雷帕霉素联合伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的影响

雷帕霉素联合伊马替尼对K562细胞内SHIP基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响 雷帕霉素联合伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的 影响 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。 本学位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与 学位论文主要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试 验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 、原始数据、申报的专利等知识产权归河北医科大学所有。 否则,承担相应的法律责任。 研究生妊谢导师签章黩 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除 了文中特别加以标注等内容外,文中不包括其他人已经发表或撰写 的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写, 文责自负。 研究生签名:?百袈 一章:糁 确?年弓月?易日目 录 中文摘要??】 英文摘要研究论文雷帕霉素联合伊马替尼对细胞内基因表达的影响 ??.一 刖舌材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ?. 结果.. 附图?.. 附表 讨论.. 结论.. 参考文献??.. 综述慢性粒细胞白血病基因治疗研究进展致谢. 个人简历?.中文摘要 雷帕霉素联合伊马替尼对细胞内基因表达的影响 摘 要 目的:慢性粒细胞性白血病池为多能造血干细胞恶性增殖性 疾病,是慢性白血病中常见的一种类型,号和号染色体易位,形成 融合基因,导致酪氨酸激酶活性增加,这是慢性粒细胞白血病 的发病 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 【。.传统治疗药物羟基脲、沙利度胺、干扰素等虽然在一定时 期内可以改善患者症状,但不能治愈本病,也不能从根源上阻断疾病进展。 绝大多数患者在经过一段时期的慢性期后,进入加速期或急变期,最终因 感染或骨髓衰竭等并发症而死亡。 ,, 伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂 它对激酶升高的白血病细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用,目前 已经作为治疗慢性粒细胞白血病的一线药物应用于临床。但在临床中发 现,虽然伊马替尼对慢性粒细胞白血病慢性期有很好的治疗效果,很多患 者可以实现基因和费城染色体的转阴,但仍有部分患者出现耐药。 研究证实/激酶可以激活细胞内多种信号通路,影响细胞周期分布 以及细胞凋亡等,导致慢性粒细胞白血病发病。其中,雷帕霉素靶蛋白 信号通路在慢性粒细胞白血病对耐药机制中发挥重要作 用,抑制信号通路的异常激活有可能增强/激酶阳性细胞对 的敏感性.雷帕霉素是途径抑制剂,人们发现其具有免疫抑 制和抗肿瘤的双重功效,并且在临床上也已经应用于某些实体肿瘤的治 疗,由此其在治疗造血系统恶性肿瘤方面的作用也正在被越来越多的人关 注和研究。 本课题组在长期从事白血病中信号转导作用机制的研究基础上,已经 研究发现融合基因存在时,基因的表达受到抑制,提示 基因缺失或功能受抑是慢性粒细胞白血病发病的重要环节。 目前临床应用伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白血病的一线用药,其疗 效显著,但患者发生耐药的问题也不容忽视。慢性粒细胞性白血病的发病 机制是融合基因编码的蛋白的酪氨酸激酶被异常激活,进而 导致疾病的发生。因此一旦酪氨酸激酶蛋白浓度增加,细胞便会被重新激中 文摘要 活过度增生,患者发生耐药。多种研究表明患者对伊马替尼发生耐药是多 种机制的综合结果,且过程复杂,其具体机制也有待研究。针对其耐药的 发生,我们可以联合传统的化疗药物,也可以联合其他信号转导抑制剂来 发挥协同治疗作用。 研究表明//途径是/融合基因下游的一条重 要通路【】,本实验拟在探讨雷帕霉素是否可以通过抑靶点的活性从 而抑制白血病细胞株的生长,探讨通路抑制剂雷帕霉素对慢性粒 细胞白血病细胞系细胞生长增殖与凋亡的生物学影响及细胞 中基因表达情况,探讨通路抑制剂雷帕霉素与酪氨酸激酶抑 制剂伊马替尼在慢性粒细胞性白血病的治疗中是否存在协同作用,为临床 治疗慢性粒细胞白血病探索新的方法和策略。 方法: 法检测不同浓度的雷帕霉素和伊马替尼单药及不同浓度伊马 替尼联合单一浓度雷帕霉素对细胞增殖的影响。 流式细胞分析法检测不同浓度的雷帕霉素和伊马替尼单药及二者 联合应用对细胞凋亡的影响。法检测基因在蛋白水平上的表达。 .检测各组细胞表达变化。 统计学处理。 结果: 雷帕霉素对细胞增殖和凋亡的影响 不同浓度的雷帕霉素作用于细胞后,发现雷帕霉素抑制 / 细胞增殖,并呈剂量依赖性,、、、、、 处理组细胞存活率均明显低于溶剂对照组氏.。在一 /浓度范围内,随着雷帕霉素浓度的升高细胞存活率均明显降 低。而、.、./浓度雷帕霉素处理组对细胞存活率无 明显影响胗.,其为./。 雷帕霉素处理后,形态学观察发现细胞出现典型的凋亡, 表现为胞膜完整,核固缩或核碎裂,可见凋亡小体。流式细胞分析显示, 处理组/期细胞比对照组显著增多,而期细胞比例则明显降低 尸.。提示雷帕霉素可显著影响细胞周期分布,诱导细胞/中文摘要 期阻滞。 伊马替尼抑制细胞增殖诱导其凋亡 不同浓度的伊马替尼作用于细胞后,发现伊马替尼抑制 细胞增殖,并呈剂量依赖性,、、、/处理组 / 细胞存活率均明显低于溶剂对照组氏.。在~ 浓度范围内,随着伊马替尼浓度的升高细胞存活率均明显降低。 雷帕霉素能增强伊马替尼对细胞的促凋亡作用 选择低于剂量的/的雷帕霉素和不同浓度伊马替尼联合 作用于细胞,联合用药组的细胞生长抑制率与两单药组比较均有统 计学差异俨.,说明雷帕霉素和伊马替尼联合作用在细胞上时, 可产生增强效应。 雷帕霉素对细胞内表达的影响 蛋白分子量为 ,经.电泳、转膜后,空白对 照组、药物处理组均在 位置出现荧光条带。设定为内参 基因,定量分析荧光条带,结果表明,雷帕霉素处理后对细胞内 蛋白的表达无明显影响胗.,但对降低细胞内 蛋白磷酸化水平的效果明显氏.。 雷帕霉素对细胞内基因蛋白的影响 结果显示,白血病细胞株细胞内蛋白无表达,经雷 帕霉素处理后细胞内表达蛋白,且呈现浓度依赖性,随着雷 帕霉素浓度的增加,蛋白表达增加。 雷帕霉素对细胞内基因表达的影响 结果显示不同浓度的雷帕霉素作用细胞,基因 表达水平均比对照组表达量增高.,且随着雷帕霉素浓度的增加 而表达量增加。 伊马替尼对细胞内基因表达的影响 结果显示,不同浓度的伊马替尼作用于细胞后, 基因表达水平均比对照组表达量增高氏.,且随着伊马替尼浓度的 增加而表达量增加。 雷帕霉素联合伊马替尼对细胞内基因表达的影响中文摘要 结果显示两药联合作用于细胞,基因表达量均 较单药作用后表达量高氏.。 结论: 雷帕霉素在一定浓度范围内能有效抑制细胞增殖,并呈浓度 依赖性,并促进其凋亡,并使细胞内基因表达量增高,提示雷 帕霉素可抑制慢性粒细胞白血病细胞的增殖。 伊马替尼在一定浓度范围内能有效抑制细胞增殖,促进其凋 亡,并使细胞内基因的表达水平上升。 雷帕霉素联合伊马替尼在抑制细胞增殖,促进凋亡和使 基因表达水平上方面均明显优于单药,表明雷帕霉素能增强伊马替尼抗 细胞作用,对慢性粒细胞白血病的治疗可以在应用伊马替尼作为一 线治疗药物的同时尝试联合应用雷帕霉素,以减少慢性粒细胞白血病患者 对伊马替尼的耐药性,且亦可深入研究基因在慢性粒细胞白血病发 病中的机制,为白血病的基因治疗提供科学的理论依据。 关键词:雷帕霉素;伊马替尼;基因;细胞,慢性粒细胞 白血病英文摘要 : , , , ? , ,. ,,,, ’, , ., .? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ’ ? ? ? ’ 一 ,, ?, , . , ,? , . / , ,.,. 阻 / , ., ,, ,,, . . ,口 唧 , .。, , . // / 【, ? ? ? 一,, . ,? :订 /.’。 。. 。 ‘: : . 口 . 英文摘要 ????????????????????????????????????????????????????????一 .,, ? , , , , . ,., 俨..,,, , ., , 俾., . , 俨., .。 , 俨.. :, , ,英文摘要., , .,, ? , , , .; ; :;; 研究论文 雷帕霉素联合伊马替尼对细胞内基因表达的影响 前 言 慢性粒细胞白血病池是起源于造血系统的恶性肿瘤,髓内造 血细胞分化受阻、细胞增殖过度、并浸润髓外器官,造成正常造血受抑及 多系统器官功能障碍,患者进行性衰竭,最终死亡。各年龄人群均可发病, 严重影响人民身体健康及生活质量。传统治疗药物虽能改善患者症状,但 经历一段时间后仍不可避免的走向加速期和急变期,不能从根源上解决治 疗问题。 因而急需寻找有效的抗癌药物及其联合治疗方案以提高慢性粒 细胞白血病的疗效并改善患者预后。 ,, 伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂 它对激酶升高的白血病细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用,目前 已经作为治疗慢性粒细胞白血病的一线药物应用于临床。但在临床中发 现,虽然伊马替尼对慢性粒细胞白血病慢性期有很好的治疗效果,但仍有 患者发生耐药,研究证实/激酶可以激活细胞内多种信号通路,影 响细胞凋亡以及细胞周期分布等,导致慢性粒细胞白血病发病。其中,雷 帕霉素靶蛋白信号通路在慢性粒细胞白血病对耐药机制 中发挥重要作用,抑制信号通路的激活有可能增强/激酶阳 性细胞对的敏感性,在慢性粒细胞白血病的治疗中发挥协同作用。 基因位于 人类染 色体..,是继基因后发现的又一个肌醇磷酸酶,广泛表达 于造血细胞。可特异地清除磷脂酰肌醇激酶代谢产物, 使其下游信号分子的磷酸化受到抑制。这些研究表明,基因可 能对造血系统恶性肿瘤的发生、发展起着关键的负调控作用。 雷帕霉素是通路抑制剂,用于一些实体肿瘤如非小细胞肺癌 等的治疗或与其它药物联合已经有所报道,但在慢性粒细胞性白血病的治 疗尤其是与一些化疗药物的协同效应的报道很少见。鉴于雷帕霉素对肿瘤 细胞具有抑制增殖,诱导凋亡的抗肿瘤特性,且已经临床应用实体肿瘤的 治疗,将其用于慢性粒细胞性白血病的研究不失为一种合理的选择。 为进一步在基因水平明确雷帕霉素联合伊马替尼对白血病细胞增殖研究论 文 及促凋亡的机制,本实验拟采用雷帕霉素联合伊马替尼作用于细胞, 观察两药单用及联合应用对细胞增殖抑制、诱导凋亡作用,阐述雷 帕霉素联合伊马替尼对细胞内抑癌基因表达水平的影响,从 基因学水平探索慢性粒细胞白血病治疗的新方法及减少对伊马替尼耐药 的发生,为慢性粒细胞白血病的治疗提供理论依据。 材料与方法 材料 .器材 仪器名称与型号 产地 。低温冰箱 海尔公司 一?低温冰箱 日本公司 一?低温冰箱 日本公司 德国公司 台式离心机 低温高速离心机 德国公司 平板离心机 白洋离心机厂 .手掌型离心机 江苏海门麒麟医用仪器厂 电泳仪?型 北京六一厂 酶标仪 哈尔滨东联公司 扩增仪 美国公司 紫外透射仪 上海天能公司 美国公司 读胶仪 紫外分光光度计 北京普析通用仪器公司流式细胞仪 美国公司 微量加样器 苏兰公司 刃、二 公口 快速混匀器 常州国华仪器有限公司 数显恒温搅拌循环水箱 常州国华仪器有限公司 德国公司 培养箱 倒置相差显微镜 日本公司 普通光学显微镜 日本公司研究论文 电子天平 德国公司 电子天平 德国公司 超净台 日本公司 .型桌上式洁净工作台 苏州净化设备有限公司 电热恒温干燥箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司 高压灭菌锅 日本公司 制冰机. 日本公司 核酸蛋白测定 美国.公司 仪 气浴平板摇床, 细胞培养瓶 美国公司 孔细胞培养板 美国公司 孔细胞培养板 美国公司 孔细胞培养板 美国公司 一次性塑料离心管 , 管 , 细胞冻存管 , .试剂 名称 产地 水 美国公司 美国公司 .逆转录酶 美国公司 脚 美国公司 美国公司 随机引物 美国公司 引物 北京赛百盛公司 聚合酶 美国公司北京鼎国生物公司 琼脂糖 美国公司 碱 美国公司 美国公司研究论文 唑兰甲基偶氮唑兰,检测细胞增殖 取对数期生长的细胞,调整细胞密度为 /,接种于孔无菌培 养板中,每孔体积耻,在细胞中加入雷帕霉素终浓度分别为, .、.、、、、、、/,或加入伊马替尼终浓 /或加入雷帕霉素联合伊马 度分别为、、、、 替尼,设溶剂对照孔,每个浓度设三个复孔。在。、%条件下孵育 ,然后加入 ,吸弃孔内上清液,每孔 /的 孵育 加入 处测值, 山,于摇床上震荡十分钟,于波长 实验重复三次,取各复孔的均值绘制生长曲线,计算细胞存活率。 计算公式: 细胞存活率%实验组值/对照组值%。 .流式细胞检测凋亡 采用/法测定细胞凋亡,取对数生长期的细胞,以 /的密度接种于孔无菌培养板,每孔 ,在细胞中加入 终浓度分别为,, /的雷帕霉素,或伊马替尼、、 /,或加入雷帕霉素联合伊马替尼//, / / /, /,均设溶剂对照孔,在 ?、%条件下培养 ,收集细胞上流式细胞仪检测。 测定方法及检测步骤: 取药物干预后的待测细胞调整密度约为个/; , 取 细胞至高压灭菌后离心管中, ,。离心 弃上清; 加入 冷的,制成单细胞悬液; ,弃上清; ,?离心 加 重悬细胞,将细胞转入透明流式上机管中; .,混匀,避光室温下孵育,加 加入山 ,上 入山,混匀避光下反应分钟,后加入山 流式细胞仪分析。 . 法检测蛋白的表达 离心收集经雷帕霉素处理的细 ..细胞总蛋白的提取: ,研究论文 后 胞,洗涤两次,将其悬于“裂解缓液中,冰浴静置 ? ,收集上清用考马斯亮兰蛋白定量试剂盒定量, 离心 蛋白定量后于.?冰箱保存备用。 ..蛋白定量 用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒定量蛋白,用蒸馏水将贮备液 倍稀释,取试管并进行编号,每管均加入应用液,空白管中加入蒸 馏水山,标准管中加入蛋白标准山,剩余管中加入生理盐水“ ,在分光光度计的波长 // 及待测定标本山,震荡混匀并静置 处,读取各管的值。计算各蛋白样品的浓度。于%.电 泳,再经转膜、抗体孵育后显影,对目的蛋白分析。实验重复次。 计算公式: 蛋白含量测定管值/标准管值×标准管浓度, .逆转录聚合酶链反应 .. 的提取 常规,离心收集后经过不同药物浓度处理的 细胞,转入. 的管中,生理盐水洗涤两次,在约有 ,吹打均匀,使细 ×个单个核细胞的管中加入. 。 胞充分变性,室温静置. , ,冰浴静置 加入?三氯甲烷,剧烈混匀 。 离心 取上清移至新的. 管中,加入等体积异丙醇,颠 ,? 。 倒混匀,冰浴静置 离心 。 弃上清,加 %乙醇洗涤沉淀, 离心 弃上清,沉淀干燥,溶解于山水中。 在冰浴上进行以上操作。取上述山产物经%琼脂糖凝胶电泳含 , 电泳缓冲液为.×,在紫外透射仪上显 示有、部分可见到两条条带,且宽度以及亮度 约为的两倍,说明提取的完整。取总山加蒸馏水至 山,在紫外分光光度计上用等体积的蒸馏水调零,再测量实验样本总 的/比值,逆转录合成选择比值在..之间的标 本。计算浓度后定量。所提取于.?保存备用或进行逆转录研究论文 反应。 计算公式: 浓度蚓山浓度读数/×稀释倍数/。 ..合成 逆转录反应体系共山,取实验用细胞株总 , /~, /随机引物肛, 山,× 山, /山 , .反转录酶山,余用水补足至山。在。中反应 冰浴,。中反应,反应后终止反应。在一? 冰箱保存或进行扩增。 ..实时荧光定量反应 引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与合成 上游引物:. 下游引物:’.. 姆 上游引物:’.,:.’ 下游引物:’.汀, 引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成,的扩增片断长度 ,的扩增片断长度 。 总反应体系为 ,包括逆转录产物. , , /上游引物、下游引物各.“,余用去离子 水补足。 , 热循环参数为:?,然后三步反应:。 ?,。 ,进行个循环,于每个循环的第三步即?收 集荧光信号。 ..实时荧光定量产物的定量分析 在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 过程,反应结束后根据扩增曲线和溶解曲线判断反应质量,方法为 用雷帕霉素单药组,伊马替尼单药组及雷帕霉素联合伊马替尼用药组的 基因的表达量,与溶剂对照组比较进行统计学分析,看其是否具有 统计学意义。值为扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数。研究论文 计算公式: ‘‘‘’?‘’】。 ??待测 待测组目的基因平均值.待测组看家基因平均值 ??对照 对照组目的基因平均值.对照组看家基因平均值 统计学处理 所有数据用次独立实验的平均值表示,实验结果用均数标准差 士表示,两两比较采用法,用 .统计软件进行分析 处理,.有统计学意义。 结果雷帕霉素抑制细胞增殖 用不同浓度的雷帕霉素/、 /、 /作用于 细胞后,发现雷帕霉素以剂量依赖性抑制细胞增殖伊.,。 细胞半数抑制浓度% ,为./。 雷帕霉素作用于细胞系时,随着药物浓度增加,细胞增殖抑制率逐渐 增高:在/,/,/这三个浓度内增殖抑制率两两比 较,差异具有统计学意义尸.、.。 雷帕霉素促进细胞凋亡 雷帕霉素 /处理 ,细胞出现典型的凋亡,其形态 学表现为胞膜完整,核固缩,可见凋亡小体。流式细胞分析仪显示, /、/、/雷帕霉素处理细胞 后, 细胞早期凋亡率分别为..%,.?.%,..%,均明显高 于对照组尸.。流式检测结果表明,//、/ 雷帕霉素处理细胞 后,药物组细胞/期细胞比例明显升高, 而期细胞较对照组比例则明显降低尺., ,提示雷帕霉素可 以影响细胞的周期分布,使得大量肿瘤细胞停滞于/期,不能 进入期进行的合成,抑制肿瘤细胞的增殖。 伊马替尼抑制细胞增殖并诱导其凋亡研究论文 比色法检测结果显示,随伊马替尼的干预浓度/、 /、/增加,细胞增殖明显受抑;说明了伊马替 尼对细胞的增殖抑制作用有明显的浓度依赖性的量效关系。 流式细胞仪检测结果显示,当伊马替尼作用于细胞时,随着作 用浓度的升高,细胞早期凋亡率 阳性、阴性也升高: /、/、/的伊马替尼作用细胞 , 细胞早期凋亡率分别为.土.%、.士%、.%,较对照组明 显升高,两组相比差异具有统计学意义.。 雷帕霉素增强伊马替尼对细胞的促凋亡作用 选择以剂量/的雷帕霉素联合以剂量/、/、 /的伊马替尼,三个联合用药组的细胞生长抑制率与对照组及单 药组比较有统计学差异俨.。评价两种药物是否具有协同作用或者 是拮抗作用按金正钧公式/?×进行计算,式中 为合用药物的有效率,、分别为药、药单独用药的有效率。若 值在.~.范围内,为两药合用单纯相加,值.为增强,值.则 表示两药合用有拮抗作用。经过计算联合用药组 值均大于.,说明 雷帕霉素联合伊马替尼作用于细胞上时,可产生协同效应。/ 雷帕霉素/伊马替尼、/雷帕霉素 /伊马替尼、 /雷帕霉素/伊马替尼三组联合用药作用于细胞 后,细胞早期凋亡率分别为.士.%、.土.%和.土.%,分 别高于相同时间单药组和对照组的凋亡率,说明雷帕霉素可以增强伊马替 尼对细胞的诱导凋亡作用。 细胞中基因的表达变化 .结果表明,经雷帕霉素处理后,细胞中基因的平均 表达水平随着药物作用浓度的增加而升高;且平均表达水平与对照组相比 均有统计学意义.。并且细胞中基因的表达量变化与药 物浓度呈现量效关系,在特定时间下,呈浓度依赖性。 伊马替尼作用于细胞,细胞中基因的平均表达水平随 着药物作用浓度的增加而升高;基因平均表达水平与对照组相比均 有统计学意义尸.。并且细胞中基因的表达量变化与药物 浓度呈现量效关系,在特定时间下,呈浓度依赖性。研究论文 结果显示,/雷帕霉素/伊马替尼、/ 雷帕霉素 /伊马替尼、/雷帕霉素/伊马替 尼三组联合用药作用于细胞,细胞中基因的表达量均上升, 在特定的时间下,呈现浓度依赖性,且三组联合用药组较各个单药组和对 照组两基因的表达有明显的升高,尸.,有统计学意义。在固定雷帕 霉素浓度的同时,随伊马替尼浓度增加,基因表达量上升,且比伊马替尼 各个单药浓度均增加,组间具有统计学意义,说明两药具有协同作用。研究论 文 附 图 , , , 一. . /, %. 土.术.,. . ./ , %. .木氏., . 研究论文 暑 :一。’羔?一: 三 口 。 看 。,,。。一 一 .霉 蚺 : : 《’ : 《 一..:: 山 : 是? 乱 . “。、?。 , %, :;:??: .。 。‘戡 ’ ::?女: : 灌 , 氅; 粤 菸? ’盈 ?‘“。 呵,矿?”》‘ 麓:舀 瓣 ? 枷倒如眄 ?川嚣:‘ ””》??》??》‘. 均 呈 ; : : 寸 生 严 《 《 ‘ : 山 : 皿 .竺 正% 。奠 一; : 、. : ,。 : :?:嗡簿 ~:潦 是 .,:’:?:: ‘ 鞯‘ :譬驹;:: 誊誊 :獭 ?。诂:‘??》??拈》。 ?”诂:。??》??嚣;》’ ? .尸./ / / 研究论文 . 眼. 、? // ? /. 研究论文.讼 、 口. 研究论文 附 表 %,士 %% ? .士.’ 蝴 .土.’ ? ? .士.’ ., . %,士 %% ?蝴 .士.。 .士. .士. ., .%,士 %% ?垤 .士.拌 ?【 .士.群 ? . .撑 ., 。如., 研究论文 , ? ‘ 一 ‘?一 .. .. .. / ..’ . . .. / . .’ .. .. / ..’ .. .土. . :?., ,.,撑., , ??????????一???????????????一 ??幽 ,一 / /.?. .?. .?. 儿 .?. .?. .?. / .?. .?. .?. / .?.: .?. .?. . :?木., ,;研究论文. 士. .. 。 ..。 .. .,口 .. .. .土.。 鼍 .. ’ ., / .士. 量??? .士. .?.群 ?? 瓜什 江 ..撑 ., 撑., 研究论文 论 讨 是一种发生在 慢性粒细胞白血病 造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病。病程进展缓慢,主要涉及粒系高度 增生并有不成熟性,在慢性粒细胞白血病患者的骨髓标本中,可找到费城 染色体或融合基因。慢性粒细胞白血病池中位生存期为 ~年,病程有慢性期、加速期 、急 吲。 变期 慢性粒细胞白血病池是一种对传统的化疗药物如羟基脲、干 扰素等和化疗都高度抗拒的血液系统恶性肿瘤,且传统的放化疗只能改善 患者的症状,但不能使患者达到遗传学和分子生物学的缓解,不能从根本 上阻止疾病的发生和发展,很多患者在经历?年的慢性期后,不可避 免的走向加速期和急变期,最终死于骨髓衰竭和重度感染等并发症。酪氨 酸激酶抑制剂伊马替尼,的临床应用,能使慢性粒细胞白血病 患者获得%的缓解率和%的临床收益率,是慢性粒细胞白血病 池的治疗史上的巨大进步。甲磺酸伊马替尼在年被批准作为 慢性粒细胞白血病的第一线用药,所以酪氨酸激酶抑制剂?对池 患者的治疗是具有革命性的【。伊马替尼作为酪氨酸激酶抑制剂, 成为靶向治疗慢性粒细胞白血病的有效的首选药物。但是在十几年的临床 用药中我们发现,伊马替尼的副作用主要表现在骨髓抑制、水肿、皮疹及 肝肾功能的损害等等,大都可以对症治疗或者耐受,但是仍有一部分患者 发生骨髓抑制后不得不停药或者减量,不仅会影响治疗效果,更为严重的 是会发生耐药。 慢性粒细胞性白血病的发病机制是融合基因编码的蛋 白的酪氨酸激酶被异常激活,进而导致疾病的发生。因此一旦酪氨酸激酶 蛋白浓度增加,细胞便会被重新激活过度增生,患者发生耐药。多种研究 表明患者对伊马替尼发生耐药是多种机制的综合结果,且过程复杂,其具 体机制也有待研究。针对其耐药的发生,我们可以联合传统的化疗药物, 也可以联合其他信号转导抑制剂来发挥治疗协同作用。 造血干细胞移植虽能从根本上治愈慢性粒细胞白血病,但骨髓抑制明 显,并发症严重,费用昂贵,且易复发。因此寻求治疗慢性粒细胞白血病研究 论文 的新药或协同伊马替尼治疗的新方案,减少其耐药的发生,提高疗效并改 善患者预后成了当前的我们急需解决的问题。 有学者研究发现,融合基因/激酶可通过结构域与的 调节亚基相结合,导致/信号通路激活【,导致细胞发生恶性 转化。细胞启动翻译信号及细胞由/期进入期必须通过信 号通路,同时信号也能调节细胞的分解和合成代谢,与蛋白合成、 细胞周期的调控相关,。/下游最重要的效应分子是, 剐途径的异常激活在多种肿瘤的发病中起重要作用。前期研究发现, 磷酸化的水平在慢性粒细胞白血病患者的骨髓细胞中明显升高, 途径呈现异常激活状态,提示慢性粒细胞白血病的发生与途径 的异常激活有关。研究表明抑癌基因表达减低或缺失或过表达 的存在使得的肿瘤对抑制剂较为敏感,由此可以预测 抑制剂对肿瘤细胞有效【,】。 最早发现的抑制剂是雷帕霉素,它是世纪年代从 细菌 中分离出来的一种大环内酯类抗生素, 最早作为免疫抑制剂应用于临床。随着对其生物特性的深入研究,人们发 现雷帕霉素具有抗肿瘤特性。在许多实体肿瘤组织培养和动物模型中,雷 帕霉素均具抑制肿瘤细胞生长的活性,例如白血病、乳腺癌、胰腺癌、黑 小细胞肺癌、肝癌等【。,并呈现浓度依赖性。 人类磷脂酸肌醇磷酸酶基因是继之后发现的又一个肌醇 ’磷酸酶,是造血细胞增殖和生存的重要负调控因子.最近研究表明, 能与、和形成复合物而在抑制白血病细胞的侵袭中发 挥重要作用。 我们针对慢性粒细胞白血病治疗过程中出现的耐药等问题,试图通过 研究雷帕霉素对细胞株的作用,为慢性粒细胞白血病的协同治疗寻 找新的途径。结果发现,雷帕霉素及伊马替尼联合用药组细胞存活率比对 照组、伊马替尼及雷帕霉素单药组明显降低,提示联合用药对细胞 的增殖抑制明显。此外,本研究还检测了雷帕霉素联合伊马替尼及两者单 独用药对细胞凋亡的影响,结果发现雷帕霉素、伊马替尼单药处理 组及两者联合处理组细胞凋亡率均明显高于对照组;而且两药联合组细胞 凋亡率比各单药处理组凋亡率明显增高。结果提示,雷帕霉素及伊马替尼研 究论文 大部分研究已经证实白血病患者存在基因的表达减低和缺失,为了 探讨雷帕霉素联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病的治疗是否具有协同作 用,在基因学水平的影响有何理论依据,本研究检测了雷帕霉素,伊马替 尼各单药及联合用药对白血病细胞株细胞内基因表达量的影 响,结果表明,当固定雷帕霉素浓度联合不同浓度伊马替尼时, 联合用 药组较各个单药组的表达水平均上升,提示雷帕霉素联合伊马替尼 可协同影响基因的表达,从而为慢性粒细胞白血病的治疗及解决其 耐药问题提供了新的途径,但具体机制仍有待研究。 结 论 雷帕霉素、伊马替尼单药及联合用药均可以抑制细胞的增殖, 但两药联合处理组细胞存活率明显低于各个单药组,提示联合用药 可明显抑制细胞增殖。 雷帕霉素及伊马替尼单药及联合用药均可以诱导细胞的凋 亡,但联合用药组的凋亡率较对照组和单药组均明显增高,说明两药联合可 明显增强单药诱导凋亡的作用。 雷帕霉素联合伊马替尼组基因表达水平较对照组和各个单药 组明上升,提示雷帕霉素能增强伊马替尼的抗细胞作用,其机制可 能与途径受抑制,上调表达有关。研究论文 参考文献., , .. ;:., , ,. . ? ;: ? , , , ?,, : 吴德沛.内科学明.北京:人民卫生出版社,. ?., :? , ,?, , , ./?, , / . : ., , ,:川. ,,:? . ,,, . :? , , . ,/. ,,: . . ? , , , /. ,,:? ., , 研究论文 一. ,, : ?马湘一,王世宣,刘琰等.雷帕霉素联合紫杉醇诱导卵巢 癌细胞和 凋亡及其分子机制.癌症,,:. ,,.阴. ,,: ,,., 【】., ,: ., , , .? 四. ,,: .,,,. ., ,: ,,,. .,,: ., , ,.阴. ,, : ,, ,., 】. ,,: ,,,. 】. ,,: 综 述 慢性粒细胞白血病基因治疗的研究进展 慢性粒细胞白血病 是造血干细胞 恶性增殖性疾病,在我国其发病仅次于急性髓系白血病和急性淋巴细胞白 血病位居第三,其高度增生和髓外浸润且对传统放化疗的抗拒使其临床防 治比较困难。随着近几年分子生物学、细胞遗传学的发展,现代慢性粒细 胞白血病的治疗已并非只追求血液学的缓解,故探讨其发病机制,从基因 学方去探究治疗白血病的靶向药物,有望进一步提高其治疗水平。 慢性粒细胞白血病的发病机制 慢性粒细胞白血病 是一种造血干 细胞恶性克隆性疾病,主要涉及髓系,以粒系增生为主,病程发展缓慢。 研究表明,%的慢性粒细胞白血病患者骨髓中可找到费城染色体,即特征 染色体异位,和/或/融合基因【】,这是慢性粒细胞 性;; 白血病的发病机制,/为抑制凋亡的基因,能通过抑制细胞凋亡, 而使细胞恶性增殖,基因组不稳定性增加导致细胞突变,使细胞容易发生 第二次突变,但/确切机制至今未完全明了。 慢性粒细胞白血病的传统治疗 传统治疗慢性粒细胞白血病的药物主要是白消安,羟基脲、沙利度胺、 干扰素、阿糖胞苷等,羟基脲亦被推荐为单药治疗慢性粒细胞白血病的首 选药物,这些药物可以在一定程度上改善患者的症状,但不能使患者达到 分子生物学和遗传学的缓解,亦对加速期和急变期的效果差或无效果。 慢性粒细胞白血病的靶向治疗 酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼期作为/酪氨酸激酶抑齐, 是第一个人工合成的靶向肿瘤药物。年月,被美国食品药物管理局 批准用于染色体阳性的慢性粒细胞白血病的一线治疗。伊马替尼能抑制 /的底物发生完全磷酸化,能够使竞争性结合到酪氨酸激酶催化 中心,从而阻止酪氨酸激酶发生活化,进而促使细胞发生凋亡。伊马替尼能 选择性抑制 /基因及/基因,但是其对正常造血几乎乎 不发生抑制作用。述 综 有些研究显示,遗传学反应率缓解率%,主要遗传学缓解率%。 伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病所引起的不良反应在疾病的不同阶段无 显著性差异【,】。伊马替尼治疗效果显著,安全,。伊马替尼 作为酪氨酸激酶抑制剂,成为靶向治疗慢性粒细胞白血病的有效的首选药 物。但是在十几年的临床用药中我们发现,伊马替尼的副作用主要表现在 骨髓抑制、水肿、皮疹及肝肾功能的损害等等,大都可以对症治疗或者耐 受,但是仍有一部分患者发生骨髓抑制后不得不停药或者减量,不仅会影 响治疗效果,更为严重的是会发生耐药。人们对其耐药的机制也正在进行 具体的研究。 慢性粒细胞性白血病的发病机制是融合基因编码的蛋 白的酪氨酸激酶被异常激活,进而导致疾病的发生。因此一旦酪氨酸激酶 蛋白浓度增加,细胞便会被重新激活过度增生,患者发生耐药。多种研究 表明患者对伊马替尼发生耐药是多种机制的综合结果,且过程复杂,其具 体机制也有待研究。造血干细胞移植虽能从根本上治愈慢性粒细胞白血 病,但骨髓抑制明显,并发症严重,费用昂贵,且易复发。为解决患者对 伊马替尼耐药的难题,人们不断研究,一方面应用酪氨酸激酶抑制剂的同 时,联合应用传统的化疗药物,抑或加大伊马替尼的用量,另一方面也在 积极的研究其他通路的抑制剂已达到联合用药提高药效,减少耐药的发生 的目的。 通路 最早发现于年【】,属于磷酸肌醇相关 . ,??家族成员,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,其 分子量为,位于人类染色体.~..编码蛋白是结构复 杂的大分子蛋白质,含有.雷帕霉素结合位点结构域 . ,,结构域位于其羧基末端, 是.复合物的结合位点,可以激活通路【】,雷帕 霉素可与细胞内的受体 结合形成.复合物,再 与的区相结合,从而抑制的激酶活性。在人体 细胞中,广泛存在信号传导通路,其主要的生物学功能为促进细 胞的增殖、影响细胞周期发挥作用、影响蛋白质合成等。信号传导 通路与肿瘤的发生有着密切的关系,此通路若调节发生紊乱,可导致上述综 述 细胞功能发生失调,在手术切除的非小细胞肺癌、胃癌等肿瘤组织中可以 见到表达量增高】。研究证实,可以通过其下游分子直 。 接或间接的抑制细胞凋亡【 在急性髓系白血病患者标本中,可以检测到的下游 效应分子和.磷酸化,提示途径异常激活【】。 科虹/信号通路的激活,表明是急性镳系白血病患者的一个特 征【。研究表明当小鼠造血干细胞中//.途径被激活后,干 细胞更容易向白血病性转化【】。 肿基因 另外,有学者研究认为,基因功能缺失的小鼠出现造血干细胞 的繁殖加速,自我更新能力的降低,且细胞出现向远处器官迁移,形成白 血病样疾病,但是一些研究表明,在急性髓系白血病中,几乎很少见 到表达量的减低或该基因的缺失【。以上所有研究结果表明,若造 血系统肿瘤发生,基因的活性程度并不占据主要地位。含结构域的肌醇’磷 酸酶 , 是另一种,其主要表达于人类的造血系统,其的主要生物学功能为 对骨髓的正常造血进行调控,尤其是对髓系细胞的调控,是/通 路负调控的重要因子,调节细胞内磷酸化水平。含结构域的肌醇’ 磷酸酶通过催化磷脂酰肌醇的肌醇环上第位磷酸脱磷酸化,使降 解为,,从而下调下游信号传导。在慢性粒细胞白血病 患者骨髓中存在基因表达减低或缺失,研究证实敲除基因后 ,,含量增加,激活,基因表达缺失有可能参与白血病 的形成过程】白血病中的基因可能通过突变影响信号通路 活性增加,参与白血病的发病。 唧.基因 .为含域 . 的造血细胞酪氨酸磷酸酶, 其基因位于第号染色体的区,全长 ,它由个外显子组成, 在末端缺少个氨基酸残基。主要包括包含个独立而紧凑的结构域, 其并且其为三位结构,其中,第.和.位氨基酸残基通过折叠形 成个结构域,第.残基则形成其催化结构域。.是细胞 信号转导和增殖分化的重要调节因子,而增殖分化障碍又是肿瘤的生综 述 物学特性之一。 .表达在造血干细胞,特异的使细胞内跨膜受体信号下调。. 受体主要包括伴体内酪氨酸激酶激活的生长因子和细胞因子受体,前者主 要包括.、.、和等,后者主要包括.、/.、 .和等,以及参与免疫应应的受体络合物、等。淋巴细 胞中的一基因其通过结构域与抑制免疫受体相互粘合,从而使酪 氨酸脱磷酸化减少或终止活化的信号传导或启动凋亡,因此淋巴细胞内 .基因发生机能障碍可能会导致淋巴瘤或白血病的发生【。一 的减少或缺失及转录异常,可引起淋巴瘤或白血病细胞中.蛋 白表达的缺失。等检测不同淋巴瘤和白血病细胞株中.表 达水平,细胞株一、细胞株、细胞株和部分 白血病细胞株、、、、等诸多细胞株中 . 表达均呈现阳性。国内一些学者研究了一些细胞淋巴瘤 细胞株的编码区及.基因的剪切联合区,并没有发现这些细胞株内存 在的缺失或位点突变,其主要由于.基因的突变或缺失。在 细胞株、?工的细胞株、细胞株和/淋巴瘤细胞株中等 均没有发现. 的异常表达【。等通过对激发 诱导.蛋白表达的实验发现,在细胞中,虽然.蛋白呈低水 平表达,但在一些白血病细胞株如和也发现了.的表达。 .基因是造血系统及实体肿瘤的主要抑癌基因之一,.表达 量异常或着功能发生异常,其与多种恶性肿瘤的发生有关,例如其在白血 病或淋巴瘤中通常表达量会降低,但在其余部分白血病或淋巴瘤细胞株及 大部分非造血系统恶性肿瘤中亦可出现正常表达或高表达,这种差异的机 制和意义目前尚不清楚,有待进一步的研究。 雷帕霉素的研究和应用 抑制剂种类繁多,主要包括:雷帕霉素及其衍生物、 吡咯并喹啉衍生物、色酮衍生物、.亚甲基.,.丁内酯类衍生物等。雷帕霉 素是一种小分子抑制剂,其主要作用位点在信号传导通路, 但其作用机制仍不清楚,有待进一步的研究。 雷帕霉素也是被最早发现和应用于临床的通路抑制剂。在二 十世纪九十年代,雷帕霉素被美国首次批准应用,主要是作为免疫述 综 抑制剂应用于肾移植后的免疫抑制治疗。但随着对其研究的深入,发现雷 帕霉素具有免疫抑制和抗肿瘤的双重作用。雷帕霉素可以诱导细胞停滞于 ,期且延迟细胞周期转换。研究表明雷帕霉素对多种实体肿瘤细胞株如 胶母细胞瘤、胰腺癌及肉瘤等具有抑制作用,肾细胞癌、胰腺神经内分泌 瘤等目前临床上已应用雷帕霉素进行治疗,故可以具体探索雷帕霉素在造 血系统恶性肿瘤的作用机制,为临床治疗提供理论依据。 小结 随着对在肿瘤的发生发展具有重要作用的研究的深入, 抑制剂作为治疗肿瘤的靶向药物其作用不容忽视。但肿瘤的发生发展是多 因素、多信号系统共同作用的结果,为了深度挖掘抑制剂在肿瘤 治疗方面的作用,一方面需要对途径在肿瘤发生中的具体机制进 行研究,另一方面也可以应用抑制剂雷帕霉素干预已被证实在慢 性粒细胞白血病中存在的及.基因,看其表达量的变化及其可 能的发生途径,探索抑制剂雷帕霉素与其他药物协同治疗的方案, 为白血病的基因学治疗提供一定的理论依据。综 述 参考文献 干定云,陈燕慢性粒细胞白血病分子靶向治疗的新进展临床血液 学杂志,,:. ., ?】. ,,:? , , . , 阴. ,,: . , , , ‘ ‘‘ ‘? ’’ ’ ’: 印 ,, :? .. , .? , : .. , ., ,: . : , ,:, ., 一 ?, , , . ?,.,:?. . , , ? ,,:, . . ? ,,:. , , ,. , ,:? ..