木糖发酵酵母Pichia stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿酒酵母中的表达

。 。 慧 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．29 No．6 木糖发酵酵母 Pichia stipitis木糖还原酶基因 XYL 1在酿酒酵母中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 陈叶福 王正祥 方慧英 诸葛健 (江南大学教育部工业生物技术重点实验室，无锡，214036) 摘 要 通过 PCR方法克隆得到树 干毕 赤氏酵母木糖还原酶(XR)基 因 XYL1。将该基 因 连入酵母表达载体 pYX212的强启 动子磷 酸丙糖异构酶(TPI)启动子下，得到融合表达 载体 pYX—XYL1。通过 电转化 方法将 pYX—XYL1转入酿酒酵母 Saccharonmyces cerevisiae W303— 1A中，酶活测定表 明，在酿酒酵母 中树干毕赤氏酵母木糖还原酶(xR)基 因 XYL1得到活性 表达。2酿酒酵母转化子粗酶 液 中木糖还原酶 活分 别为 0．89u／mg(蛋 白)和 0．83u／ITlg(蛋 白)，为供体菌 的 1．5倍 多。与基 因供体菌不 同，木糖还原酶基 因在酿酒酵母 中表达不需木糖 诱导，为组成型表达。树干毕赤 氏酵母木糖还原酶(XR)基 因 XYL1的成功表达为后 续的利 用木糖的酿酒酵母菌株 的构建奠定了基础。 关键词 树干毕赤氏酵母，木糖还原酶，酿酒酵母，基因表达 木质纤维素类物质是地球上最主要的可 再生资源。将木质纤维素生物转化生成 乙 醇，可以缓解石油 日益枯竭的压力，同时具有 绿色环保的社会效益。木质纤维 素由纤维 素、半纤维素和木质素 3种成分构成。其中 纤维水解得到葡萄糖，可为微生物直接利用。 而含量仅次于纤维素的半纤维素水解后其产 物中除了葡萄糖外，另一种主要成分是 D 木 糖，最高可 占半纤维 素水解糖类的 34％【11。 因此如何将木糖生物转化生成乙醇是实现木 质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节。许 多细菌、酵母和真菌可以发酵木糖产生乙醇。 但是伴有大量副产物生成并 且木糖 利用缓 慢，无法满足商业化乙醇生产的要求L2】。一 般而言，酵母通过 2步反应将木糖转化成木 酮糖。在第 1步反应中，以 NADPH[／NADH 为辅酶，在木糖还原酶催化下木糖被还原生 成木糖醇，接着木糖醇再 以 NAD为辅酶。通 过木糖醇脱氢酶被氧化生成木酮糖。而在细 菌中，木糖经过木糖异构酶一步反应生成木 酮糖。无论在酵母中还是在细菌中，木酮糖 都会被木酮糖激酶磷 酸化生成 5一磷酸木酮 第一作者 ：博士研究生。 收稿时间：2002—09—13。改 回时间：2002—11—06 14 糖，5 磷酸木酮糖再进入磷酸戊糖途径而进 一 步代谢L 3l。 酿酒酵母具有耗糖快 、乙醇耐受力高、对 水解糖液中有毒物质抗性强等优点，一直是 乙醇生产中最常用菌种。酿酒酵母不能利用 木糖L4】，却能利用木酮糖。因此。可 以将 细 菌或酵母中木糖到木酮糖的代谢步骤引入酿 酒酵母中来构建利用木糖的酿酒酵母。将不 同细菌的木糖异构酶基因导入酿酒酵母中构 建木糖利用酵母均未获得成功[ ·引。许多学 者尝试将树干毕赤氏酵母的木糖还原酶和木 糖醇脱氢酶途径导入酿酒酵母中并获得一定 成功。文中将树干毕赤氏酵母的木糖还原酶 基因导入酿酒酵母中，并得到活性表达。 1 材料与方法 1．1 材 料 1．1．1 菌株 和载体 大 肠 杆 菌 宿 主 菌 株 Escherichia coli M109，酿酒酵母宿 主菌 株为 Saccharomyces cerevisiae W303—1A，由本实验室保藏。树干 毕赤氏酵母 Pichia stipitis CBS 5773(NRRL 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 29卷 第 6期 陈叶福等 ：木糖发酵酵母 Pichia stiIMtis木糖还原酶基因 XYL1在酿酒酵母中的表达 Y一7124)由美国农业部微 生物基 因组学和 生物工艺学研究室 Kurtzman教授惠赠。酵 母表达载体 pYX212为 Novagen公司产品， 带有 TPI强启动子。 1．1．2 培养基和培养条件 大肠杆菌 E．coli JM109及转化子为 LB 培养基，37℃静止和振荡培养。酵母菌及转 化子为 YEPD培 养基或 YNB培养基，30℃ 静止或振荡培养。 1．1．3 酶、抗生素及试剂 实验所用 DNA聚合酶和限制性 内切酶 为宝生物工程(大连)有限公司产品。抗生素 为华美生物工程公 司产品。PCR产物纯 化 试剂盒、胶回收试剂盒为上海华舜生物工程 有限公司产品。所用试剂为分析纯。 1．2 实验方法 1．2．1 P． NRRL Y一7124 基 因 组 DNA的制备 按参考文献[7]的方法进行。 1．2．2 引物设计及 目的基 因 PCR扩增 根据 NCBI公布的 P． 木糖还原 酶基因XYL1的序列信息设计下列引物 引 物 P-f： 5’一CGC n CTAT一 ’A 4G丁 A．3 引 物 P-r： 5’一GAAoG( CCAGAACA— GAGTTCA(、广3’ 其中引物 P-f的 5’端引入了 BamHI位 点，引物 P—r的 5’端 ApaI位点。 PCR扩增条件 ：100t~L反应体系。94℃ 变性 10min，加入 TaKaRa Ex Taq DNA聚合 酶 2单 位，混合 后加 入 30 L矿 物油 进 行 PCR反 应(9413 ，60s；58℃，60s；72℃ ，120s)， 经过 30个循环后，72℃延伸 10min。 1．2．3 DNA 重 组、大 肠 杆 菌转 化 及 阳性 转 化子 筛选 PCR扩增产物经 PCR产物纯化试剂盒 纯化，BamHI、ApaI酶切电泳分离 回收约 1．6kb的 PCR产物与经相同酶切的 pYX212 连接后 转化大肠 杆菌 JM109，在含 100／~g／ mL氨苄青霉素的 LB平板上检出转化子，提 取质粒，酶切电泳鉴定。 1．2．4 酿酒酵母转化及重组子的筛选 酵母转化按改进的电穿孔法[ 】进行，转 化后涂布不含尿 嘧啶的 YNB葡萄糖平板 ， 挑选阳性重组子进一步测定其木糖还原酶酶 活 。 1．2．5 酶 粗提液 的制备 接种划线分离 的酶母 转化子 单菌落入 20mL YNB(不含尿嘧啶)液体培养基，30℃， 200r／min摇床培养至对数中后期，接种 5mL 入 50 mL的 YNB(不含尿嘧啶)液体培养基 中，30℃，200 r／min摇床培养至静止期。离 心收 集菌体，用 10 mmol／L，pH7．4的 (含 EDTA 1retool／L)磷酸钾缓冲液洗涤 1次，离 心后用适量 100 mmol／L，pH7．4的磷酸钾缓 冲液重悬菌体。吸 1mL菌悬液到装有 1mL 玻璃株 (0．1 ram)的破壁专用管 中，破 壁器 (BE BEATER)4600 r／rain破壁 30 S，冰 浴冷却 1rain，重复破壁 6次。破壁后高速离 心，上清液即为酶粗提液用于酶活和蛋白含 量测定。 1．2．6 木糖还原酶酶活测定 用分光光度计在 340 nln处测定 NADH 依赖的木糖还原酶活力。反应体系中包括 ： 100mmol／L 的 磷 酸 钾 缓 冲 液 (pH7．4)， 0．2mol／L木糖，0．15 retool／L辅酶 NADH。 加入适 量的粗酶液 启动 反应。比酶活 (U／ rag)用每毫克总蛋 白每分钟 内氧化 NADH 生成 NAD的微摩尔数表示。 粗酶液中的蛋 白浓度用 Bradf0rd【9】方法 测量，以牛血清蛋白作为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 2 结果与讨论 2．1 P．sti tis木糖还原酶基因的克隆及酵 母表达载体的构建 以 P．stipitis NRRL Y-7124 基 因 组 DNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，用 引物 P—fl和引物 P'r2进 行 PCR反应，PCR产物经 电泳表明，在 1．6kb 左右有一 明显条带，非特异性扩增不 明显。 将 PCR产物用 BamHI、ApaI双酶切、胶回 】5 趼 蠢 缀 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．29 No．6 收纯化后与经 BamHI、ApaI双酶切，胶 回 收的酶母表达载体 pYX212大 片段连接 (如 图 1所示)，转化 E．coli JM109，挑选 阳性转 化子抽提质粒进行酶切鉴定(图 2)。 图 1 表达载体 pYX—XYLI的构建 kb 23 9．4 6．6 4-4 2．3 2．0 kb 2．0 1．0 0．75 O．5 0I2 0．1 1一pYX212／BamHI：2一XDNA／Hind m Marker； 3一pYX-XYL1／BamH1+ApaI： 4—-DL2000 Marker；5—-pYX—。XYL1／EcoRI 图 2 重组表达载体 pYX．XYL1的酶切鉴定 2．2 表达载体 pYX．XYL1的酶切鉴定 将 表 达 载 体 pYX．XYL1用 BarnHI、 A抛 I双酶切，应释放 出 1．6kb的没有启动 子的 XYL1结构基因；用 EcoRI酶切，应释 放 出 600 bp的特征片段。电泳结果与分析 结果相同，证明质粒构建成功。 2．3 P．stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿 16 酒酵母 W303．1A中的表达及重组子 的木糖 还原酶酶活测定 将重组表达载体 pYX．XYL1用 电穿孔 转化 法 转化 尿 嘧啶 营 养缺 陷 型 酿酒 酵 母 W303．1A。以不含尿嘧啶的 YNB平板筛选阳 性 重 组子，重 新 划 线 分 离 后 挑 选 重 组子 WXY1．1T WXY1．2测 定其 木 糖还 原 酶 酶 活。结果如表 1所示。 表 1 重组子的木糖还原酶酶活测定结果 壁堡堕堡 P．stip／t／s W 303一JA 。 X纥 1．1 X ￡1—2 CBS5773 ：糖还原酶 酶活／ 0．O1 0．56 0．89 0．83 U．m —l 从酶活测定结果 中可以看出，宿主菌株 S．cerevisiae W303．1A中基本没有木糖还原 酶活。重组子 WXY1．1和 WXY1．2的木糖 还原酶 比酶活分别为 0．83U／mg(总蛋白)和 0．89U／mg(总蛋白)，分别为基因供体菌 P． stipits CBS 5773的 1．5倍和 1．6倍。另外， 木糖 还 原酶 基 因 的表达 在 P．stipits CBS 5773中需要木糖诱导，但是在 S．cerevisiae W303．1A中却为组成型表达，培养基中不需 添加木糖，在葡萄糖培养基 中即可测得木糖 还原酶酶活。 文中根据发表的木糖还原基因序列，证 明该基因不含 内因子。将克隆得到的没有 5’上游序列的木糖还原酶结构基因与酵母强 启动子磷酸丙糖异构酶 (TPI)启动子融合， 构 成 融 合 表 达 载 体 PYX．XYL1。 pYX． XYL1转化实验室酵母 S．cerevisiae W303 — 1A，酶活测定结果表明，P．stipits木糖还 原酶基因在酿酒酵母中得到活性表达。其 比 酶活是 基 因供体 菌 P．stipits CBS 5773的 1．5倍多，而该基因在 自身启动子下的表达 水平仅为 P．stipits CBS 5773的 0．7倍。这 表明结构基 因与 TPI启动子的融合提高 了 该酶的表达水平。P．stipits木糖 还原酶 基 因在酿酒酵母中的成功表达后为后续利用木 糖酿酒酵母菌株的构建奠定了基础。 醑 掇 蠢 嬖 空 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 29卷 第 6期 陈叶福等：木糖发酵酵母 Pichia stipitis木糖还原酶基 因 XYL1在酿酒酵母 中的表达 参 考 文 献 1 Schneider H． CRC Crit Rev Biochem Mol Bio1． 1989，9：1～ 40 2 Slininger P J et a1．Bioteehnol Lett，1985，7：431 ～ 436 3 JeffriesTW ．AdvBiochem Eng，1983，27：1～32 4 Barnett J A． Adv Carbo hydr Chem Biochem， 1976，32：126～ 128 5 Sarthy A V et a1．Appl Enviro Mierobiol， 1987， 53：1996～ 2000 6 Amore R， W ilhelm M ， Hollenberg C P．App1． 碣 M icrobiol Biotechnol，1989，30：351--357 叠 7 A．亚当斯等著 ．刘子铎译 ．酵母遗传学方法实验 指南 ．北京 ：科学出版社，2000 8 Beeker D M ， Guarente L． Methods Enzymol， 1991，194：182～ 187 9 F．奥斯伯等著．颜子颖，王海林译 ．精编分子生物 学实验指南 ．北京：科学 出版社，1998 Expression of Pichia stipitis Xylose Reductase Gene XYL 1 in Saccharomyces cerevisiae Chen Yefu W ang Zhengxiang Fang Huiying Zhuge Jian (Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education， Southern Yangtze University，Wuxi，214036) ABSTRACT Pichia stipitis Xylose Reductase(xR)Gene XyL 1 was amplified by PCR．The XyL 1 gene were placed under the triose phosphate isomerase(TPI)promoter in yeast vector pYX212 to produce the fusion expression vector pYX—XYL1．PYX—XYL1 was transformed into Saccharomyces cerevisiae W 303—1A by electroporation．Transformants of S．cere~siae contain— ing XYL 1 of P．stipitis synthesized an active XR．Specific XR activities of two transformants were 0．89U／mg protein and 0．83U／rag protein respectively，which were more than 1．5 times of that of P．stipits CBS 5773 strain．Compared with P ．stipitss CBS 5773．the XyL 1 in S．cere— visiae transformants expressed co nstitutively and did not need xylose for induction． Key words P．stipitis，Xylose Reductase(XR)，Saccharomyces cerevisiae，gene expression 本 }I 我国啤酒市场近况浅析 2002年下半年以来，国际大麦市场行 情迅猛上涨，往年 澳大利 亚大麦进 口价为 l4 00元／t， 2003年预计旺季之前，这个价格将突破 3 000元／t的高价。啤酒原料价格涨 了一倍 多，但 国内啤酒厂 商在即 将到来的啤酒销售旺季却不见涨价行动。而且，在高成本之下，高档啤酒市场却初见往年少有的“战火”，啤酒 市场愈加扑朔迷离。 有关人士分析，啤酒行 业 7～8月份 的销售 旺季印将到来，此次国际啤酒大麦减产将促使国内啤酒行业进 行一次大洗牌。据 了解，从 2002年 8月份开始，国际啤酒大麦市场行情迅猛上涨。而中国是大麦市场最大的 买家，购买量 占全球贸易总量 的一半。对于年产量在 10万 t左右的中型啤酒厂家来说，大麦涨价，为啤酒生 产企业带来了相 当大的压力。我国是世界上最大 的啤酒 生产 国，预计 2003年产 量将达到 2 500万 t。按 照 2002年 我国啤酒产量 2 386万 t计算，全国啤酒企业需要消耗 235万 t麦芽或 299万 t啤酒大麦，其中需要进 口啤酒大麦 200--250万 t。但仅能供应我国 150万 t，相差约80万 t。因此可推论，成本上升导致的国内啤酒 业在原料价格高涨、终端产 品市场竞争激烈，提价无力 的双重压迫下，在 2003年 7、8月份啤酒消费 旺季将 出 现新的行业洗牌，因而啤酒厂商都不敢轻言涨价。 目前 国内啤酒企业应对进 口大麦短缺危机 的做 法主要有 2种 ：一是预先将 自己一年所需的麦芽数量提前 订下来，但这 需要承担较高的成本 ；二是用低 品质的饲料大麦或者 国产大麦，甚至糖浆替代进 口啤麦，以降低 企业成本，静待新 的大麦供应。 国产啤酒并非不可使用 国产大麦，但也必须承认，由于品质 问题，国产大麦 日 前只用于生产低档啤酒，且国产大麦产量很低 ，大量中高档啤酒仍 需要使用高品质 的进 口大麦。 17 麓 维普资讯 http://www.cqvip.com