革兰染色细菌特殊结构观察细菌接种技术新乡医学院微生物学教研室：3029130科教科：3029945主讲人：陈萍E-mail:chenping@xxmu.edu.cn 目的通过介绍实验室生物安全方面的相关知识，树立“有菌的意识，无菌操作的观念”。掌握革兰染色
方法
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和细菌接种方法。描述5个视野（细菌基本形态和特殊结构）。一、实验室生物安全 生物危害源 化学危害源 物理危害源后两者的特性：1、可感知，易避免2、危害范围有限3、危害持续时间短医学实验室的主要危害源包括哪些?一、实验室生物安全 惨痛的历史教训例一：1956年，前苏联的一个实验室曾有9支装有感染了委内瑞拉马脑炎病毒的鼠脑的安瓿被打破。由于没采取必要的
措施
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，结果在几天内造成24名工作人员感染。例二：1998年，我国某大城市的某高校在使用大白鼠进行试验时，有两名学生被大白鼠咬伤，还有一些学生在给实验老鼠放血、解剖的过程中，未按照要求操作，结果在29名实验人员中，有9人感染了流行性出血热。例三：2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。一、实验室生物安全 实验室感染的事件曾多次发生，实验室人员曾为此付出了沉重的代价。这些感染的主要原因是：防护意识不强；操作失误，防护条件不足。 1.进实验室必须穿白大衣,不必需的物品不要携带入室。 2.保持实验室的安静和秩序,实验要认真并作好
记录
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。 3.如有传染性材料的污染,及时报告老师。 4.实验过程中有仪器和器材的损坏要报告老师并登记。 5.实验后的材料要放在指定容器内。 6.离开实验室前,要用肥皂洗手；接触过传染性强的实验材料要用0.1%的新洁尔灭浸泡消毒。 7.值日生要作好值日工作,关好水,电,门窗,方可离开实验室。新洁尔灭不能与普通肥皂、碘酊配伍，有过敏体质者慎用。二、革兰染色(Gramstain)临床意义1、鉴别细菌2、有助于研究细菌的致病性3、有助于指导临床用药凡能保留第一种染料结晶紫的蓝紫色的细菌叫G+菌，凡能被酒精脱色之后染上复染液石碳酸复红的红色的细菌叫G-菌。G+G-（一）原理1、菌种白色葡萄球菌和大肠杆菌2、试剂革兰染色液初染液结晶紫媒染液卢戈氏碘液脱色液95%乙醇复染液稀释石碳酸复红3、其它载玻片染色盘接种环酒精灯等（二）器材和试剂冲洗在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果（三）方法与步骤（掌握）1、细菌涂片的制备涂片干燥固定2、染色初染（结晶紫）媒染（卢戈氏碘液）脱色（95%乙醇）复染（稀释石碳酸复红）吸水纸吸干1min1min30s30s冲洗冲洗冲洗图一图二（四）结果 无菌操作（接种环灭菌和取菌） 涂片的厚度要适中 染色的时间控制，一一半半 冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗（五）注意事项三、细菌的特殊结构（示教）（二毛荚一胞）寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大。转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。 物镜 工作距离(mm) 低倍目镜 10× 5.40 高倍目镜 40× 0.39 油镜头 100× 0.11调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。［如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。］清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯（或乙醚）擦去残余的香柏油，最后再用干擦镜纸擦干净。 透镜 折光率 油1.5151.0空气 玻1.52璃 空气 油镜原理示意图四、细菌的接种方法（掌握） 普通固体琼脂培养基接种法1.平板分区划线接种法：分离培养细菌（得单个菌落），得细菌的纯培养物为进一步鉴定细菌提供条件。2.斜面固体培养基接种法：用于纯菌的移种，可短时间保存菌种。 半固体琼脂培养基穿刺接种法保存菌种或观察细菌的动力和生化反应 液体培养基接种法用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种1.平板分区划线接种-得单个菌落2.斜面接种法3.半固体培养基穿刺接种法保存菌种或观察细菌的动力和生化反应4.液体培养基接种法用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种5、细菌生长现象的观察 固体培养基-菌落观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度；在血平板上还要观察溶血情况和色素等。液体培养基-生长混浊生长（大多数细菌）沉淀生长（链球菌）膜样生长（专性需氧菌，如结核分枝杆菌、枯草杆菌）三.细菌在液体培养基中的生长情况半固体培养基-鞭毛观察细菌的运动实验报告一、目的二、原理三、材料四、方法五、结果（2+3幅图）六、意义七、注意事项结果（2+3幅图）1、绘制所涂片染色的G+及G-菌的形态图并注明放大倍数（红蓝铅笔）2、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注明放大倍数（铅笔）预习 消毒灭菌 内毒素检测 肠道致病菌分离培养新洁尔灭不能与普通肥皂、碘酊配伍，有过敏体质者慎用。
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