小球藻USTB01的异养培养和叶黄素的提取

北京科技大学硕士学位论文小球藻USTB-01的异养培养和叶黄素的提取姓名：王素琴申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：林海;闫海20070115北京科技大学硕士学位论文摘要本文主要对小球藻USTB-01的异养批量培养、叶黄素的提取检测以及不同培养条件下小球藻USTB-01细胞中叶黄素的含量进行了研究。在确定了高效液相色谱定量测定叶黄素的基础上，围绕如何从小球藻USTB．01细胞中提取叶黄素的方法进行了研究，发现甲醇和二氯甲烷(2：1'v：v)的混合溶液能高效从小球藻USTB-01细胞中提取叶黄素，采用超声波破碎法有助于藻细胞的破裂并释放出叶黄素，从而提高了提取效率。在光照批量培养研究中发现，与尿素和氯化铵相比，硝酸钾是支持小球藻USTB．01持续快速生长和促进小球藻USTB．叭生物合成叶黄素的最好氮源，小球藻USlBDl细胞中的叶黄素含量可以达到o．85mg·g．1。植物激素吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(mA)非但不能明显促进小球藻USTB-01的生长，反而明显抑制了小球藻USTB-01对叶黄素的生物合成。在摇床异养无光照批量培养过程中，对各参数进行了优化，研究表明，支持小球藻USTB-01生长的最佳温度为30℃、最佳碳氮源分别为葡萄糖和硝酸钾、最佳碳氮比为25：1。比较异养、光照混养两种培养方式对小球藻USTB-01生长及叶黄素产量的影响，发现混养培养不仅可以获得较大的藻生物量，而且可以获得较高的叶黄素含量。关键词：小球藻USTB-01，培养，叶黄素，提取北京科技大学硕士学位论文HeterotrophicCultureofChlorellaUSTB-01andExtractionofLuteinAbstract1ft玲cultureofheterotyophicChlorellaUSTB一01andtheextractionofluteinwe∞studiedinthispaper．HPLCwasusedfordeterminingluteinextractedfromChlorellaUSTB-01calls．Howtoextractlutdn丘．omChlorellaUSTBmlWaSinvestigated．n屺resultsshowedthatthemixtureofmethanolanddichloromethane(2：l,v／v)wasthemosteffectivesolventtoextractluteinfromthemieroalgalcells．Itwasfoundthatsoni-eationwasausefulmethodforthebreakingofcellsandtheexWaetionofluteinfrommicroalgalcells．Inthebatchculturewitllli曲tine．potassiumnitratecomparedwithu渤andanunoniumchloridewasfoundtobeabestnitrogensourcetosupporttherapidandcontinuousgrowthofChlorellaUSTB-01．whichwasalsoabestnitrogenSOUrCOtopromotebiosyntht滴soflut血byChlorellaUSTB-01．andO．85mg／gcontentofluteinindryalgalcellsWillsobtained．Onthecontrary,thegrowthofChlorellaUSTB-01couldnotbeacceleratedinthepresenceofIAAorIBA,andthebiosynthesisofluteinWaSinhibitcdbyIAAorIB九respectively．Intheheterotrophicculturewithoutlighting,itshowedthat30℃WaSasuitabletemperaturetocultureChlorellaUSTB-01．Thebestc瓢'bonandniffogcnsourc您wereglucoseandpotassiumnitrate,andtheratiobetweencarbonandnitrogenwas25：1．ComparedwiththehctcrotrophiccultureofChlorellaUSTBml．themixedculturehadprominentsuperiorityonthegrowthofmicroalgaandtheproduaionofll吐eimKeyWords：ChlorellaUSTB-01，culture,lutein,extraction．2．北京科技大学硕士学位论文图1．1图1．2图3．1图3．2图3．3图3A图3．5图3．6图3．7图3．8图3．9图3．10图4．1图4．2图4．3图4A图4．5图4．6图4．7图4．8图4．9图4．10图4．11图4．12图4．13图4．14图4．15图4．16图4．17插图或附表清单小球藻工业生产流程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7叶黄素结构式叶黄素标准溶液在370,--800nm范围内的扫描图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。25峰高(a)、峰面积∞与标准品叶黄素浓度之间的线性关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。26叶黄素标准品及小球藻提取物HPLC谱图⋯⋯⋯⋯⋯⋯。叶黄素标准品及小球藻提取物中叶黄素的扫描图谱⋯⋯．不同极性溶剂提取叶黄素的效果比较⋯⋯⋯⋯⋯不同非极性溶剂提取叶黄素的效果比较⋯⋯。⋯27⋯28甲醇、二氯甲烷不同比例组合提取叶黄素的效果比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31极性、非极性、极性溶剂组合提取叶黄素的效果比较⋯⋯．．不同破碎时间提取叶黄素的效果比较⋯⋯⋯⋯．小球藻提取液在370---800nm范围内的扫描图谱⋯⋯⋯⋯⋯．小球藻的单克隆菌落⋯⋯⋯⋯⋯．显微镜640倍下小球藻细胞形态⋯⋯⋯⋯⋯oI岫椭与藻细胞浓度和藻细胞干重浓度的线性关系⋯⋯葡萄糖标准曲线。不同接种量和培养方式对小球藻生长的效应不同氮源对小球藻生长的效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。不同氮源条件下小球藻培养物中pH的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯不同氮源条件下小球藻细胞内叶黄素产量吲哚乙酸对小球藻生长的效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．吲哚丁酸对小球藻生长的效应⋯⋯⋯⋯．植物激素作用下小球藻细胞中叶黄素含量⋯⋯⋯⋯。红霉素对小球藻生长的效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯硫酸链霉素对小球藻生长的效应⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯43⋯⋯⋯⋯．44．．．．．．．．．．．．．45．．．．．．．．．．．．．46氨苄青霉素钠对小球藻生长的效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．不同培养温度对小球藻生长的效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．不同碳源对小球藻异养生长的效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯不同碳源作用下小球藻培养物pH变化⋯⋯⋯⋯⋯．孔勉弭弘弱孙"鲳剪扣∞∞甜仉铊北京科技大学硕士学位论文图4．18图4．19图4．20图4．21图4．22图4．23图4．24图4．25图4．26图4．27图4．28图4．29表1．1表2．1表2．2表2．3表4．1表4．2不同氮源对小球藻异养生长的效应不同氮源条件下异养小球藻叶黄素产量⋯⋯⋯．不同碳氮比对小球藻异养生长的效应⋯⋯⋯不同碳氮比条件下异养小球藻叶黄素含量流加方式1、2、3下小球藻生长曲线⋯⋯⋯⋯．流加方式1、2、3下剩余葡萄糖量流加方式1、2、3下累计消耗葡萄糖量⋯⋯流加方式4、5、6下小球藻生长曲线⋯⋯。流加方式4、5、6下剩余葡萄糖量⋯⋯⋯⋯⋯5153流加方式4、5、6下累计消耗葡萄糖量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53异养及混养培养条件下小球藻生长比较⋯⋯⋯异养及混养培养条件下叶黄素产量变化比较。Basal和K2N培养基的配方试验用主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯．试验用仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯不同添加方式19添加方式1、2、3实验结果添加方式4、5、6实验结果．2-独创性说明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得北京科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。签名：乇盘丕日期：立：』：12：关于论文使用授权的说明本人完全了解北京科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵循此规定)一＼日期：67t卜D阳北京科技大学硕士学位论文引言作为最简单的光合作用有机体，微藻有时又被称为单细胞藻类，已经在地球上存活了二十多亿年，其通过光合作用为地球早期大气中氧气的产生以及动物的起源与发展奠定了重要的物质基础。随着科技的进步，作为地球生物资源的一个重要组成部分，微藻所具备的生长速度快、光合作用效率高、适应性强等优点被逐步得到认识和开发，并在保健食品、精细化工和医药等方面得到了越来越广泛的应用。微藻中的小球藻是一种具有多种经济价值的生物资源，有着巨大的应用和开发潜力。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝h素、叶黄素、虾青素和多种维生素【1捌，具有极高的营养价值和提高免疫力的功能。小球藻细胞中所含的类胡萝h素主要以叶黄素为主，含量可达0．267％～0．3l蟛31，而作为传统叶黄素源的紫苜蓿中叶黄素含量也只有0．02％～0．03％E41。研究发现叶黄素主要有以下几种功能：①利用其着色剂作为饲料及食品添加剂；②作为其他物质的稳定剂；③防止老年人视黄斑退化；④具有抗癌作用；⑤对心脑血管疾病有防治作用【辅1。由此可见，小球藻必将作为新的叶黄素来源而得到普遍的关注，研究开发低成本的叶黄素和提取技术及工艺成为当务之急。另外小球藻还含有一种非常重要的成分叫做小球藻生长因子，它既具有诱发干扰素，激发人体防御和免疫组织中的巨噬细胞、T细胞和B细胞的功能，又具有促进对环境污染有害物质解毒和排泄的作用‘眦。一般认为微藻属于低等植物，主要吸收二氧化碳通过光合作用合成有机物【91，但采用此种方法，一般培养出的藻细胞浓度较低。进入二十世纪七十年代以来，国外学者发现，有些小球藻可以在无光照条件下生长于有机物[10,II】，不仅大幅度提高了小球藻的生长速度，而且获得了很大的藻生物量，从而引起了单细胞藻类培养的一次重要革命。当前，美国、日本、以色列等国家和我国台湾已成为小球藻的主要生产地，而我国大陆尚未发现有超高细胞浓度小球藻异养培养产业化生产的报道。目前世界上小球藻年产量约为1500～2000吨，而国际市场的年需求量约为8000～10000吨，并呈现不断增长的趋势。因此不断改善培养条件，选育出具有我国自主知识产权的优良异养藻种，推进小球藻的进一步开发和利用，是今后小球藻研究领域的一个重要课题。本实验室从北京清河水体中筛选出的小球藻纯藻种，在无光照条件下可以快速生长于有机物，具有非常强的异养培养潜力。本文在确定了此小球藻细胞中确实含有叶黄素的基础上，主要围绕小球藻的异养培养及其在不同培养条件下叶黄素的含量进行了研究。北京科技大学硕士学位论文1文献综述1．1，J、球藻的形态结构与生态特点小球藻(iChlorella)是单细胞绿藻，属于绿藻门(Chlorphyta)绿藻纲(Chlorophycene)绿球藻目(Chorococcales)卵囊藻科(Oocystace)小球藻属(Chlorella)。细胞形状为圆形或椭圆形，直径为2～12lain，种类繁多，生态类型多样，在淡水、海水中均有分布，但淡水中居多。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)和普通小球藻(Chlorellavulgaris)【2，12J12,m。小球藻有薄而坚固的细胞壁，细胞壁的组成中含有孢粉质类似物，是一种类胡萝卜素衍生物的多聚物，常出现在高等植物花粉粒的细胞壁中【14】，细胞壁的外面一般无粘质，但有时也会分泌粘质而使多个细胞粘在一起，细胞内有一杯状或板状载色体，载色体内有一淀粉核，随小球藻种类的不同淀粉核明显或不明显，有些小球藻种没有淀粉核嗍。小球藻的繁殖方式为裂殖，依靠细胞内原生质层分裂而形成似亲孢子，细胞生长到一定程度后依靠细胞内原生质层分裂而形成两个细胞。小球藻除了可在自养条件下生长外，有些小球藻也可在异养条件下利用有机碳源进行异养生长，速度比光照条件下快得多。1．2小球藻的培养1．2．1小球藻的自养培养早在1890年，荷兰微生物学家Beije渤世”】就首先在琼脂平板上成功分离到了一种叫做小球藻的纯培养物，另一科学家Ottowarbl《嘲于1919年将这一纯培养物在实验室进行纯培养，作为研究植物生理学的材料。研究发现小球藻可以进行光合作用，利用无机碳合成有机物，能够快速生长，光能利用效率高，至此小球藻的自养培养研究拉开了序幕D6,171。光合作用分为光反应和暗反应两大步骤。光反应只发生在光照下，是由光引起的反应，光反应发生在叶绿体的基粒片层，从光合色素吸收光能激发开始，经过电子传递，水的光解，最后是光能转化成化学能，以A_rP和NADPH的形式贮存。暗反应是由酶催化的化学反应，暗反应所用的能量是由光反应中合成的ATP和NADPH提供的，它不需要光，所以叫做暗反应。暗反应发生在叶绿体的基质，即叶绿体的可溶部分。因为它是酶促反应，所以对温度十分敏感。暗反应极复杂，主要是用二氧化碳制造有机物，使活跃的化学能转变成稳定的化学能，即把二氧化碳和水合成葡萄糖。小球藻的自养培养就是利用小球藻光合作用的机理，采用光和二氧化碳进行培养，同化oD2生成碳水化合物，提供细胞结构物质 单元 初级会计实务单元训练题天津单元检测卷六年级下册数学单元教学设计框架单元教学设计的基本步骤主题单元教学设计 和代谢能量以生长繁殖。小球藻的自养培养既可利用自然光，也可利．2．北京科技大学硕士学位论文用人工光照，培养基主要由无机化合物组成，最适pH为6．5～7．5，最适光照强度为2000～5000l酝，温度为20～30℃。于贞掣181的研究结果表明：pH是影响小球藻生长的重要因素，光照强度和通气量通过影响小球藻光合作用强度而控制小球藻的生长。小球藻可以利用铵盐、硝酸盐和尿素作为氮源，添加适量的包含痕量有机酸和微量元素的土壤浸出液有利于小球藻的生长。1．2．2小球藻的异养培养小球藻的异养培养较自养培养起步晚。1953年，LcwinIl9】最早发现一些藻类能利用有机物作为唯一的碳源和能源进行异养生长。目前对微藻异养生长机理的研究还处于初级阶段。Gladue[201针对有些微藻不能进行异养生长这一现象 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 了三种假说：①相关酶类的缺乏，一些微藻缺乏利用某些有机物的酶。但一种藻类缺乏利用某一有机物的酶，并不能说明其在别的有机物中也不能生长，因此，在培养基中加入多种碳源，可能会使这些藻类在异养条件下生长。②通透性障碍。有机物必须通过细胞膜进入细胞内部，才能被藻类利用。然而，有些藻类缺乏吸收有机物的机制，为了克服这一问题，必须选取合适的有机物。⑧限制性的呼吸能力。藻类通过呼吸作用分解自身储存的物质，获得能量，维持细胞的存活。然而，有些藻类在异养条件下呼吸所产生的能量不足以维持生长及运输外界环境中的有机物。对于这些藻类，适量添加高能碳源和生长因子(如维生素、氨基酸等)，可能会使其进行异养生长。近年来，对于小球藻的异养培养研究受到了众多学者的重视，特别是高细胞浓度培养技术得到了较深入和广泛的探索，取得了一系列重要的研究进展【821彩】。异养培养小球藻可以克服光自养培养诸多缺陷，是提高小球藻产量与产率的有效途径。异养培养较自养培养最大的区别就是利用有机物作为碳源和能源。Endo和Shirota[26]检测了小球藻利用包括糖、有机酸和醇类等60多种有机碳源的能力，试验结果表明，只有葡萄糖、半乳塘、乙酸、乙醇、乙醛、丙酮酸可作为唯一碳源支持小球藻的生长，其中葡萄糖、半乳糖和醋酸盐可在无光照条件下支持蛋白核小球藻的快速生长。在近期的研究和生产应用中，醋酸盐和葡萄糖是异养培养小球藻的主要碳源，日本和中国台湾省的小球藻工厂的部分产品现在就是以葡萄糖或醋酸盐为碳源进行异养培养生产的。ShiWt2n研究了不同葡萄糖浓度对小球藻生长的影响，结果表明，当初始葡萄糖浓度在10～809'L1的范围内时，所得小球藻细胞浓度随葡萄糖含量的升高而升高，最大藻细胞干重浓度可达31．2g．L1，但当初始葡萄糖浓度达至U100g'L1时，小球藻的延迟期相对较长，生长受到抑制。Mayo和Noike在小球藻与细菌混合培养的污水处理体系研究了葡萄糖浓度对小球藻生长规律的影响；发现当葡萄糖浓度较低时，藻细胞浓度也低；相对高．3．北京科技大学硕士学位论文的葡萄糖起始浓度如50gL．1可用于培养高细胞浓度的小球藻f28】。我们的研究结果表明，当初始葡萄糖浓度大于17．3g·L-l时会增加小球藻生长的延迟期，因此推测在发酵罐发酵培养小球藻过程中，应该依据小球藻的生长状况对葡萄糖进行流加补给，这样可避免高葡萄糖浓度对小球藻生长的抑制。刘世名等【捌报道，流加分批培养小球藻时，补料液中最适碳氮比为41．2。张丽君等圆认为在葡萄糖和硝酸钾分别作为小球藻生长的碳源和氮源时，碳氮比维持在4N5之间是一种比较优化的控制条件。我们对一株筛选的小球藻采用葡萄糖和硝酸钾进行异养培养的结果表明，初始碳氮比在25：1时最好，导致培养基不同优化碳氮比的原因既可能与实验的藻种不同有关，也可能由所采用的碳、氮化合物种类不同所致。一般来说碳占藻干重的49--70％，而氮占藻干重的l一1l％【9】，碳氮比在5以上。因为在异养培养条件下，大约有50％的葡萄糖会转化为二氧化碳，也就是说只有50％左右的葡萄糖能够被藻类利用，因此在异养培养小球藻过程中的碳氮比应该在10以上，又因为小球藻可以在一定限度内进行缺氮生长，因此培养基中的碳氮比可能更高为好。在批量培养条件下，一般获得的小球藻细胞干重都在10g-L"1以下，而我们筛选出的一株小球藻在却可以高达26g·L．1田，说明不同小球藻种的异养生长能力存在较大差异。异养培养方式可以分为分批培养、补料培养和连续培养等00]。分批培养是应用最普遍的一种养殖方法。指将纯化后的微藻接种到装有培养液的容器中，提供适当的温度、盐度、pH值等条件，培养一段时间后一次性收获。这种方法操作简便，但随着培养液中营养成分的消耗，细胞的生长逐渐停止，因而很难达到高的细胞浓度，如果加大营养成分的初始浓度，又会对微藻的生长产生抑制作用。补料培养是在分批培养的过程中，连续或间断性的添加营养物质，满足微藻的生长需要。这种方法减弱了由于营养物浓度过高对微藻的抑制作用，因而可以获得较高的微藻产量。但如果在养殖系统中用了具有强离子性的有机物(如乙酸钠)，培养液中的离子浓度就会增加，微藻的生长受到抑制。连续培养又分为半连续培养和连续培养两种。半连续培养是指定期定量的加入培养液和取出培养物；连续培养是在培养过程中不断的加入培养液和取出培养物，使流入速度和流出速度保持平衡。通过调整稀释速度，既可以使培养器中的营养成分保持恒定，又可以使微藻的细胞浓度保持不变。这种培养方式消除了由于营养液浓度过高或有害物质的积累而造成的不良影响。其中恒化器培养较为常用。异养培养小球藻时应用最广泛的是．aasal改良培养基【31】和K2N培养基1321，其主要组成成份如表1．1所示。-．4．-北京科技大学硕士学位论文表I．IBasal和K2N培养基的配方1．2．3小球藻的规模生产关于小球藻的规模培养的研究可以分为四个阶段：开放式池塘培养系统、封闭式池塘培养系统、封闭式光照反应器和发酵异养培养系统。(1)开放式池塘规模培养开放池培养系统是最古老、最简单的藻类培养体系，它包括天然池塘和人工池塘两种形式。天然池塘培养系统一般是利用天然大型池塘进行藻类培养，不加任何特殊装置，因此造价和运行费用低，并且可以同污水处理和水产养殖等结合起来操作，从而增加经济效益。但这种系统的主要问题是不能进行某一纯藻种的培养，光照和温度等环境因子也无法控制。因而培养出的藻细胞浓度很低(细胞干重一般在0．5g-L"1左右)，收获细胞等后加工工程的费用也很高【2】。人工池培养系统一般是一个较小的天然池塘或人造池经过改造附加搅拌、二氧化碳控制等装置的基础上建造成的。在培养过程中通过含有一定比．5．北京科技大学硕士学位论文例的二氧化碳气体曝气、适宜的培养基和条件进行控制，可以提高藻类的光合效率和培养出比较高的藻细胞浓度。目前，国际上小球藻大规模开放池培养池面积为1000～5000In2，水深15～30gin，采用螺旋浆搅拌，平均生长量16～22g'm2．d-1【33】。(2)封闭式池塘规模培养封闭池培养系统克服了开放式培养系统中二氧化碳供应不足、温度无法控制、水分蒸发损失过快和容易污染等诸多缺点。其中简单的一种形式就是在开放式池塘上加一个透明的盖子。封闭式池塘培养也有点，那就是加盖后，盖上沾有的灰尘会使光照不足的问题更为突出，从而影响光合效率和细胞浓度。(3倒‘闭式光照反应器光合反应器大规模培养小球藻的研究始于上世纪60年代末，采用乌兹别克斯坦学者设计的一种K-06型光合反应器，小球藻生长速率可达19～30g-m"2．d-l，培养出的藻细胞干重浓度达到了250～1500mg-dry-wtL～。另外，土库曼科学院设计的玻璃管道全密闭全天候光合反应器，使小球藻的生长速率达到了20g-m"2．d-1。上世纪80年代后玻璃管道光合反应器的研究和应用更加受到重视，李师翁等Ⅲ】研制了容积为1000L的玻璃管道光合生物反应器进行小球藻大规模中试培养研究。当停留时间为3d，收获培养物总体积的1／3时，可建立稳定的连续培养系统，培养出的小球藻的细胞干重浓度达到3g·L-l，最大生长量为0．605g．L-1．d-l，平均生长量为0．375g．L．1·d．1。(4)发酵异养培养系统异养培养系统不需要光照，这既减少了安装和提供光源所需的投资和运转费用，又避免了安装光源所带来的设备设计和制造上的麻烦。异养培养可以借用现有发酵工业的厂房与设备，扩大了生产的通用性。并且在异养培养时，发酵罐、管道系统和培养基很容易灭菌，运转和操作过程中也容易防止培养物受到污染，培养条件容易控制，更为可贵的是，异养培养大大提高了单位体积培养液中藻细胞浓度。史贤明等【3l】利用Basal改良培养基在30L发酵罐中培养ChlorellaprotothecoidesC8-41，最大细胞密度达到了16Ag．L．1，生产率为O．92·d．1；陈掣32】用K2N培养基培养Chlorellasorokiniana，最终产量可达9g-L"1。LiangShizhong等瞰l应用流加工艺在5、50、200、800、4000L机械搅拌发酵罐中大规模异养培养小球藻，与间歇异养或光照自养相比，流加培养大大地提高了细胞浓度和生产率，最高细胞质量浓度达到43．31g．L-l，比生长速率达到0．069h-1，细胞生产率达到0．62罟L-1．h．1，结果表明，利用传统的机械搅拌发酵罐大规模生产小球藻有良好的商业化前景。Ogbonna等嗣研究了异养自养相结合培养小球藻，异养培养在发酵罐中进行，异养培养结束后转入自养培养，最终获得的细胞干．6．北京科技大学硕士学位论文重为14g'L"1，自养培养过程主要是增加蛋白质和叶绿素含量。桂林鲁蚓以大米糖化醪为碳源在发酵罐中培养蛋白核小球藻，最高生物量达到了18．3g．L_l。工业上生产小球藻的流程如图1．1所示。图1．1小球藻工业生产流程1．2．4植物激素在藻类培养中的应用植物激素是植物体内产生的一种化学物质，具有重要的生理功能，是植物整个生命活动过程中不可缺少的。由于这些化学物质是植物体内自身生成的，又称之为植物内源性激素。目前生产上使用的大都是一些人工合成的化合物，通称“植物生长调节剂”，这些化合物在植物体内并不存在，但却与天然植物激素具有相同的作用。半个多世纪以来，人们已经从植物体内发现了5大类植物激素，它们是生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯，前3类激素为促进型，后2类为抑制型，它们在植物体内同时存在，其含量随着植物的生长而不断变化，有时以促进型占优势，有时以抑制型占优势。这5类植物激素，此长彼落，平衡调节，在植物的生长发育中，都起到了十分重要的作用。在藻类的培养中，有关植物激素及生长调节物质对其生长有何作用的报道甚少。刘世名等口1研究了几种植物激素对小球藻异养培养的影响。结果表明，吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(mA)及6．苄氨基嘌呤(6-BA)三种植物激素均能不同程度地促进了小球藻的异养生长，培养s36h时，IAA或IBA以20mg／L的促进小球藻异养生长的效应最大，100mg／LIAA或IBA则抑制了藻的生长；>36h时，100mg／LIAA或IBA表现出促进小球藻生长的效应，并最终获最大净增长量；6-BA以0．1mg／L的促进作用最大。IBA与6-BA组 合同 劳动合同范本免费下载装修合同范本免费下载租赁合同免费下载房屋买卖合同下载劳务合同范本下载 样表现出促进小球藻异养生长的效应，但并非IBA与6-BA简．7．北京科技大学硕士学位论文单的加合效应，5ms／LIBA与6-BA组合的效应维持6-BA单因子的作用趋势，20m璺，LIBA与Img／L6-BA组合的效应大于与0．1mg／L6-BA组合的，100mg／LIBA与0．Img／L6-BA组合的效应在96h时大于与1me／L6-BA组合的，>36h时则相反。另外，高浓度IBA(>--20me／L)与6-BA组合抑制了前中期异养藻对葡萄糖的吸收，但加速了中后期葡萄糖的吸收。再者，IBA与6-BA组合加速了异养小球藻对N03。的吸收。1．2．5小球藻对常用抗生素的敏感性抗生素以前被称为抗菌素，是由微生物产生的、在低浓度下具有抑制或杀死其他微生物作用的化学物质。由于不同种类的抗生素的化学成分不同，因此它们对微生物的作用机理也不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成，在人类的细菌性疾病治疗和水产养殖病害的防治中发挥了重要作用；其抑制细菌生长的原理被应用到在海洋藻类的研究上只有近十年的历史。在海洋微藻的常规培养中，藻液中存在着大量的不同种类的海洋细菌，这些海洋细菌与藻类之间存在着密切的联系：它们既可能促进微藻的生长，也可能抑制其生长，因此藻、菌之间的关系一直是微藻研究重要课题之一。同时，随着海洋微藻被作为水产动物幼体的饵料，为了抑制育苗水体中细菌的生长而大量使用的抗生素成为微藻必然面对的环境因素，所以研究海洋微藻对抗生素的敏感性有其特定的生物学及实用意义。在小球藻的异养培养中，难免会有杂菌的进入，不易保证藻种的纯度，利用抗生素可以抑制藻种培养过程中细菌的生长。陈颖等【3s】研究了小球藻对G418、潮霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素等5种抗生素的敏感性，结果表明：小球藻对氯霉素、链霉素和卡那霉素不敏感，对潮霉素较为敏感，100}lg／mL用量可抑制固体培养中小球藻的生长；对G418则高度敏感，30pg／mL即可完全抑制固体培养中小球藻的生长，15pg／mL可完全抑制液体培养中小球藻的生长。1．3小球藻细胞中有价值的生命活眭物质小球藻细胞中富含蛋白质、氨基酸、脂类、色素等有用成分，具有很高的营养价值。按干重计，小球藻细胞的灰分含量在1．36％～20．21％之间，碳、氢、氮、氧—般以占除掉灰分以外的干物质的比率来表示，其中碳49．51％～70．71％，氢6．78％～lO．53％，氮1．17％～14．1l％，氧17．87％～34．40％；蛋白质含量为7．3％～88％，碳水化合物为5．7％～38％，脂类为4．5％～86％【zJ。-8一北京科技大学硕士学位论文1．3．1色素小球藻细胞中叶绿素的含量为4％～6％，高于现在商业上用于叶绿素提取的脱水紫苜蓿的叶绿素含量。以干物质计，小球藻细胞中叶绿素a的含量为1．97％～2．04％，叶绿素b的含量为O．55％～0．58％，胡萝h素的含量为O．0441％～O．0448％。培养条件对小球藻细胞中色素含量的影响很大。以细胞干重为基准进行计算，在不同培养条件下生长的小球藻细胞中，色素含量的变化幅度为：叶绿素(a+b)o．01％～6％；胡萝h素o．002％～0．16％c2J。在进行小球藻的异养培养时，高浓度的葡萄糖会抑制叶绿素合成过程中6一氨基乙酰丙酸以后的反应步骤，同时加快叶绿素降解，因此导致小球藻细胞中叶绿素消失，细胞发黄139】，细胞内胡萝h素含量下降。叶黄素(Lutein)，又名植物黄体素、叶黄体，是广泛存在于花卉、水果、蔬菜等植物中的天然色素。叶黄素属于类胡萝h素类的四萜类化合物，它有两个紫罗兰环，叶黄素的分子式为C40H5602，分子量为568．85。叶黄素为橙黄色粉末，浆状或深黄棕色液体，有弱的干草气味，不溶于水，溶于某些有机溶剂如丙酮、甲醇、异丙醇、正己烷、甲乙酮和二氯甲烷等。叶黄素在偏酸溶液、弱光和低温下比较稳定，在偏碱性条件下较不稳定，在弱酸、弱碱性条件下，发生颜色可逆变化，在强碱、强光或高温条件下被破坏。其结构式如下：拄图1．2叶黄素结构式目前研究发现叶黄素主要有以下几种功能：叶黄素可以预防老年性眼球视网膜黄斑退化引起的视力下降与失明；叶黄素还有预防细胞衰老和肌体老化的功能；人体吸收叶黄素后，可预防和抑制肿瘤和心血管疾病的发生和发展；叶黄素的化学降解产物可提供烟草中的香味物质；叶黄素是植物体内的一种天然色素，可用作着色剂来调节食品和饮料的色泽，它还可作为饲料添加剂添加到禽类饲料中[401。目前，叶黄素提取方法主要有以下几种：f1)有机溶剂浸提法．9．北京科技大学硕士学位论文常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、石油醚等。万寿菊中叶黄素在中性条件下难溶于水，而在乙醇中．其溶解度增加较多。因此，选用乙醇作溶剂在碱性条件下进行提取，提取液呈棕黄色，经减压蒸馏、浓缩、沉淀、干燥得褐色固体【4”。宋吴等旧研究万寿菊中叶黄素在几种有机纯溶剂(四氢呋喃、石油醚、正己烷、丙酮)及这些溶剂和乙醇二元混合溶剂中溶解规律，结果表明，适当二组分混合溶剂对叶黄素浸取效果比纯溶剂好。在二组分混合溶剂中，叶黄素溶解度与溶液极l生关系往往表现为呈上抛物线关系。在其它实验条件均相同时，超声波振荡、升高温度可提高溶解效率3～6倍，原料颗粒越小，溶解效率也越高。(2)干燥法研究成功一种新型转筒式干燥机，用以干燥万寿菊，可从中提取叶黄素。叶黄素多少取决于干燥时间长短。当捶击比率不同时捶击效率就在70％～90％之间波动。叶黄素的多少决定于干燥时间长短。但在相同的干燥时间里，70"C下干燥提取的叶黄素含量比60℃下提取的叶黄素含量要少。(3)高效液相色谱分析法以二氯甲烷(22．5mL汁乙腈(9．5mL汁甲醇(67．5mLp水(O．5mL)为流动相，流量为1．0mL／min。使用检测器f波长为450姗)检测分离测定类胡萝h素和叶绿素，进样量为20肛Lo在此条件下，叶黄素保留时间为3．0min。取螺旋藻培养液于离心管中，离心后弃去溶液，加水洗涤后，加入2mL体积分数的90％丙酮水溶液，置于超声波发生器使螺旋藻细胞破碎。离心后取上层提取液用高效液相色谱法测定叶黄素含量为1．65ltg／mgt43】。(4)改良的高效色谱分析法这种方法能迅速地分离高等植物中光合的色素，所用仪器为高效液相色谱分析系统，采用美国Waters公司的680型自动程序梯度控制器，501型高压液相泵，M2490型可编程序紫外可见光检测器，730型数据处理器，记录保留时间和峰面积，走纸速度为2era／mill。选择最佳的色谱分离条件是色谱分析中的关键，本方法选用两种流动相A液和B液。采用线性梯度洗脱分离色素组分。用改良的高效色谱分析法分析叶黄素循环组分，具有快速、准确、分离度好以及重复稳定等优点，可以认为是目前分析测定叶黄素循环组分的最佳方法州。(5)萃取法从万寿菊中萃取叶黄素，青岛高科技工业园青大天然产物研究所已形成工业化生产，其提取工艺为：万寿菊鲜花—+发酵—◆干燥——卜造粒—+正己烷萃取—啼负压蒸发分离——'叶黄素树脂。．10．北京科技大学硕士学位论文另有超临界co：萃取法。该方法将万寿菊经发酵、干燥、粉碎后做原料，用超临界C02以乙醇做夹带剂萃取万寿菊花浸膏，将万寿菊花浸膏经氢氧化钾皂化得到水溶性天然食用色素叶黄素树脂。(6)微波加热法杨丽飞等f45】介绍以茶叶为原料，以6#溶剂油为介质，用微波加热法提取叶黄素，并通过改变溶剂浓度，微波功率，提取时间等条件对产品提取率影响进行探讨，获得最佳提取条件。结果表明：物料比(w／v)1：25，时间308，微波浸提2次，叶黄素浸提率达到65．45％。改方法与传统提取方法相比，省溶剂，大大提高提取效率。∽膜分离技术目前天然色素提取大多采用浸提、蒸发浓缩、溶剂提纯等传统工艺，存在能耗高、溶剂需回收、过程复杂等问题，且产品纯度往往不高。因此，无论从降低成本还是提高产品质量角度来看，将膜分离技术用于天然色素提取是极有价值的。采用陶瓷膜微滤@回，对浸提液进行精滤提纯，再用反渗透膜(RO)浓缩过滤液。这种工艺以膜分离技术为主体，替代传统乙醇提纯和蒸发浓缩，工艺过程简单、色素溶液基本处于常温操作状态，既节约能源，又保证色素产品质量。王素琴等[461利用高效液相色谱法测定小球藻中的叶黄素，结果表明小球藻中确实含有叶黄素，且不同培养方式下小球藻对叶黄素的生物合成量有所不同，含量一般可达到0．6mg·一以上。桂林等【41确定了从蛋白核小球藻中提取叶黄素的最佳工艺条件为：用甲醇一二氯甲烷(2／1，v／v)混合溶剂提取，在30℃下破碎2次，每次5rain，料液比为1：40(v／v)得到的提取率为87．1％。ShiXianming等圈研究了异养培养小球藻时不同葡萄糖浓度对叶黄素产量的影响，结果表明葡萄糖的初始浓度对小球藻细胞中的叶黄素的生物合成有着重要的影响，在一定范围内，叶黄素含量随葡萄糖浓度的升高而提高。当初始葡萄糖浓度从10g'U1提高到40g·L-1时，叶黄素含量也从19．39mg·L-1上升到75．65mg·L-1。1．3．2蛋白质和氨基酸小球藻具有很高的蛋白质含量，但蛋白质含量的高低与生长的环境条件有直接关系。例如，蛋白核小球藻如果生长在良好的环境中，其细胞中的蛋白质含量一般不低于50％，明显高于植物蛋白源。当自养小球藻细胞向异养生长转化时，伴随有细胞内总蛋白质的减少，异养小球藻细胞中可溶性总蛋白只占自养小球藻细胞中可溶性总蛋白的20％【zl。具有高蛋白质含量的食品并非具有高营养价值，除蛋白质外，还必须有平衡的必需氨基酸。Fisher和Burlew分析了来自蛋白核小球藻蛋白质样品中的氨基酸组成，并计算出蛋白质必需氨基酸指数为62t481。在一定条件下，用蛋白质必需氨基酸指数来预测蛋白北京科技大学硕士学位论文质的生物学价值极为有用，它以全蛋蛋白质的必需氨基酸组成为基础，并定义其指数为100。蛋白核小球藻蛋白质必需氨基酸指数处于面粉、玉米和花生仁等植物蛋白质这一等级。1．3．3碳水化合物和维生素小球藻细胞中碳水化合物的含量一般少于20％。藻类细胞中的特征碳水化合物与高等植物有所不同，某些藻类的细胞壁和其它结构部分是由藻朊酸所构成的复合物为基本组成部分。小球藻细胞中富含维生素A，还含有维生素Bl和维生素K。一般认为，小球藻用于食品或饲料时，足以提供人或动物生长所需的维生素。1．3．4不饱和脂肪酸目前，利用微藻生产多不饱和脂肪酸(PUFAs)如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是藻类生物技术的一个研究热点。PUFAs具有降血脂、抑制血小板聚集、降血压和抗动脉粥样硬化等多方面的保健和药用价值f4¨”，随着对多不饱和脂肪酸的生理、营养和药理作用的进一步研究，对EPA和DHA等多不饱和脂肪酸的需求量越来越大，仅从鱼油中提取已不能满足需要，因此培养微藻来生产多不饱和脂肪酸具有潜在的应用前景。小球藻的油脂中含EPA高达900,6以上，可以认为是一种EPA'‘活体储藏库”唧。我国台湾研究人员对海水微细小球藻在不同盐度、pH值情况下产EPA能力进行了研究，发现盐度为35g'L-I，15℃、pH=10、光照3000lux条件下生成EPA达42．6mg·L1：若以单位生物量计，盐度为25g-L"1，15"C、pH=6、光照3000lux下生成EPA可达90．4mg／g细胞干重，显示出海水微细小球藻具有良好的生产EPA的能力圈，为了进一步提高普通小球藻的EPA高合成能力，可以采用细胞融合技术获得杂交小球藻，它能更有效更快地合成EPA【531。由此可见，潜力巨大而充满商机的小球藻EPA的开发，将为功能性食品及医疗保健品的研带《创造有利条件。此外，小球藻还具有生产DHA的能力。林学政等【蚓研究发现，普通小球藻细胞中的EPA含量很高，可以达到28％。Chert[22】报道，在小球藻的异养培养中，PUFAs的产生量与氮源添加量有关，如果控制氮源适量，避免藻体生物量增长过快，会使PUFAs累积量相对提高。因此，不断改善小球藻的培养条件，可以提高PUFAs的产量并实现产业化生产。1．3．5小球藻生长因子小球藻生长因子(ChlorellaGrowthFactor，CGF)也叫小球藻精，它的主要成分是以短链多肽蛋白与珍贵的天然核酸复合形式存在，含有17种游离氨基酸，其中有8种人体．12．北京科技大学硕士学位论文必需但只能通过外源补充的功能性氨基醪”。从小球藻中提取的生长因子中含有对细菌、酵母、蘑菇生长的促进物质，植物激素物质和调味物质。除此之外，还含有核酸、多糖、多肽、蛋白质、酶、维生素、矿物质等成分，被称为‘‘类荷尔蒙d蚓，由于它的存在，使得小球藻细胞能够在一日之内完成一次以上的细胞分裂。小球藻生长因子和“类荷尔蒙”的生理功能主要有激活淋巴细胞，可增强人体免疫能力，活化人体细胞，促进儿童生长发育，抵抗外来疾病的入侵，促进人体受伤组织的修复等功能。人服用小球藻后可以增加人体抵抗有机污染物物和重金属的能力，同时还可以防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病。因此，小球藻生长因子的提取技术及其生理活性的研究已经成为英、美、日等国家开发小球藻的热点。胡开辉等册研究了小球藻生长因子对啤酒酵母生长的效应，结果表明小球藻细胞活性物质可显著促进啤酒酵母的生长和繁殖，加速酵母发酵进程，提前到达产气高峰。同时还发现小球藻提取物能提高酵母发酵过程抗杂菌能力，且细胞活性物质可以提高酵母菌对糖的利用率，在酵母工业、酿酒工业生产上具有良好的应用前景。14微藻细胞的采收分离状况目前国际上藻类大规模生产养殖主要采用下面几种生物量采收方法。(1)絮凝沉淀法絮凝沉淀是一种传统的生物分离方法，其絮凝机理目前主要有三种理论解释：①经典D．L．v．o理论，认为絮凝过程是由于细胞表面的极性集团引起的表面吸附而使表面的自由能降低的过程【151；②高聚物架桥理论，认为细胞与高聚物在细胞表面形成胞外纤丝相互交联而形成fl习；③双电层理论，认为絮凝过程是加入电解质后，相同电荷排斥以及细胞表面水合程度不同而产生聚并，同时细胞表面离子键和氢键也参与了细胞的絮凝过程闭。在微藻培养悬浮液中加入无机离子试剂，以改变藻细胞的电荷性质，使其吸附带有电性的离子，然后加入较经济的无毒性带负电荷的有机或生物离子絮凝剂，通过静电力、分子间吸引力和氢键等作用，是藻细胞和絮凝剂相互吸附、团聚、絮凝沉淀，从而达到悬浮培养液中藻细胞的分离的目的。(2)离心分离法离心分离是生物分离中常用的一种强制式的机械分离方法。几乎所有的微藻都能用离心分离法分离。目前在微藻分离中应用较多的是自动卸渣的碟式离心分离机，易于操作，并能连续工作几星期，这对大规模的水量处理来说是必要的。日本的天然B技术公司采用离心法收集盐藻，其盐藻养殖生产过程全部参数由计算机来显示和自动控制，以连续进料，稳定转速离心分离培养悬浮液自动排出的盐藻乳液经喷雾干燥成藻粉产品，培养卤液循环使用。但离心分离法对设备要求较高，且耗能较大，使生产成本大大增加；．13．北京科技大学硕士学位论文而且离心法对微藻的细胞大小有一定要求，如个体较大的螺旋藻铰易分离，而细胞较小的小球藻则较难分离。(3汽浮法采收气浮法分离是一种较新的生物分离方法，在生物发酵液分离、废水处理以及微藻的分离采收中都有应用。气浮分离的基本原理与絮凝沉淀法有部分相似，分离前，先在悬浮液中加入絮凝剂，使悬浮的微生物或细胞产生絮凝，然后从气浮池底部通过气体分配头释放出无数微细气泡，这些小气泡在上浮中碰到絮凝粒团则吸附其上，使得絮状物或细小悬浮物因粘附气泡后整体密度变小而浮升到液体表面，再由刮渣机刮入贮槽而达到悬浮物的分离或采收微藻的目的。澳大利亚西部生物公司盐藻的富集采用气浮法。我国新疆吐鲁番七星湖化工厂在盐藻的中试养殖生产中，采用气浮法富集盐藻，其采收时，先在悬浮液中加入无机采收剂三氯化铁，使盐藻细胞吸附铁离子带正电荷，后加入有机阴离子型絮凝剂，带正电的藻细胞与絮凝剂成团，加速藻细胞从培养液中分离，再通过气浮，固液分离和藻泥精制提取达到采收的目的。1．5小球藻的保存近50年来，由于超低温保存技术的建立和发展，已有多种植物的细胞、组织和器官实现了超低温冰冻保存。已有研究表明，在超低温(通常指液氮温度，一196℃)条件下，细胞的全部代谢活动近于完全停止，因而可以保持种质的遗传稳定性，达到长期保存的目的【矧。目前，藻类种质的超低温保存技术已受到广泛的重视。迄今为止，绝大多数藻类是采用两步冰冻法保存【5明，包括二甲基ff_．Ii日(DMSo)的NA．、冷冻和化冻、DMSO的去除两个步骤。在室温下离心收获藻类，用新鲜培养基再悬浮至所需密度，取藻液于冻干管中，再加入预先配制的为所需浓度2倍的DMSO溶液，混匀，平衡一段时间后移入低温浴槽降温至-30℃，停留15mill，移入液氮中；将在液氮中保存2h的冻干管取出，立即放入40℃恒温水浴中迅速摇动，直到最后—个冰晶消失后分别移入室温和0℃冰水浴中，用培养基稀释样品即可。还有少量采用玻璃化法超低温保存藻类嗍，较理想的技术程序为：先用甘油和蔗糖溶液预处理小球藻，然后加入含有30％蔗糖+15％乙二醇+10％二甲基亚砜+培养液的玻璃化保护剂，放入0℃冰中预冻，再投入液氮中保存；保存半年(或以上)后，将冻存管取出，立刻放入40℃恒温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰晶消失后移入室温中；化冻后的小球藻在无菌的条件下转入培养基中室温平衡，然后进行培养，即可获得活化的小球藻。．14．北京科技大学硕士学位论文1．6，J、球藻的开发前景及应用展望小球藻的开发应用越来越受到人们的重视，不但在食品保健、医药制品和环境保护等方面得到开发利用，而且在化妆品、水产养殖等方面也受到人们的青睐，甚至作为生物技术或基因工程的受体在科研材料上也有了一席用武之地。(1)健康食品小球藻健康食品可分为两类：一类是直接用食品级藻粉制成藻片或胶囊作为营养保健食品；另一类是获得医药批文，在药房出售或作医生处方药物。20世纪40年代后期，美国、日本、德国和以色列曾利用小球藻来解决第二次世界大战期间的能源问题和战后的饥饿问题阁。小球藻保健食品不但在日本、美国和欧洲等发达国家的销量持续上升，而且在一些发展中国家也日益被人们所认可。小球藻是高价值的人类保健食品，其原因是小球藻含有蛋白质含量高达65％～70％，多种维生素，8种人体必需的氨基酸，多种微量元素如铁、钾、钠、镁和钙等，大量的藻胆蛋白，具有增强人体机体的免疫功能【6l】。(2)医药产品小球藻具有显著的药理作用和保健功能[621：①抗肿瘤，小球藻多糖和糖蛋白对腹水肝癌AH44、AH41C、白血病L-120、艾氏腹癌、Meth、A肿瘤均显示了抗肿瘤活性；②对消化性溃疡有医疗作用，这在动物实验中也得到了证实；③增强免疫和抗感染能力；④能解毒保肝、降低血压；⑤防治缺铁性贫血；⑥抗辐射；⑦抗高脂血症和动脉粥样硬化等等。小球藻中含有丰富的生物活性物质，已证明从小球藻中可提取出两种分子量不同的糖蛋白：其一分子量分别为120，000和70，000，均具有抗肿瘤活性[621。此外，小球藻多糖和糖蛋白对腹水肝癌、that病等恶性肿瘤均显示了抗肿瘤活性【62】。小球藻中具有抗肿瘤活性、增强免疫力和抗病原菌病毒侵染能力等重要生命活性成分的识别与研究，已经成为倍受人们关注的藻类生物技术研究热点。原西德l(id大学药物生物学研究所目前正在进行小球藻潜在药物成份分析研究，同时美国的一些科研机构和公司也正在探索从微藻中提取抗癌、抗感染和治疗艾兹病的活性成分。此外，小球藻细胞中的叶黄素不仅可以预防老年性眼球视网膜黄斑退化引起的视力下降与失明，而且能够预防人体细胞衰老和肌体老化，以及抑制肿瘤和心血管疾病的发生和发展。(31环境保护大量含氮和磷的污水排入天然水体中可导致水体的富营养化，引起严重的蓝藻水华污染。小球藻能有效的去除污水中的氮和磷，将其转化为藻细胞的成分旧】。深颂东1641研究了小球藻除磷脱氮的效果，发现口川／圜比值在为7~8时，小球藻对氮的吸收能力最强。闰涮65】和吴能表等‘删的研究结果表明：各种小球藻对Zn2+、Cu2+、Ni2+、c一．15．北京科技大学硕士学位论文等金属离子都有一定的吸附能力，其中对Cu2*的吸附能力相对较强，这主要是因为Cuz+除了可以结合与细胞表面带负电荷的活性基团外，还可以与细胞组分中不带电的基团络合【6”。不同小球藻对同一离子的吸附能力存在差异，同一小球藻对不同离子的吸附能力也不同。藻类对重金属污染环境适应主要是通过诱导产生金属硫蛋白把有害的离子形式转变为无害的蛋白结合形式来实现的【6引。闫海的研究结果表明，蛋白核小球藻具备降解多种有机污染物的能力[69,70l，首次提出了藻类降解有机污染物的动力学方程rn】。上述报道表明小球藻在废水处理和保证水生生态系统的平衡与稳定方面都可以作为一种非常好的生物活体材料发挥作用。(4)畜牧水产养殖业小球藻可以直接或间接作为对虾和多种名贵经济鱼类育苗的饵料，目前我国主要从日本和韩国进口超高细胞浓度的小球藻来满足水产养殖对小球藻的需求。近年来，人们致力于建立一个废水处理一水产养殖的联合体系，如DePauw等12】人曾利用拟酵母小球藻进行长期的连续培养或半连续培养试验，用猪粪便稀释以后予以通气作为唯一营养源，藻细胞再作为水产养殖的饵料。另外，小球藻是养殖业的理想饲料【纲，在配合饲料中添加10％的小球藻粉，使鸡的产蛋率提高20％～30％，蛋黄的颜色变深，营养价值提高。在猪饲料中添加小球藻后，使猪的食欲大增，日增重达500～620g。(5)化妆品小球藻中含有未知的生理活性物质，具有活化皮肤细胞，加速新陈代谢，延缓细胞衰老的功效，是优良的化妆品原料。前苏联、日本等国均有将小球藻水溶性提取物添加剂加到护肤品和口红等化妆品的专利【6”。随着分子生物学和基因工程的发展，小球藻基因的克隆与功能分析方面的研究尚不多见。小球藻属于真核细胞生物并具有细胞壁，因此在其基因方面的研究可能存在一定的困难，但作为微藻生物技术不可缺少的部分，小球藻功能基因的研究将有可能成为一个未来非常重要的研究热点。1．7存在的问题和不足一般认为小球藻属于低等植物，主要吸收无机碳通过光合作用合成有机物。现在国内外小球藻生产中使用较多的是开放式或封闭式池塘培养系统(即自养方式)，这种培养系统造价和运转费用较低，但最大的问题在于细胞浓度低(通常干重<