-体液蛋白质检验课件

体液蛋白质检验医学检验系本章 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 概要：第二节体液蛋白质测定第一节概述第一节概述血浆蛋白质的研究在以下几个领域进展迅速：1.各种血浆蛋白质的合成、降解、转换更新和代谢调节2.各种血浆蛋白质生理功能的进一步研究。3.血浆蛋白质的遗传变异，通过它了解人群与家族遗传特征。4.以新技术对血浆蛋白质进行微量和特异检测分析。5.在进化与个体发育的生化研究中，发现不少正常胎儿期蛋白可以在恶性肿瘤病人重新出现。6.血浆蛋白质在实际工作中广泛用于组织与细胞培养。7.在动脉粥样硬化及肿瘤等发病学研究中对血浆蛋白质有广泛涉及。一血浆蛋白质的组成、功能及分类（一）组成（二）功能可概括为：1营养作用2维持血浆胶体渗透压3维持血浆正常pH值4运输作用5免疫与防御功能6催化作用7代谢调控8凝血、抗凝血及纤溶作用等。α1球蛋白：ＡＡＴＡＡＧＡＦＰＨＤＬα2球蛋白：α2ＭＧＨpＣＥＲβ球蛋白：ＴＲＦＬＤＬ＆ＶＬＤＬＣ3，Ｃ４β2-mFgγ球蛋白：Ig(IgM,IgA,IgG)CRP功能分类:(二)白蛋白(albuminAlb)来源：肝实质细胞。理化性质：血浆含量最多的蛋白，占血浆总蛋白的57－68％，半寿期15-19d，pH7.4环境中带负电荷。功能：1.血浆中许多激素和药物的主要载体。2.维持血浆胶体渗透压。3.具有相当的缓冲酸碱的功能。4.属于APR－。5.运输作用，可与某些金属离子和化合物结合，如Cu2+、　　Ca2+、BIL，将其运输到各自的靶细胞。临床意义：1.个体营养指标。　>35g/L为正常；<34g/L为缺乏；<21g/L为严重缺乏。2.影响许多配体血循环存在形式。3.监测脱水的一项指标。4.低白蛋白血症为临床常见。5.白蛋白遗传性变异。遗传分型：分离鉴定33种等位基因，最多见PiMM型，另有PiZZ、PiSS、PiSZ、PiMZ、PiMS等。临床意义：低血浆AAT见于胎儿呼吸窘迫综合征；M型AAT缺陷时，蛋白水解酶的过度作用损伤组织弹性纤维，可导致肺气肿，肝硬化等。(五)甲胎蛋白(α1-fetoproteinAFP)来源：胎儿肝理化性质：MW6.9万，胎儿期占血浆蛋白总量1/3，出生时为<5mg/L，周岁接近成人水平(低于10μg/L)。临床意义：1.产妇羊水或母体血浆AFP用于胎儿产前监测：高于正常提示可能有开放性神经管缺陷、无脑儿、脐膨出、先天性食管闭锁等。2.成人AFP用于肝癌，生殖细胞癌等监测(返祖现象)，是原发性肝癌最灵敏特异的肿瘤标志物。(六)结合珠蛋白（haptoglotinHp）理化性质：电泳中属α2­区带球蛋白，分子为α2β2两对肽链四聚体。遗传分型：α链有α1和α2两型，α1又有α1F和α1S两种遗传分型，由α1F、α1S、α2三种等位基因编码形成αβ聚合体使个体存在多种遗传表现型，又决定了不同遗传表现型个体血浆中Hp性质上差异。(七)α2--巨球蛋白(α2-macroglobinα2MG)来源：肝细胞和单核吞噬细胞系统合成。理化性质：MW62.5-80万,含糖8%，血浆蛋白中分子量最大,由4个亚基单位组成。功能：可与多种分子与离子结合，与许多蛋白水解酶结合而影响酶活性，是血浆中主要的蛋白酶抑制剂。临床意义：在低白蛋白血症、妊娠期及口服避孕药等情况下可见升高。(八)铜蓝蛋白(ceruloplasminCER)理化性质：主要由肝细胞合成，分子量12-16万，含铜而呈蓝色，属α2球蛋白。功能：1具氧化酶活性，催化多酸及多胺类底物氧化。2铜代谢库，血液中CER可视为铜的无毒代谢库。3抗氧化剂作用，减少组织中脂质过氧化物及自由基的生成。4APR。临床意义：在感染、创伤、肿瘤时升高；Wilson病（肝豆状核变性，主要因体内铜代谢障碍所致）时血浆CER明显下降；严重肝、肾疾病及妊娠期时下降。(九)转铁蛋白(transferrinTRF)来源：肝细胞及MPS合成。理化性质：Mw7.7万，单链糖蛋白，半寿期7天。功能：血浆中主要含铁蛋白，负责以TRF-Fe３＋形式运载消化道吸收及红细胞降解的铁至骨髓再利用合成血红蛋白。临床意义：1.用于贫血诊断和对治疗的监测。IDA时TRF升高，但铁饱和度下降；铁利用障碍性贫血时，TRF正常下降，但铁饱和度升高。2.急性时相反应时下降。3.妊娠或服用雌激素时升高。(十)β2--微球蛋白(β2-microglobwlinBMG)来源：由ＬＣ细胞合成，存在于所有有核细胞表面，尤其淋巴/肿瘤细胞，并释放入血。理化性质：Mw11800，半寿期107min，人类白细胞抗原的轻链部分，分子内含一对二硫链。因其分子量小，可自由透过肾小球滤过膜，但在肾小管近曲约99％被重吸收。临床意义：在肾功衰竭、炎症及肿瘤时血浆浓度上升，主要用于监测肾小管功能，也是一种恶性肿瘤标志物。(十一)C--反应蛋白(C-reactiveproteinCRP)来源：肝细胞。理化性质MW11.5-14万，5个多肽链亚单位非共价结合为盘形多聚体，电泳位于慢Υ带，有时可延伸至β区带。功能：可以和肺炎链球菌Ｃ－多糖结合，结合多种细菌，真菌等体内多糖物质及卵磷脂、核酸等，激活补体系统，是第一个被认定的APR.临床意义：作为急性时相反应的一个极灵敏指标。急性时相反应蛋白分类：升高：其他６种蛋白质。降低：前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白产生机制 临床意义：机体处于炎症，损伤状态时，以上血浆APR出现一系列特征变化，与炎症创伤的时间进程具有相关性，可用以鉴别急，亚急性及慢性病理状态与病理损伤性质范围。浆细胞瘤风湿病TP100%Alb41.6(↓)α15.6(N)α212.0(↑)β13.0(N)γ27.8(↑)（IgA、IgG、IgM↑↑，特征性变化）第二节体液蛋白质检测蛋白质的测定一般基于以下四种蛋白质的性质：重复的肽链结构酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂紫外光吸收与色素的结合能力沉淀后借助浊度或光折射测定一血清总蛋白质测定1凯氏定氧法—参考 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 方法结果较准确，是蛋白质测定的参考方法，但操作复杂，影响因素较多，不适用于日常工作，多用于标准蛋白的标定及校正其它的常规方法。1.凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mgN0.3gpro)消化　用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）蒸馏　用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；吸收　用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+]）滴定　用已标定的无机酸滴（使[H+]恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比。原理：2双缩脲比色法—血浆总蛋白测定推荐方法蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色化合物，产生的颜色在一定范围内与蛋白质含量成正比。此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）与碱性铜溶液作用形成紫红色化合物的反应相似，故称为双缩脲反应。此方法简便、准确、重复性好，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。2.双缩脲法原理：蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。双缩脲生成加热＋NH322H－180022222N端C端3.酚试剂法原理：蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。4.紫外分光光度法蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260（2）Warburg-Christian公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260原理：评价及应用：优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。5.染料结合法在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。原理：常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等评价及应用：优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。6.比浊法原理：评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。参考范围：成人60－80g/L临床意义：总蛋白升高：总蛋白降低：①丢失过多②消耗增加③白蛋白合成减少④水肿真性升高：MM、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高，A/G几乎不变7.折光测定法溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。原理：评价及应用：优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和胸腹水蛋白质测定。缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响，会由于A/G比值变化而产生误差。[临床意义]1升高：MM、巨球蛋白血症、冷沉淀球蛋白血症；另外，当由于机体失水引起的血液浓缩而导致的升高时，总蛋白含量相对增高，但白球比变化不大，称假阳性蛋白增多症。2降低：多反映合成减少或蛋白质丢失，如肾病综合征、胃肠道疾病、严重烧伤等；长期营养不良及消耗增加；各种慢性疾病时蛋白质合成减少；各种原因引起的体内水分过多等。二、血清白蛋白测定方法：1.染料结合法(推荐)　2.盐析法3.电泳法　　　　　　　4.免疫化学法1.染料结合法(推荐)原理:血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。染料BCGBCP优点缺点易于和非人源性白蛋白结合与白蛋白结合特异性较差与非人源性白蛋白结合力弱与白蛋白结合特异性好在30秒内测可提高特异性应用及评价:严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动化分析。临床上推荐使用。原理:盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。2.盐析法中性盐：硫酸铵、硫酸钠等应及评价:操作繁琐，不宜自动化，基本不用3.电泳法操作：醋纤膜电泳染色晾干透明光密度仪扫描洗脱比色染色分离测得蛋白组分百分比计算得出各种蛋白质含量半定量定量评价及应用：优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌．缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料亲和力高会导致结果偏高4.免疫化学法原理及特点:应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多.参考范围:成人35－55g/L.临床意义：白蛋白升高：白蛋白降低：①丢失过多②消耗增加③白蛋白合成减少④水肿⑤先天性ALB缺乏病真性升高：未见假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白三、血清球蛋白测定方法：间接法:TP-ALB=GLB直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量)色氨酸+乙醛酸紫色化合物H+Hopkins-Cole反应:参考范围:成人20－30g/L.A/G：1.5－2.5临床意义：球蛋白升高：球蛋白降低：合成减少、低或无γ-球蛋白血症真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反应、MM、巨球蛋白血症。假性升高（少见）：机体明显失水。四、血浆纤维蛋白原测定血浆纤维蛋白原：结构特点：凝血因子Ⅰ，肝合成，MW=3.4万，大分子糖蛋白，pI5.3，α2β2γ2功能特点：参与凝血血凝过程中的作用：纤维蛋白原纤维蛋白网血凝块纤维蛋白细丝血液凝块构造（红色为红血球，兰色为血小板，黄色为纤维蛋白）测定方法及特点：1.纤维蛋白原凝块测定法：凝血酶或钙离子原理：纤维蛋白原不溶的纤维蛋白凝块含有NaCl的双缩脲试剂反应分离2.比浊法：MW纤维蛋白原＞MW球蛋白方法一：pH7.0时，用13.3%的硫酸胺沉淀纤维蛋白原，产生浊度方法二：热比浊法，缓冲盐水稀释后置56℃15min，沉淀纤维蛋白原，450nm下比浊应用：影响因素较多，测定结果不够准确。原理：应用：特异性不高,常使结果偏高.　　　　　　　　3.盐析法：12.5%的亚硫酸钠溶液沉淀纤维蛋白原，分离洗涤加双缩脲显色。4.免疫化学法：免疫电泳、扩散、ELISA应用：较准确,但操作繁杂,费时,影响因素多.应用：特异性不高,常使结果偏高.临床意义：急性时相反应蛋白，出血性疾病的诊断参考范围:2.0－4.0g/L降低：营养不良、严重肝功损伤、ＤＩＣ、胎盘早期剥离，先天性缺乏等。升高：感染、组织损伤、休克、外科手术后、肾炎、风湿病、恶性肿瘤；放射治疗等五、尿总蛋白测定来源：２／３来自血浆蛋白，主要是ＡＬＢ１／３来自肾脏与尿路的组织蛋白。临床应用：正常儿童＜40mg／24h，成30mg－130mg/24h；　　　　　　异常：蛋白尿。检测：用于泌尿系统疾病及一些全身性疾病的筛查、疗效观察，详见肾脏功能检验。六、尿微量蛋白质测定对象：常 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 量定性难以检出的一些尿蛋白。μg或mg水平ALB、α１－m、β2－m、ＲＢＰ、ＴＲＦ、Ｂ－ＪＰ、α２－ＭＧ七、脑脊液蛋白质测定脑脊液蛋白质来源:外源:经脉络膜的毛细血管壁超滤生成的低分子量蛋白质,占血清蛋白质1%以下内源:由中枢神经系统合成,脑脊液特有的蛋白质.检测方法:1、浊度法：蛋白质+磺基水杨酸-硫酸钠沉淀比浊（受温度等影响）H+2、染料结合法：正电负电考马斯亮蓝G-250：标本用量少、灵敏度高、显色稳定、重复性好，但线性较差，易吸附与比色杯上干扰测定，不适合自动化分析。。邻苯三酚红钼：具有以上优点并克服其缺点，适合上机。3、电泳法：脑脊液浓缩后电泳。参考范围：150mg~450mg/L临床意义：多数神经系统疾病可使脑脊液总蛋白升高。