结核分枝杆菌药敏试验结果的判读

1结核分枝杆菌药敏试验结果的判读国家结核病临床实验室结核病耐药问题提高了临床对DST的需求MDRXDRTDRDRIncreasingTrendAnyoneormoreOtherthanMDR/XDRINHandRIFMDRPlusQuinoloneandAminoglyocsideAlmostallthedrugs23药物敏感性试验的方法一、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型药敏试验ü固体培养基药敏试验：绝对浓度法;比例法ü液体培养基药敏试验：MGIT960;BacT/ALERT3D；üMIC测定：药敏板法二、分子药敏试验ü基因测序ü间接基因测序法:线性探针杂交技术；基因芯片；GeneXpert；HRM41.同一份患者不同时间留取的标本结果不一致2.同一份患者不同的方法间结果不一致药敏试验结果的不一致问题5比例法和绝对浓度法的选择6绝对浓度法与比例法的差别差异比例法绝对浓度法接种菌量10-4mg和10-6mg10-3mg培养基药物浓度IHN：0.2μg/mlSM：4.0μg/mlRFP：40μg/mlEMB：2.0μg/mlKM:30μg/mlOFLX:3μg/mlIHN：1，10μg/mlSM：10，100μg/mlRFP：50，250μg/mlEMB：5，50μg/mlKM:30μg/mlOFLX:3μg/ml 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 结果时间4-6周4周7绝对浓度法和比例法药敏试验出现结果差异刘宇红.中华结核和呼吸杂志.2000用两种药敏试验方法测定了360株结核分枝杆菌对H、R、S、E的药敏性,两种方法的符合率：H81.1%R92.5%S83.6%E98.6%比例法诊断耐药的比例高于绝对浓度法对两种方法不符合的菌株的MIC测定显示：这些菌株对相应药物的MIC值都接近临界值。8(1)能够最大限度的区分临床上可能的敏感株和可能的耐药株；(2) 这个浓度应该是血和组织浓度可以达到的；(3)当以这个浓度诊断细菌学耐药时，可能会出现临床反应性降低。耐药诊断临界值的确定:9可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况（1）Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)FrequencyofstrainsClinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)BreakPointMIC10可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况（2）Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)FrequencyofstrainsClinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)BreakpointMIC11可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况（3）Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)FrequencyofstrainsPSPR?BreakPointMIC12不同药物的表型药敏试验结果的可靠性差异较大一般认为，以固体培养基为基础的DST，诊断利福平和异烟肼耐药的准确性最高，链霉素和乙胺丁醇次之，而一些临界浓度与药物最低抑菌浓度(MIC)接近，或是临床疗效不显著的药物（如二线抗结核药物）的药敏试验结果需要慎重解读。13表型药敏试验V.S.V.S.14固体罗氏培养基法与液体培养基法DST的比较不同方法药物种类价格（ＲＭＢ）从培养到获得DST结果罗氏培养基多种（除PZA外）15元/药2-3个月液体培养基多种（包括PZA）>100元/药2-4周微孔板法药敏试验1.包含的药物种类较多，包括是包括了一些新型的抗结核药物，如莫西沙星，克拉霉素，阿莫西林/克拉维酸钾、氯法齐明。2.获得耐药浓度，发现中度敏感/低度耐药菌株。3.缩短报告结果时间。一般2周，特殊情况下3周报告结果。4.提高了标准化程度。药敏培养板的制备实现了标准化，结果的读取依赖专业设备，有利于质量控制。板式药敏试验的技术特点：17以固体药敏试验为对照评估板式药敏试验结果70人份对照药物符合率统计　总数/份符合数/份符合率备注（微孔板对罗氏）TCH7070100%--PNB7070100%--SM706897.10%2人份敏感对耐药（长到第二孔）：18012、17076INH706998.60%17993（0.8浓度敏感对1浓度敏感）EMB706897.10%2人份敏感对耐药17999、18044RFP706998.60%1人份敏感对耐药18026(NTM)RFT7070100%--LFX705781.40%10份是中敏对耐药17076、17081、17082、17085、18013、18014、18026、18043、18049、18051，3份是敏感对耐药18002、18015、18050AM706796%3人份中敏对敏感18012、18026、18039CM706288.60%3人份中敏对敏感18038、18026、18002，5人份中敏对耐药18039、18033、18015、18014、18013PAS706897.10%1人份中敏对敏感、1人份无法判读（跳孔）对敏感RFB705984.30%2人份中敏对敏感，9人份中敏对耐药PTO/ETO706694.30%4人份中敏对耐药18V.S.V.s.分子药敏试验基因芯片HAINTestGeneXpert19结核分枝杆菌耐药机制p基因型耐药：相关的耐药基因发生突变，是生长活跃的细菌的主要耐药机制，导致疗效降低。p表型耐药或药物耐受：由于一些表观遗传学改变，如蛋白表达水平变化，蛋白修饰等导致的持留菌对药物的敏感性降低，导致治疗的周期延长、复发。分子药敏技术的特点ü检测耐药相关基因的突变情况。üPCR扩增目的基因是前提。ü一般可以在标本获取后几个小时内完成检测。ü方法的灵敏度和特异度主要取决于被检测的耐药基因与耐药的相关性，但生产工艺也对结果的准确性至关重要。ü来自不同厂家的产品检测的原理一致，所不同的是结果的展示方式。线性探针杂交技术LineProbeAssay（LPA）VisualresultreadingforGenoType®MTBDRplus基因分型结果判读SubgroupSensitivitySpecificityRifampicin88.698.8Isoniazid79.398.8MDR----李强.中国防痨杂志.2009FirstreporteddatafromChinaonHAINLPA**179clinicalisolates城市sensitivityspecificityPPVNPV（95%CI）（95%CI）（95%CI）（95%CI）城市一60%(22.36~97.64%)95.53%(89.6~100%)65.22%(27.07~100%)94.48%(87.96~100%)城市二67.27%(42.96~91.58%)96.28%(91.85~100%)78.72%(55.79~100%)93.5%(87.81~99.19%)城市三66.67%(23.99~100%)98.63%(96.5~100%)66.67%(23.99~100%)98.63%(96.5~100%)城市四71.43%(33.56~100%)98.83%(96.6~100%)78.95%(43.02~100%)98.26%(95.56~100%)合计66.39%(49.75~83.03%)97.72%(96.08~99.36%)73.83%(57.51~90.15%)96.78%(94.85~98.71%)与传统药敏试验相比HainLPA诊断MDR的可靠性评估（盖茨项目）基因芯片技术Microarray/Bio-Chips芯片结果图例分组敏感性特异性Rifampicin92.097.2Isoniazid77.496.9MDR74.698.03个中心实验室评价芯片结果周杨.中华检验医学杂志.2011*1186isolatesconsistof800RFPresistantstrains,797INHresistantstrains,791MDRstrains,and380RFP-INHsensitivestrains.芯片敏感性特异性PPVNPVMDR(初治)63.64%98.16%50.0%98.94%MDR(复治)82.61%86.21%70.37%92.59%RFP耐药(初治)90.48%98.38%76.0%99.46RFP耐药(复治）91.18%91.49%88.57%93.48%INH耐药(初治)68.97%93.66%46.51%97.42%INH耐药(复治)92.59%87.04%78.13%95.92%李卫彬.中华临床医师杂志.2012一个地市级实验室的芯片评价结果全自动的利福平耐药检测实时PCR体系（XpertMTB/RIF）MigrationHealthDepartment3132XpertMTB/RIF的诊断效率敏感性涂+/培+敏感性涂-/培+特异性(非结核病)诊断MDR的敏感性诊断利福平敏感的特异性97.8%73.1%99.0%96.5%99.5%•对培养阳性的标本诊断的总的敏感性为92.1%•利福平耐药是MDR的一个很好的标志国家结核确诊病例非结核病例样本（例数）对照方法敏感性(95%CI)特异性(95%CI)法国32NA淋巴结(16)；胸水(7)；骨(5)培养（液体、固体）53.1%(34.7-70.9)NA西班牙41299活检组织(18)；CSF(6)；胃液(4)；脓性分泌物(5)；培养（液体、固体）95.1%(83.5-99.4)100%(98.8-100)南非205胸水（25）培养（液体）25%(8.7-49.1)100%(47.8-100)德国45476组织(30)；胃液(8)；尿(5)培养（液体、固体）77.3%(60.5-87.1)98.2%(96-98.9)南非3018淋巴结针吸活检组织涂片、病理阳性和/或培养（液体、固体）96.6%(86.6-100)88.9%(69.6-100)西班牙10841胸水(26)；淋巴结(34)；脓肿吸出物(17)；组织(12)培养（液体、固体）58.3%(48.5-67.8)100%(91.4-100)印度283250组织活检标本(25)；脓(98)；体液(24)联合涂片、培养和临床80.6%(75.5-85.0)99.6%(97.8-100)土耳其48128胸水，淋巴结，CSF，尿，皮肤活检标本，心包积液培养（液体、固体）或临床诊断54.2%(40.3-67.4)100%(97.2-100)意大利2681206活检物(94)，胸水(18)，胃液61)，脓(55)，CSF(14)，尿(16)，腹水，关节液，心包积液(10)培养（液体、固体）或临床诊断81.3%(76.2-85.8)99.8%(99.4-100)XpertMTB/RIF对肺外结核的诊断效率Lancet,2013,vol13:349结核定义及报告的新框架•XpertMTB/RIF是结核细菌学确认方法之一；•利福平耐药结核(RR-TB)成为耐药结核的新名词；•表型药敏试验会漏检一些真正的耐药株。对于Xpert诊断的利福平耐药，无需用其他方法确认，分子诊断结果与疗效更一致高分辨率熔解曲线技术(HighResolutionMelting，HRM)Wild-typeMutant-typeMutant/Wild-type高分辨率熔解曲线技术（HighResolutionMelting，HRM）在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，是其固有性质，当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。匹配度最好时，Tm值最高发生错配后，Tm值下降既有野生又有突变时，出现两个熔解峰探针游离时为淬灭状态BioRadCFX96QiagenRG6000RocheLightcycler480Ⅱ适配机型SLAN96P技术比较39不同分子药敏检测的结果不一致在排除了系统误差后，任一分子技术诊断耐药，应该首先考虑耐药。p不同方法覆盖的基因数量不同、探针位置不同p不同方法检测异质性菌群中耐药菌的敏感程度不同p不同次反应条件不一致的问题40No.ofcasesidentifiedon1stXpertassay(%)No.ofcasesidentifiedon2ndXpertassay(%)No.ofRIF-resistantcases35(100%)0(0)No.ofRIF-susceptiblecases99(100%)0(0)对134个重复XpertMTB/RIF测试的结果分析41表型药敏试验和分子药敏试验结果不一致V.S.42工作原理传统药敏细菌表型特征的变化分子生物学技术基因突变ü鉴于分子药敏的工作原理，任何一种方法都无法检测出100%的耐药株。ü菌群中存在敏感菌与耐药菌的混合时，尤其在耐药菌比例较低时，比如低于10%，分子药敏技术常无法检测出耐药，而比例法药敏试验能够检出1%菌群比例的耐药。ü传统药敏试验自身存在很多问题，其结果也存在可靠性问题。分子药敏结果与传统药敏试验的结果不一致的原因分析异质性问题一个菌群中既存在敏感株，也存在耐药株。引起异质性的原因有2种可能：1、再感染；2、发生耐药的早期阶段。异质性带来的问题：1、不同时间表型DST结果不一致。2、表型药敏试验与分子药敏试验结果不一致。如何理解不同方法间DST结果存在差异PangY.IJTL,2014吡嗪酰胺耐药与pncA,rpsA基因突变GuY,etal,DiagnMicrobiolInfectDis(2016)MDR菌株对PZA的敏感性PZA敏感和耐药菌株的基因突变情况以表型药敏试验结果作对照，单独检测pncA基因诊断耐药的敏感性、特异性、PPV和NPV分别为85.4%、91.7%、93.3%,82.1%；而联合检测pncA+rpsA基因后分别为92.7%、83.3%、88.4%、89.3%。诊断的角度评价pncA和rpsA基因突变的检测(1)PZA发挥作用所需的酸性条件能够抑制结核分枝杆菌的生长。当PH=5.5时，约20%～25%结核分枝杆菌临床分离株不能生长；在PH=6.0时，约3.5%的临床分离株不能生长；(2)菌体接种量过大导致PH值的升高，使PZase失活，从而导致假耐药的结果。接种菌体量大于107CFU/ml时，培养8天后培养基的PH值接近中性；当菌体量小于107CFU/ml，培养8天后，几乎没有改变；(3)对数生长期的菌比静止期的菌更容易出现PZA耐药结果。PZA对相同cfu值的MTB的杀菌浓度处于对数生长期的菌高于静止期的菌，原因可能是年老的细胞新陈代谢更弱，而PZA对静止期MTB细胞的作用较强。影响PZA表型药物敏感性实验可靠性的因素126株结核分枝杆菌临床分离株对LFX,MFX和OFLX的MIC值分布喹诺酮类药物的交叉耐药情况及耐药基因突变情况R:resistant;S:susceptible;M0.75:MOXDSTwiththeCCat0.75μg/ml.M2.0:MOXDSTwiththeCCat2μg/ml.54株OFLX耐药株对其它喹诺酮类药物的耐药情况（绝对浓度法）gyrA和gyrB的基因突变情况52ü不同表型药敏试验方法的结果存在差异，菌株理论上讲必定是耐药程度比较低的菌株。低度耐药与临床疗效间的联系，需要开展系统性研究进行评估。ü表型药敏试验与分子药敏诊断的结果存在差异，理论上讲分子方法诊断的耐药可靠性要高于表型药敏试验，但分子药敏诊断敏感而表型药敏诊断耐药时，要考虑被检测基因在耐药菌株中突变率的问题。ü分子诊断的敏感性可能比我们所了解的比例要高。小结：53