不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较

国际流行病学传染病学杂志2016年4月第43卷第2期InterJEpidemiolInfectDis'April2016，V01．43．No．2不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较何慧陈懿潘平潘富根余道军310006杭州，浙江中医药大学附属杭州第一医院检验科，杭州市第一人民医院检验科(何慧、陈懿、潘平、余道军)；322000浙江义鸟，浙江大学医学院附属第四医院检验科(潘富根)通信作者：余道军，Email：yudaojun98@163．comDOI：10．3760／cma．j．issn．1673-4149．2016．02．003【摘要】目的比较不同痰液液化方法及不同核酸提取方法共提取痰液中病毒RNA和DNA的效果，并比较其优劣。方法将痰液样本分为二硫苏糖醇(DTr)、氢氧化钠(NaOH)液化痰液组，以生理盐水为对照，分别使用TlANampVirusDNMRNAKit(方法1)、KBW酶法(方法2)、KBW通用法(方法3)和单一核酸提取试剂盒(方法4)提取核酸，微量核酸分析仪检测核酸纯度，多重定量PCR方法检测核酸的浓度。结果核酸纯度测定结果：生理盐水组中方法2和方法3，DTr处理组中方法l和方法2，NaOH处理组中方法3所提DNA纯度略大于1．8；各组中采用方法1所提RNA纯度均明显超过2，方法4及NaOH处理组中方法3所提RNA纯度均低于1．8，其余纯度均在正常范围内。PCR浓度测定结果：腺病毒(DNA)Ct值：生理盐水组<NaOH处理组(q=35．09，P<0．05)，生理盐水组和D．I’I’处理组间差异无统计学意义(q=2．54，P>0．05)；提取方法l<方法3(g=12。68,P<0．05)，方法1、方法2与方法4之间差异无统计学意义(q=0．84、1．69、2．53，P>0．05)；呼吸道合胞病毒(RNA)Ct值：生理盐水组<DTF组<NaOH组(F=152．76，19<0．01)；提取方法1<方法2<方法3(q=6．98、3．75，P<0．05)，方法2与方法4之间差异无统计学意义(q=1．28，P>0．05)。结论痰液液化前处理会影响病毒RNA和DNA的共提取，TIANampVirusDNMRNAKit和KBW酶法对痰样本中病毒核酸共提取效果较好。【关键词】痰；痰液液化；核酸共提取；多重定量PCR；腺病毒；呼吸道合胞病毒基金项目：浙江省医药卫生科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2015ZDA025)；杭州市科技发展计划(20130733Q04)；杭州市卫生科技计划重大项目(2012zD001)EffectsofdifferenthomogenizationandnucleicacidCO-extractionmethodsonviralRNAandDNAextrac-tionfromsputumHeHui，ChenYi，Pan只愕，PanFugen，YuDaojunMedicalLaboratory，theFirstAJ毋licatedHospitalofHangzhou，ZhejiangChineseMedicalUniversity，HangzhouFirstPeople!sHospital．Hangzhou310006，China(HeH。ChenY，P弧P。YuDn；MedicalLaboratory，theFourthAffiliatedHospital，ghejiangUn&ers毋Schoolof胁如妇，Yiwu322000，ghejiang，China(PanFG)Correspondingauthor：YuD晒un，Email：yudaojun98@163．com【Abstract]ObjectiveToevaluatetheeffectsofdifferenthomogenizationandnucleicacidCO·extractionmethodsonviralRNAandDNACO-extractionfromsputum．MethodsSputumwasliquefiedbyO．1％Dithiothreitol(DTF)(groupB)and4％NaOH(groupC)respectively，comparingwithsalinesolutions(groupA)．TIANampVirusDNA／RNAKit(method1)，KBWenzymekit(method2)，KBWuniveralkit(method3)andTAKARAextractionkit(method4)wereusedtoextractnucleicacidfromeachgroup．Thepurityofnucleicacidextractedbydifferentmethodswasevaluatedbynanoultramicronucleicacidproteintester，whiletheconcentrationofnucleicacidWaSevaluatedbymultiplequantitativepolymerasechainreactions(mqPCR)．ResultsThenucleicacidpurity：theratioofDNApuritywasslightlyhigherthan1．8bymethod2and3ingroupA，method1and2ingroupB，andmethod3ingroupC：theratioofRNApuritywashigerthan2bymethod1ineachgroup，andWaslowerthan1．8bymethod4ineachgroupandmethod3ingroupC；andtherestresultswerewithinthenormalrange．Theconcentrationofnucleic·8l··论著·万方数据·82·国际流行病学传染病学杂志2016年4月第43卷第2期InterJEpidemiol—InfectD—is,Apri—l2016,Vo—1．43,No．2acidbvmqPCR：theadenoviruse(DNA)Ctvalue：groupA<gmupC(q=35．09，P<0．05)，andtherewasnostatisticaldifferencebetween舯upAandB(q52．54，P>0．05)；method1<method3(q=12．68,P<0．05)，andtherewerenostatisticaldifferencesbetweenmethod1，2and4(口-o．84，1．69，2．53，P>O．05)；therespiratorysyncytialviruse(RNA)Ctvalue：groupA<groupB<groupC(砖152．76，P(o·01)，whilemethod1<method2<method3(q=6．98，3．75，P<0．05)，andthe：rewerenostatisticaldifferencesbetweenmethod2and4(q=l·28，P>0．05)．ConclusioasThesputumhomogenizationmethodshavealladverseimpactonnucleicacidextration．TheCO—extractioneffectsofbyTIANampVirusDNA／RNAKitandKBWenzymekitarebetterthantheothermethods·[KeywordslSputum；Sputumhomogenization；DNAandRNACO-extration；Multiplequantitativepolymerasechainreactlon(mqPCR)；Adenoviruses；RespiratorysyncytialvirusesFundprogram：ZhejiangMedicalandHealthScienceandTe(hnologyProject(2015ZDA025)；HangzhouScienceandTechnologyDevelopmentP1an(20130733Q04)；HangzhouMajorProgramofHealthScienceandTechnologyPlan(2012ZD001)病毒感染易导致儿童急性呼吸道疾病，据统计在婴幼儿中，约50％的肺炎是由病毒引起的u1。随着分子诊断技术的不断发展，PCR技术开始应用于临床病毒感染的检测，其中多重荧光定量PCR更适合于多种病毒混合感染的鉴别诊断【2】。应用多重PCR检测病毒的关键在于核酸提取，有关病毒DNA和RNA提取试剂盒众多，但多只能提取单一种类核酸，但常见呼吸道病毒往往包括多种病毒核酸，如腺病毒(ADV)为DNA病毒，而呼吸道合胞病毒(RSV)等为RNA病毒，其重要性相当，因此如何从同一份痰样本中同时提取DNA和RNA具有重要意义。本研究比较3种核酸共提取试剂盒从痰样本提取核酸的效率，并对其中的核酸浓度及纯度进行对比研究，同时研究不同液化方法对痰液核酸提取效率的影响，从而对PCR技术检测临床痰液样本核酸的处理方法做优化选择，为多重PCR技术同时检测DNA和RNA病毒寻找更精确、高效的试剂盒提供依据。材料与方法一、样本来源收集杭州市第一人民医院2014年11月至2015年2月经直接／间接免疫荧光法检查ADV或RSV阳性的儿科患者痰液样本共25份，将痰液混合，使用生理盐水补足至50mL，取1mL用普通PCR方法扩增，送上海生工生物工程公司测序验证混合痰液中含ADV和RSV。痰样本取得过程征得患儿家长同意，并通过杭州市第一人民医院医学伦理委员会审核[2015科研伦理审第(26)号一Oll。二、试剂及仪器二硫苏糖醇(DTF)、RNA酶(上海源叶公司)，DNaseI(TAKARA公司)，DK一8D型电热恒温水槽由上海精密实验设备有限公司提供；电泳仪及凝胶成像系统购于Bia．Bad公司，Heraeus高速冷冻离心机、NanoDropND一200012000C超微量核酸蛋白测定仪由德国The加。公司提供；电子天平BSAl24S．CW由德国赛多利斯提供、TIANampVirusDNMRNAKit(DPl30423TIANGEN公司)、KBW酶法Koning通用型酶法体液病毒DNAmNA小量制备试剂盒(C3612杭州百迈生物技术有限公司)、KBW通用法Koning通用型体液病毒DNMRNA小量制备试剂盒(C4612杭州百迈生物技术有限公司)、RNA提取试剂盒(9767TAKARA公司)。三、方法1．不同液化方法将混合痰液平均分为3管，标记为A、B、C。A管为生理盐水组，B管为Drrr处理组：10000xg离心5rain，去上清，加0．1％D7rr至10mL处理20min，10000xg离心5rain，沉淀用1-xPBS缓冲液混匀洗涤1次，最后用1xPBS补足至10mL。C管为NaOH处理组：10000xg离心5min，去上清，加4％NaOH至10mL，静置5rain，10000xg离心5min，去上清，沉淀用Tris．HCl洗涤3次，最后用生理盐水补足至10mL，用pH试纸测定其pH在7～8之间。将A、B、C3管痰液(每管10mE)分装成50小管，每管200¨L，一80℃保存备用。万方数据国际流行病学传染病学杂志2016年4月第43卷第2期InterJEpidemiolInfectDis，April2016，V01．43，No．22．核酸提取方法病毒核酸共提取方法：(1)方法1：使用TIANampVirusDNA／RNAKit共提取A、B、C3管中的病毒核酸，每管取200肛L痰液，重复3次；(2)方法2：使用Koning通用型酶法体液病毒DNMRNA小量制备试剂盒(KBW酶法)共提取A、B、C3管中的病毒核酸，每管取200IxL痰液，重复3次；(3)方法3：使用Koning通用型体液病毒DNA／RNA小量制备试剂盒(KBW通用法)共提取A、B、C3管中的病毒核酸，每管取200txL痰液，重复3次；(4)另外利用单一核酸提取试剂盒(9767TAKARA公司)分别提取A、B、C3管中的DNA和RNA，记为方法4，所有操作按试剂盒说明书进行，最后提取核酸均溶于50斗L体系中。共提取核酸中去除RNA方法：另从A、B、C3管各取200tLL痰液，用方法1、方法2、方法3提取核酸，在加入裂解液后加入2斗LRNase，其余操作不变，最后提取核酸均溶于50“L体系中，均重复3次。共提取核酸去除DNA方法：从A、B、C3管各取200斗L痰液，用方法1、方法2、方法3提取核酸，其中在核酸洗涤前，在含有核酸的柱膜上进行DNaseI消化，加入50阻LDNaseI反应液，室温静置15rain，10000xg离心30S，弃滤液，接着进行洗涤步骤，其余操作不变，均重复3次。3．核酸检测微量核酸分析仪检测：取上述各种方法提取的经RNase或经DNase处理的核酸各1．5¨L，采用超微量核酸蛋白测定仪测定样品中核酸的纯度(A√A280)。多重实时荧光定量PCR检测：以试剂盒提取得·83·到的病毒核酸共提取物，经RNase处理的DNA或经DNase处理的RNA为模板，进行一步法逆转录多重实时荧光定量PCR检测，所测定的Ct均值越高核酸含量越低。(1)引物探针设计：从GenBank数据库下载RSV和ADV基因序列，利用NCBI数据库中Primepick工具和Oligo6．22进行对比和优化，选择同源性高的保守区域设计引物和探针，并用NCBI数据中的Blast验证各引物和探针序列的特异性，引物由Invitrogen(上海英潍捷基公司)合成，探针由上海奕跃生物公司合成，见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1。(2)多重实时荧光RT—PCR反应体系及条件：使用OneStepPrimeSeriptRT—PCRKitforPerfectRealTime试剂盒(大连宝生物公司，批号：RR064A)建立二重荧光RT：PCR反应体系，25斗L反应体系包括12．5斗L的2×OneStepRT．PCRBufferⅢ，0．5斗L的TaKaRaExTaqHS，0．5trL的PrimeSeripRTEnzymeMixⅡ，核酸模板4斗L，各引物探针(10I山mol／L)0．5trL，用灭菌水补足至25斗L。反应条件为：42℃逆转录5min，95oC预变性10s，40个循环为95℃变性5S、60oC延伸35s采集荧光信号。四、统计学分析采用SPSSl7．0软件进行分析，计量资料采用z矗表示，采用双因素方差分析不同痰样本液化处理组、不同提取方法所提核酸浓度及Ct均值，两两之间比较用SNK—q检验。结果一、痰样本不同液化方法的处理结果A管痰液性状无明显变化；B管中加入0．1％DqT5min后，痰液中黏蛋白逐渐消失，变成无混浊物均质液体；C管中加入NaOH溶液1rain后，表1RSV和ADV的多重PCR引物与探针序列注：RSV：呼吸道合胞病毒；ADV：腺病毒万方数据·84·国际流行病学传染病学杂志2016年4月第43卷第2期InterJEpidemiolInfectDis,April2016，V01．43，No．2痰样本中黏性蛋白消失，变成无混浊物均质液体。二、核酸纯度测定结果纯DNA的A：洲瑚应在1．6—1．8之间，本实验所提DNA大部分在这个范围内，其中生理盐水组中方法2和方法3，DTI"处理组中方法1和方法2，NaOH处理组中方法3所提DNA纯度略大于1．8。纯RNA的A：。以獬应在1．8—2．0之间，不同组中采用方法1所提RNA均明显超过2，各组中方法4及NaOH处理组中方法3所提RNA纯度均低于1．8，其余纯度均在1．8～2．0范围内。详见表2。三、定量PCR结果1．DNA定量PCR结果比较不同液化处理方法组问ADVDNACt均值差异有统计学意义(F_382．53，P<0．01)，其中生理盐水组(Ct均值：18．8l+1．27)<NaOH处理组(Ct均值：28．90±3．00)(q=35．09，P<0．05)，生理盐水组和DTr处理组(Ct均值：19．54+1．51)间差异无统计学意义(q=2。54，P>0。05)。不同提取方法组问DNACt均差异值也有统计学意义(F=39．51，P<0．01)，其中方法1(Ct均值：21．3±4．17)<方法3(Ct均值：25．51±6．21)(q：12．68，P<0．05)，方法1、方法2(Ct均值：21．02+4．54)与方法4(Ct均值：21．86_+4．69)之间差异无统计学意义(q=0．84、1．69、2．53，P>0．05)。各组具体检测结果见表3。2．RNA定量PER结果比较不同液化处理方法RSVRNACt均值组间差异有统计学意义(F-152．76，P<0．01)，其中生理盐水组(Ct均值：21．63±2．81)<DIT处理组(Ct均值：22．75±1．82)<NaOH处理组(Ct均值：30．23±1．69)(口：2．96、19．77，P<0．05)；不同提取方法DNACt均值差异有统计学意义(F=19．95，P<0．01)，其中方法1(Ct均值：22．38+4．6)<方法2(ct均值：25．43±3．88)<方法3(Ct均值：27．07+_3．99)(q=6．98、3．75，P<0．05)，方法2与方法4(Ct均值：24．87_+4．40)之间差异无统计学意义(口=1．28，P>0．05)。各组具体检测结果见表3。讨论各种呼吸道病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床表现难以鉴别，应用荧光定量PCR技术检测痰样本中病毒核酸不仅可以确诊引起感染的病毒，还可定量分析以对患者进行疗效评估131。目前荧光定量PCR技术在国内外临床检验科已常规应用，是否需对痰样本进行前期处理，应用何种方法实现同一管内、同反应体系、同时检测病原体DNA和RNA成为临床检验部门通过核酸检测技术快速诊断呼吸道感染疾病的关键。表2不同痰液液化及核酸共提取法获得的痰液核酸纯度(n=3，A狮伪。)注：DTI'：二硫苏糖醇；NaOH：氢氧化钠；方法l：TIANampVirusDNMRNAKit；方法2：KBW酶法；方法3：KBW通用法；方法4：TAKARARNA／I)NA单一核酸提取试剂盒表3不同痰液液化及核酸共提取法获得的痰液中DNA和RNA定量PCR结果(Ct值)注：所测定的Ct值越高核酸含量越低。DTT：二硫苏糖醇；NaOH：氢氧化钠；方法l：TIANampVirusDNMRNAKit；方法2：KBW酶法；方法3：KBW通用法；方法4：TAKARARNMDNA单一核酸提取试剂盒。不同组别间DNA、RNA提取平均水平比较，差异有统计学意义(乒'_382．53、152．76，P<0．01)；不同提取方法间DNA、RNA提取平均水平比较差异有统计学意义(F=39．51、19．95。P<0．01)万方数据国际流行病学传染病学杂志2016年4月第43卷第2期InterJEpidemiolInfectDis，April2016，V01．43，No．2痰液病原体核酸的提取与体液、组织提取方法基本相同，但有些痰样本因为有大量黏液的存在，对核酸提取操作带来不便【4】。目前液化痰液的方法多用于观察其对痰液中细胞形态或单种核酸提取的影响【习，对核酸共提取的影响鲜有报道。本研究采用DTF和NaOH法处理痰样本16-71，并与生理盐水组作比较，其中DTF液化痰液的作用机制是破坏黏液中的二硫链，使蛋白质分解破坏，结果发现，在D1Tr和NaOH溶液加入到痰样本一段时间后，痰液中黏性蛋白消失，液化效果明显，其中NaOH液化痰液速度快于DTr，但定量PCR结果却表明，就DNA提取效果而言，生理盐水组和DTr组无差别，二者均好于NaOH处理组；RNA提取效果生理盐水组优于DTY处理组和NaOH处理组，可能的原因是NaOH和DTT溶液在液化痰黏液时，破坏了病毒核酸的结构，也可能在多次洗液过程中核酸损失过多，最后导致核酸提取率降低同。所以在提取痰液核酸时，对痰液可不进行液化处理，如果痰液黏稠度较大，可用DTr适当进行液化处理，而不推荐使用NaoH液化。本研究应用了3种核酸共提取试剂盒同时提取痰液中DNA和RNA，并以单种核酸提取试剂盒作比较。结果表明，使用TIANampVirusDNA／RNAKit(方法1)核酸共提取的效果最优，KBW酶法(方法2)与TAKARARNA／DNA单一核酸提取试剂盒(方法4)效果相似，KBW通用法(方法3)最差。究其原因是多方面的，主要可能是病毒裂解效果有别，吸附柱与病毒核酸结合、释放能力存在差异，以及洗脱液的洗脱能力不同等。当然，该4种方法主要用于血液样本病毒核酸提取，用于痰液样本病毒核酸提取可能存在方法学上的差异。就操作复杂程度和耗时来说，方法1花费时间最长，需45min左右，方法2需24min左右，方法3需22rain，方法4分开提取DNA和RNA各花费20min左右，其中方法1与方法2需用到金属浴。本文采用核酸蛋白测定仪运用吸光光度法来测量提取液中核酸纯度，操作简便，DNA和RNA样·85·本使用量少，但是蛋白质及提取核酸过程中所加各类试剂、pH值等很容易对其读数产生影响，造成假阳性的结果【8】。纯DNA的A洲280应在1．6—1．8之间，本实验个别组中所提DNA纯度略大于1．8，可能是实验过程中未将RNA消除干净。纯RNA的A艄280应在1．8-2．0之间，本实验中方法1由于提取过程中加入了RNA助沉剂，所以不同组中采用方法1所提RNA纯度均明显超过方法2，各组中方法4及NaOH处理组中方法3所提RNA纯度均低于1．8，可能有蛋白质污染。因此评价痰液液化处理方法对痰中病毒核酸提取的影响时，提取核酸的纯度只能作为参考指标。参考文献[1】ChopraM，MasonE，BorrazzoJ，eta1．Endingofpreventabledeathsfrompneumoniaanddiarrhoea：allachievablegoal【J】．Lancet，2013。381(9876)：1499-1506．DOh10．1016，S叭40—6736(13)60319—0．【2】2JarttiT，SOderlund—VenermoM，HedmanK，eta1．Newmolecularvirusdetectionmethodsandtheirclinicalvalueinlowerrespiratorytractinfectionsinchildren[J]．PaediatrRespirRev，2013，14(1)：38-45．DOI：10．1016／j．prrv．2012．04．002．【3】LitwinCM，BosleyJG．SeasonalityandprevalenceofrespiratorypathogensdetectedbymultiplexPCRatatertiarycaremedicalcenter[J]．ArchVirol，2014，159(1)：65—72．DOh10．1007／s00705-013一1794_4．【4】张军力，托娅，王育民．不同的液化方法对痰液DNA提取效果比较叨．检验医学，2009，24(6)：456-458．DOhl673—8640(2009)06．0456．03．ZhangJL，TunY，WangYM．ThecompatrisonofsputumDNAextractioneffectsbydifferentmethodsofliquefaction[J]．Lab-oratorymedicine，2009，24(6)：456-458．DOhl673—8640(2009)06-0456-03．【61DesjardinLE，PerkinsMD，TeixeiraL，eta1．Alkalinedecontam-inafionofsputumspecimensadverselyaffectsstabilityofmyeobacterialmRNA[J]．JClinMicrobiol，1996，34(10)：2435—2459．DOh10．1128，JCM．00487—14．[7】RawlinsGA．Amethodofliquefyingsputumforthecultureofor．ganismsotherthan胍tuberculosis田．JMedLabTechnol，1955，13(3)：133—143．[8】GreenMR，SambrookJ．Molecularcloning：alaboratorymanual【MI．4thed．NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2012：78．(收稿Et期：2015—10-15)万方数据