使呈酸性时，则红色消褪再碱化又出现红色。 注:或取大黄粉末少许，置小试管中，加水1~2ml，加浓H2SO4 2—3滴，置水浴中加热10分钟，冷却，加乙醚1—2ml振摇。用吸管吸取醚液(黄色)于另一洁净试管中，加入NaOH试液1ml振摇，则醚层应褪为无色，碱层(下层)为红色，示有蒽醌类成分存在，如供试的中草药在以上试验中碱水层仅现黄色，可分出碱水溶液，置试管中，加30%H2O2溶液1~2滴，在沸水浴中加热数分钟，混液如能转为橙红色，说明中草药中可能有蒽酚类成分存在。 (2)升华试验:取大黄粉末少许，置载玻片上，玻片两端各放短木棍一小段，然后另取一洁净载玻片，放置于小棍上，注意勿触及下面粉末。然后移置在三足架的铁纱网上小心加热(勿使粉末炭化)至玻片上有升华物凝结为止，取下盖片，使升华物面向上，放置于显微镜下观察，可见多数黄色针晶或羽毛状晶体(蒽醌衍生物)。此晶体遇碱液呈红色。 (3)园形滤纸层析: 样品:大黄醇浸液 显色:1)于自然光下观察色带 2)于紫外光下观察荧光环 3)氨熏，观察是否出现红色环，再置uv下观察荧光环 4)喷0.5%MgAC2甲醇液，于90?烘5分钟，出现橙红或紫红色环。 黄酮苷的鉴别 1(检品溶液的制备: 取槐花米约1克压碎于试管中加乙醇10~20ml在水浴上加热20分钟。过滤，滤液供以下试验。 2(鉴别试验: ?取醇浸液2ml，加浓盐酸2~3滴及镁粉少量，放置(或于水浴中微热)，产生红色反应。 ?取醇浸液1ml，滴加pbAC2溶液数滴，产生黄色沉淀。 36 ?纸片法: 将醇浸液滴于滤纸上，分别进行以下试验: ?先在紫外灯下观察荧光，然后喷1%AlCl3试剂，再观察荧光是否加强。 ?氨熏后出现黄色，棕黄色荧光斑点。 与氨接触而显黄色，或者原呈黄色，但与氨接触后黄色加深，滤纸片离开氨蒸气数分钟，黄色或加深后的黄色又消褪。 ?喷以3%FeCl3乙醇溶液，出现绿、兰或棕色斑点。 强心苷的鉴别 1(检品溶液的制备: 取夹竹桃叶碎块粉末3g，于100ml锥形瓶中加70%乙醇40ml，水浴上浸煮5分钟，放冷，过滤，滤液(或经处理后——方法参照注二)供鉴别用。 [注1]:强心苷的试验都是在较强的碱性条件下进行，如果样品中含有蒽醌，也具有红色反应，防碍检查，因此在检查前需先检查有无蒽醌类成分，若有则应先将其除去，即将乙醇浸液在水浴上蒸发，残渣加CHCl3热溶后过滤，CHCl3液用1%NaOH液振摇，去除蒽醌后，CHCl3液供鉴别用。 [注2]:夹竹桃叶或毛地黄叶绿素，常使醇提液带较深的绿色，影响反应的进行。故需将叶绿素除去，具体方法如下: 乙醇浸提液在水浴上挥去大部分乙醇(不让乙醇挥尽)，再加水适量，使含醇量约20%左右，稍热后即放冷，过滤，滤液即可供试验用，或将滤液在水浴上浓缩至糖浆状，加入95%乙醇10ml溶解再供试验用。 2(鉴别试验: (1)三氯化铁冰醋酸反应(Keller-Kiliani反应):取醇提液或经处理后的CHCl3或醇液1ml，水浴上蒸干，残渣溶于冰醋酸2ml中，加入1%FeCl3乙醇液1滴，混合均匀，倾入干燥小试管中，再沿管壁缓慢加入等体积浓硫酸，静置，二液交 ,界处显棕色(苷元)，渐变为浅绿，兰色，最后上面醋酸层全呈兰色或兰绿色(-去氧糖)。 (2)碱性3.5-二硝基苯甲酸反应(Kedde反应):取1ml醇浸提液，加入碱性3.5-二硝苯甲酸试剂3~4滴，产和红色或红紫色反应。 (3)亚硝酰铁氰化钠反应(Legal反应):取1ml醇浸提液或经处理后的CHCl3或醇液在水浴上蒸干，用1ml吡淀溶解残渣，加入0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液4~5滴，混匀，再加入NaOH饱和乙醇液1—2滴，是否呈现红色(若结果不明显可另一取一份供试液如上操作，最后加NaOH饱和乙醇液0—5ml，观察二液交界面有无红色)。 (4)碱性苦味酸(Baljet反应) 取样品醇液1ml，加入碱性苦味酸试剂(苦味酸饱和水液与5%NaOH水液等量混合)数滴，呈现橙或橙红色。 皂苷的鉴别 1(检品溶液的制备: 1)取皂角碎块1g于大试管(或小烧杯)中，加蒸馏水15ml，于30~90?水浴上浸渍15分钟后过滤，滤液供鉴别用。 2)取薯蓣碎块0.5g加上法同样制备得薯蓣水浸液。 3)取薯蓣碎块0.5g于大试管或小锥形瓶中加95%乙醇10ml于水浴上温浸15分钟，滤液供鉴别。 37 2(鉴别试验: (1)溶血试验:取滤纸片一小块，于小心处滴加皂角浸液一滴，待干后于同处再滴加一滴，如是反复操作至滴加数滴，干燥后无喷雾血球试液(取牛血、羊血或兔血一份，用玻棒或棉签搅和，除去凝集的血蛋白，加pH7.4磷酸盐缓冲液一份稀释即得)，数分钟后观察在红色的背底中是否出现无红色的黄色(或透明)斑点(中心处皂解浸液原点)。(本反应亦可在试管中进行，血球试液中草药浸液中的皂苷溶解后，血球液由浑浊变为澄明。此外还可在载玻片上进行，并在显微镜下观察血球破裂溶解前后的状况)。 (2)泡沫试验:薯蓣浸液，皂角浸液各2ml，分别置于试管中。用力振摇一分钟后放置，在10分钟内观察二管是否都有持久性泡沫产生, )醋酐浓硫酸试验(Liebermann-Burchard反应)，皂角浸液5ml，于蒸发皿(3 中在水浴上蒸干，加入1ml醋酐使其溶解，滴于干燥比色盘中，从边沿缓缓滴加浓硫酸1滴，观察颜色变化。 另取薯蓣浸液5ml，置于蒸发皿中，在水浴上蒸干，加入1ml醋酐溶液，并倾入比色盘中，(试管)沿管壁加入几滴浓硫酸，观察界面间是否有紫红色环产生, (4)氯仿—浓硫酸试验(Salkowski反应):取薯蓣醇浸液2ml，在水浴上蒸干，有氯仿1ml溶解，转入干燥小试管中，沿壁小心加浓硫酸1ml，氯仿层显红或兰色，硫酸层有绿色荧光，示含甾体皂苷。 香豆精苷的鉴别 1(检品溶液的制备: 取秦皮2克，加入乙醇20ml，在水浴上回流10分钟，趁热过滤，滤液供鉴别用。 2(鉴别试验: (1)内酯化合物的开环与闭环反应:取2ml乙醇浸出液，加1—2ml 1% NaOH，于沸水浴中煮沸3分钟，冷却后加新配制的重氮化试剂1~2滴，显红色。 (2)肟异羟酯酸铁试验:取香豆素少许，加酒精1ml溶解加6滴盐酸羟胺的饱和乙醇液混匀后加入6滴KOH的饱和乙醇液，使其显强碱性再转入试管中加热10分钟左右(有气泡产生)，冷却加5%盐酸使呈弱酸性(Ph6左右)，倾入比色盘或蒸发皿中，沿器壁滴10%FeCl3溶液，约半分钟后紫色出现或加深(后消失)。(此反应试酯、内酯、香豆精及其苷类。但用中草药浸液试验反应结果不太明显)。 氰苷的鉴别 取苦杏仁4~5粒，研碎，置50ml锥形瓶中加入5%的硫酸溶液3ml，充分混合，塞好，进行以下(1)、(2)反应。 (1)苦味酸钠试验:取滤纸条先滴加饱和苦味酸液侵润，稍干后，再滴加10%碳酸钠1~2滴润湿，干后，悬于上述锥形瓶中，在水浴上加热10分钟，滤纸渐变为橙色或砖红色。 (2)取滤纸条先滴加3~4滴愈创木树酯醇溶液润湿，干后，再滴加1%硫酸钠液3~4滴润湿后，悬于同一锥形瓶中，放置，滤纸条渐变为鲜兰色(放置过入色渐褪)。 (3)亚铁氰化铁反应(普鲁士兰反应):另取苦仁一粒研碎，放入试管中，加水1~2滴润湿(切勿过量)，立即用已被10%NaOH试剂1滴湿润的滤纸条悬于 38 管口置50?水浴上约10分钟，将滤纸取出，于滤纸上加10%FeSO4液1滴，加10%HCl1~2滴及1%FeCl3，试液1滴即显兰色。 挥发油的定性鉴别 1(外观性状: (1)取各种挥发油(松节油、薄荷油、丁香油、陈皮油及桂皮油)观察其色泽，是否有特殊香气，及辛辣烧灼味感。 (2)挥发性:取滤纸屑一小块，滴加薄荷油一滴，放置2小时或微热后观察滤纸上有无清晰的油迹(与菜油作对照实验)。 )pH检查:(检游离酸或酚类)。 (3 取样品一滴加乙醇5滴，以预先用蒸馏水湿润的广泛pH试纸进行检查，如显酸性，示有游离的酸或酚类化合物，剩下的样品乙醇液供下面(7)(8)试验用。 (4)FeCl3反应(检酚类): 取样品一滴，溶于1ml乙醇中，加入1%得FeCL3醇液1~2滴，如显蓝紫或绿色，示有酚类。 (5)苯肼试验(检酮、醛类) 取2，4—二硝苯肼试液0.5~1ml，加1滴样品的无醛醇溶液，用力振摇，如有酮醛化合物，应析出黄一橙红色沉淀，如无反应，可放置15min后再观察之。 (6)荧光素试验法: 将样品乙醇液滴在滤纸上，喷酒0.05%荧光素水溶液，然后趁湿将纸片暴露在5%Br2/Col4蒸汽中，含有双键的萜类(如挥发油)呈黄色;背景很快转变为浅红色。 (7)香荚醛——浓硫酸试验: 取挥发油乙醇液一滴于滤纸上，滴以新配制的0.5%香荚醛的浓硫酸乙酸液，呈黄色、棕色、红色或兰色反应。 鞣质类化合物的鉴别 1(检品溶液的制备: 取五倍子(含可水解鞣质)，儿茶(含缩合鞣质)，没食子酸(鞣质水解产生伪鞣质)少量(约0.1克)分别置大试管中，加蒸馏水约10ml，加热煮沸，过滤，滤液作以下试验: 2(鞣质的一般反应(鞣质与伪鞣技的区别鉴定) (1)感观试验:取制备的鞣质和伪鞣质溶液，尝其味，并以石蕊试纸检查溶液是否呈酸性反应。 (2)三氯化铁反应:取制备的鞣质溶液(五倍子溶液或儿茶溶液)及伪鞣溶液(食子酸溶液)各1~2ml ，分别加入三氯化铁试液,鞣质产生绿色或兰黑色反应或沉淀;伪鞣质产生兰色反应。 (3)沉淀蛋白反应:取鞣技溶液及伪鞣质溶液各1~2ml，分别入明胶溶液数滴，鞣技立刻产生沉淀反应。 (4)生物碱反应:取鞣质溶液及伪鞣质溶液各1~2ml，分别滴加0.1%咖啡碱水溶液，鞣质液产生沉淀反应，伪鞣质不产生沉淀反应。 3(可水解鞣和缩合鞣质的区别鉴定 (1)鞣红反应:取五倍子浸液(含可水解鞣质)，儿茶浸液(含缩合鞣质)各2ml，分别加盐酸0.5ml，加热煮沸30分钟左右放冷。可水解鞣质不发生沉淀， 39 缩合鞣质有红色沉淀产生。 (2)三氯化铁反应:取五倍子浸液及儿茶浸流各1~2ml，分别加入三氯化铁试液数滴，可水解鞣质显兰色或黑兰色反应，缩合鞣质显黑绿色反应。 (3)溴水反应:取五倍子浸液用儿浸液各1~2ml，分别加入溴水数滴，可水解鞋帽质不产生沉淀反应，缩合鞣质产生沉淀。 (4)石灰水反应:取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加入新制石灰水数滴，可水解鞣质显青灰色沉淀，缩合鞣质显棕色沉淀。 (5)醋酸溶液中与醋酸铅反应:取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加醋酸液数滴，摇匀后再分别滴加醋酸铅溶液数滴，可水解鞣质产生絮状沉淀，缩合鞣质无沉淀产生。 40 41 42