卵母细胞的孤雌激活
将体外成熟卵母细胞(COCs要提前脱卵丘)分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍,然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时,之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时,即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性,激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。
激活的判定:2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活;卵质膜破裂者判断为死亡;胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂(fragmentation)。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理,但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验,只有当对照组卵母细胞无一激活时,实验组数据才有效。
实验原理:利用氯化锶抑制第二极体的排出
实验用品:培养12小时并老化12小时,即24小时后的卵【要提前脱卵丘】,透明质酸酶,M2操作液,10摩尔每毫升的氯化锶,含钙CZB,
孤雌激活实验步骤
1,,第一天上午杀鼠取卵,培养卵。假设只有一个培养孔的卵,一个孔里最好有20至30个卵,留置第二天孤雌激活。
2,,第二天上午,算好时间,用紫外线照射两个培养孔,15分钟后加液,一个孔里放激活液,【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】,
配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3,注意激活液不能预热太长时间,CB热时间长会影响效果,【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟,然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】,在配置激活液时最后应该用枪打一打,好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑,激活需要6个小时。把握好时间,脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品,包括M2,含钙的CZB,再照上两个中平皿。
4,开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟,脱卵丘。再用M2洗3至4遍,再用激活液洗3至4遍,再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。
5,假设上午9点做完,下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次,但不出现原核者判断为碎裂,本实验将碎裂卵均归为未激活卵。
6,将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍,再转移如含钙CZB的培养孔中培养,理论上48小时后就可以看到4细胞期,此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养,即可以到达囊胚期。
本文档为【小鼠卵母细胞的孤雌激活】，请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑，
图片更改请在作品中右键图片并更换，文字修改请直接点击文字进行修改，也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享，如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服，我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生，若发现您的权利被侵害，请联系客服邮件isharekefu@iask.cn，我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权，请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传，仅限个人学习分享使用，禁止用于任何广告和商用目的。
浙公网安备 33021202002483