DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能

HEREDITAS (Beijing) 2009年 11月, 31(11): 1087―1093 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 综 述 收稿日期: 2009−04−18; 修回日期: 2009−08−03 基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30425017, 30670417)和国家科技部基金项目(编号：2005CB522403, 2006AA02Z101) 作者简介: 苏玉(1987−), 女, 在读硕士研究生, 研究方向：表观遗传学。Tel: 010-82802167; E-mail: suyu0000@gmail.com 通讯作者: 朱卫国(1962−), 男, 博士, 教授, 研究方向：表观遗传学。Tel: 010-82802235; E-mail: zhuweiguo@bjmu.edu.cn DOI: 10.3724/SP.J.1005.2009.01087 DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能 苏玉, 王溪, 朱卫国 北京大学基础医学院, 北京 100191 摘要: DNA 甲基化是表观遗传学的重要部分, 同组蛋白修饰相互作用, 通过改变染色质结构, 调控基因表达。 在哺乳类细胞或人体细胞中, DNA 甲基化与细胞的增殖、衰老、癌变等生命现象有着重大关系。对催化 DNA 甲基化的 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)的研究可以揭示 DNA 甲基化对基因表达调控的机制, 从而研究与之相关的重要生命活动。文章以 DNA 甲基转移酶作为切入点, 探讨 DNA 甲基转移酶在基因表达调 控中发挥的作用及其主要生物学功能。 关键词: DNA 甲基转移酶; DNA 甲基化; 表观遗传学 DNA methyltransferases: the role in regulation of gene expression and biological processes SU Yu, WANG Xi, ZHU Wei-Guo School of Basic Medical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China Abstract: Both hitone modification and DNA methylation remodulate chromatin structure and control gene expression or silence. As a main enzyme for DNA methylation, DNA methyltransferase (Dnmt) is not only associated with DNA methyla- tion, but also links to many important biological activities, including cell proliferation, senescence and cancer development. This review focuses on structure, regulation and function in biological processes of Dnmt. Keywords: DNA methyltransferase; DNA methylation; epigenetics DNA 的甲基化修饰是真核细胞基因表达调控 的特点之一。在哺乳动物的某些基因中, 5′侧翼区为 CpG的高频区, 称为 CpG岛。DNA甲基化多发生在 这些 CpG岛的胞嘧啶第五位碳(C5)上。首先甲基转 移酶与 DNA 结合, 将目标核苷酸反转暴露于 DNA 双螺旋之外, 之后半胱氨酸的亲和基团与胞嘧啶第 六位碳(C6)共价结合, 从 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenos- ylmethionine, Adomet)处转甲基至胞嘧啶 C5 上[1]。 通过这种甲基化机制和组蛋白修饰、染色质重组等 共同作用, 细胞可以不改变 DNA的碱基序列, 而调 控不同基因在不同细胞和组织中的表达。 DNA 的甲基化是通过 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)催化和维持的。一般认为 , 哺乳动物的 Dnmt有 4种, 分为两个家族: Dnmt1和 Dnmt3(另有一种 Dnmt2, 主要为 tRNA 的甲基转移 酶, 也有报导称Dnmt2具有微弱的DNA甲基转移酶 活性[2])(图 1)。 Dnmt1家族在 DNA复制和修复中维 持其甲基化; 而 Dnmt3家族则催化 CpG从头甲基化 (de novo methylation)。Dnmt3包括了两个从头甲基 转移酶 Dnmt3a、Dnmt3b和一个调节蛋白 Dnmt3L[1]。 1088 HEREDITAS (Beijing) 2009 第 31卷 图 1 Dnmt 的家族成员及其结构 Dnmt1的结构域为: N端与某些蛋白特异结合区, C端的酶活性区和及其他未知区域; Dnmt2主要为 tRNA甲基转移酶; Dnmt3a和 Dnmt3b的结 构域为: N端的可变区, PWWP结构域, 半胱氨酸富集区, C端的酶活性区; Dnmt3L有半胱氨酸富集区, 但 C端不具单独的催化活性[1]。罗马数 字表示酶结构中的一些保守序列。 Dnmt1是 1988年 Bestor等[3]从真核生物克隆出 来的第一个 DNA 甲基转移酶, 是一种胞嘧啶 C5 特 异的甲基转移酶。Dnmt1分子量为 183 kDa, 一般认 为 Dnmt1有 3个结构域: C端的催化域, N端的某些 蛋白识别的靶区域, 以及其他未知区域[4]。最近有研 究表明 Dnmt1 的半胱氨酸富集区可与未甲基化的 CpG岛结合, 这说明除了催化区域以外, Dnmt1的其 他结构域也与酶活性有重要关系[5]。Dnmt1 的结构 可能还会通过与氨基酸相互作用和(或)催化域的丝 氨酸磷酸化而发生变化[6, 7], 这可能与酶的活性、与 DNA结合等的调节有关。Dnmt1的主要作用是维持 DNA 甲基化, 这种维持作用可以将 DNA 甲基化信 息传递给子代细胞。 Dnmt3a 和 Dnmt3b 的结构域基本相同, 都在 N 端存在一可变区, 可变区之后至 C端依次为: PWWP (Proline tryptophan tryptophan proline)结构域, 其可 能与DNA非特异性结合有关; 半胱氨酸富集的锌结 合区域; C端的催化活性区域。 Dnmt3L 是一种 Dnmt3 类似蛋白, 具有半胱氨 酸富集的锌结合区域, 缺少 C 端的酶催化活性域, 所以没有单独的催化活性。它是 DNA从头甲基化的 调节因子, 通过与 Dnmt3a 和 Dnmt3b 的 C 端结合, 可提高它们的催化活性, 正向调节 DNA 从头甲基 化[8]。 1 DNA甲基转移酶的基因表达调控 一般认为 DNA 甲基化通过两种途径抑制基因 表达。第一种是直接阻碍转录因子与甲基化的 CpG 岛结合 , 直接抑制基因表达 [9]; 另一种是通过招募 DNA 甲基结合蛋白 (Methyl-CpG-binding proteins, MBP)及一些阻碍复合物 , 阻止转录因子与特定 DNA 序列结合, 间接抑制基因表达[10]。本实验室发 现 p21 启动子上的转录因子 Sp1 结合位点的甲基化 并不阻碍 Sp1 结合到其启动子上[11], 说明第一种途 径的抑制作用并不表现在所有基因中。而在第二种 途径中 , Dnmt 和 MBP 可与组蛋白去乙酰化酶 (Histone deacetylase, HDAC)、共抑制子(co-repressor) 和 ATP依赖的染色质重塑蛋白等结合形成抑制复合 物, 与组蛋白去乙酰化和染色体重塑共同作用, 从 而抑制基因表达[12~14]。 Dnmt 与组蛋白修饰相关因子的相互作用是 Dnmt 调控基因表达的重要手段。Dnmt1 的 N 末端 第 11期 苏玉等: DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能 1089 可以与 HDAC1、HDAC2 结合, Dnmt3a 和 Dnmt3b 也可以招募 HDAC, 从而使组蛋白去乙酰化 [15]。 Dnmt除了可以与HDAC相互作用外, 还与组蛋白的 甲基化有关。DNMT1 的 N 端可以招募组蛋白甲基化 酶 Suv39h1(Suppressor of variegation 3-9 homolog 1)和 识别 HP1 (Heterochromatin protein 1)[14]。Dnmt3a也 可与 HP1相互作用, 而 HP1具有识别甲基化的组蛋 白、稳定异染色质浓缩结构的作用[16]。研究人员还 发现 DNMT3A 可以直接识别对称甲基化的组蛋白 H4R3me2s (Symmetric methylation of histone H4 arginine 3)[17]。这说明 Dnmt的基因表达抑制作用与 组蛋白修饰和染色质重塑相关。这种机制的意义可 能是: 由于组蛋白的变构在细胞增殖过程中不能直 接传递, 所以通过 Dnmt 对新复制得到的子代 DNA 甲基化型的保留, 得到基因是否转录的信息, 从而 使子代细胞中组蛋白正确地乙酰化或去乙酰化。 DNMT1的 N端可以识别MBP家族中的MBD1 (Methyl-CpG binding domain 1)、MBD3、MeCP2 (Methyl-CpG binding protein 2)[14]。一项研究显示, 大鼠肝细胞瘤中的 Dnmt1、Dnmt3a和 Dnmt3b数量 是正常肝细胞的 4~10 倍, MeCP2 是正常的 8 倍, MeCP2与MT-1启动子相互作用, 抑制MT-1(一种抗 氧化剂)的表达, 说明 MeCP2 和 Dnmt 都与肿瘤中 MT-1基因表达抑制有关[18]。在 Xist基因沉默的相关 研究中, 另一种甲基结合蛋白 Mbd2 与 Dnmt1 和 HDAC 抑制物有相互作用, 是导致 Xist 基因沉默的 中介[19]。Dnmt通过招募这些蛋白, 与组蛋白修饰和 染色体重塑共同作用, 间接抑制基因表达。 Dnmt 间接的基因沉默作用还表现在与一些共 抑制子的相互作用上。如 Dnmt3a可以与一种转录抑 制蛋白 RP58 结合 , 二者共同抑制基因表达 [20]。 DNMT3B 在 HeLa 细胞中可以与共抑制子 SIN3A (Kinetochore associated protein)相互作用, 同时也可 与 KIF4A(Kinesin family member 4A)和 condensin相 互作用参与染色质浓缩 [21]。这些研究结果表明 , Dnmt 与相关蛋白的相互作用不仅是间接抑制基因 表达的途径, 也是 Dnmt参与组蛋白修饰、染色体变 构的途径。 最近的一些研究还揭示了 Dnmt 与另一组基因 沉默相关因子 PcG(Polycomb group)的相互作用。PcG 蛋白组成的多聚复合物 PRC(Polycomb repressive complexes)2 和 3 中的 EZH2(Enhancer of zeste ho- molog 2)可以和 Dn mt 相互作用 , 共同抑制基 因表达, 并且 EZH2 是其靶基因启动子甲基化所必 需的[22]。PRC1 活化相关的 NSPc1(Nervous system polycomb 1)蛋白, 与 DNMT1、EZH2 共同结合在 HeLa 细胞中的 HOXA7启动子上, 当 NSPc1 缺失时 DNMT1与HOXA7启动子的结合下降, 同时DNMT1 缺少时 NSPc1的结合水平也下降[23]。这些研究结果 说明 Dnmt 参与的 DNA 甲基化的基因沉默机制和 PcG参与的基因沉默机制也存在交互作用。 一些因子可以作用于Dnmt, 导致酶的数量或活 性发生改变, 从而影响 DNA甲基化水平, 影响基因 表达。HDAC抑制剂 apicidin在 HeLa细胞系中可以 下调 DNMT1 水平, 而 DNMT1 的缺少会导致肿瘤 细胞死亡[24]。SNF2(Sucrose non fermenting protein 2) 家族相关的 ATP 依赖染色质重塑蛋白 hSNF2H (Human sucrose non fermenting protein 2 homologue) 可以与 DNMT1 的 N 端结合, 当 hSNF2H 存在时, DNMT1 对单核苷酸的亲和力升高[25]。研究发现另 一种 SNF2 家族相关的 ATP 依赖染色质重塑蛋白 LSH(Lymphoid-specific helicase)并不直接导致 DNA 甲基化, 而是通过增加 Dnmt 的数量间接引起甲基 化 [26]。最近的一项研究中 , 小鼠 LSD1 (Lysine- specific demethylase 1, 又称为 KDM1和 AOF2)的编 码基因 Aof 2被敲除后DNA甲基化水平下降, Dnmt1 水平下降 [27]。组蛋白甲基化酶 SET7 也可调控的 DNMT1 的稳定性。SET7 通过直接与 DNMT1 相互 作用, 并特异地甲基化 DNMT1 的第 142 位赖氨酸, 实现其对 Dnmt1 数量和活性的抑制作用[28]。可见, 这些因子可以通过调控 Dnmt 数量和活性间接参与 基因沉默, 同时 Dnmt 也通过这些因子参与其他水 平的基因表达调控作用。 除了改变 Dnmt的数量或活性, 调控 Dnmt与基 因启动子的结合也是调控 DNA甲基化水平的方式。 本实验室研究发现 HDAC 抑制剂 depsipeptide 在肺 癌细胞系 H719 和 H23、大肠癌细胞系 HT-29 和胰 腺癌细胞系 PANC1 中对 p16、SALL3、GATA4 基因 有激活基因沉默的作用。Depsipeptide 通过降低 H3K9的甲基化, 减少 DNMT1与上述基因启动子的 结合, 最终导致基因沉默[29]。这些结果进一步说明 Dnmt 对基因沉默的影响是与组蛋白结构变化相关 1090 HEREDITAS (Beijing) 2009 第 31卷 的, 二者间存在密切的交互作用。 总之, Dnmt的基因表达调控机制是复杂的、多 水平的。Dnmt 参与了 DNA 甲基化、组蛋白修饰和 染色体重塑, 组成了复杂的表观遗传调控网络, 共 同调控基因表达。 2 DNA甲基转移酶的主要生物学功能 介于上述 Dnmt 的表达调控机制, Dnmt 在多种 生命现象中发挥了重要作用。下面就 Dnmt 的重要 生物学功能进行探讨。 2.1 DNA甲基转移酶与肿瘤 在肿瘤细胞中, 抑癌基因的不正常甲基化抑制 了其表达, 使细胞周期失控, 发生癌变。很多研究都 证明了 DNA甲基化异常与肿瘤发生有关。研究者们 在乳腺癌、大肠癌、胃癌中发现了某些基因的高甲 基化[30~32]。很多癌变组织中 Dnmt 的表达也是增加 的[33, 34]。Dnmt的增加往往发生在 DNA甲基化之前, 可能是引起 DNA甲基化异常的原因。 Dnmt 的两个家族成员在以上机制中的作用是 协同存在的。例如: 下调 DNMT3B在直肠癌细胞中 的表达只能使整体甲基化水平下降 3%, 下调两者却 可使甲基化水平下降 95%[35]。研究发现缺乏 DNMT1 表达的肿瘤细胞仍伴有明显的基因组甲基化和相关 基因沉默[35]。这说明 Dnmt 家族之间在调控肿瘤发 生过程中不仅仅是互补关系, 而可能是相互协同甚 至相互促进的关系。 根据以上结论和推断, 研究人员提出了以 Dnmt 为靶点治疗肿瘤的新思路。5-氮杂 -2′-脱氧胞苷 (5-aza-2′-deoxycitydine, 5-Aza-CdR, Decitabine)作为 一种 Dnmt 抑制剂 , 被证明有抑制肿瘤细胞的作 用[36, 37]。它可以和结合在基因启动子上的 Dnmt 结 合, 抑制其对启动子的甲基化[38, 39]。5-Aza-CdR 在 患有白血病、骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome, MDS)、非小细胞性肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)的病人中进行了 1期、2期临床 试验, 显示了一定的抗肿瘤作用[40]。但 5-Aza-CdR 存在的一些问题限制了其临床应用, 如其体内半衰 期短、易被胞嘧啶核苷脱氨酶失活、会引起粒细胞 减少的毒副作用等[41, 42]。这些问题也使其实体瘤的 治疗效果受到限制。本实验室研究发现 5-Aza-CdR 可以通过增加 p21 的表达抑制细胞增殖, 而这条通 路是 p53依赖的[36]。这项研究对 5-Aza-CdR的临床 应用具有参考价值, 因为很多实体瘤细胞中 p53 广 泛突变 , 而像白血病等癌症中 p53 突变少 , 5-Aza-CdR更能发挥其抗肿瘤作用。 2.2 DNA甲基转移酶与发育 DNA 甲基转移酶在胚胎发育中起到了关键作 用。Dnmt3a、Dnmt3b在 ES细胞中表达丰度较高, 成 体组织中很低, ES细胞中的 Dnmt3a和 Dnmt3b失活 会干扰 DNA 从头甲基化, Dnmt3b、Dnmt3a 基因突 变的小鼠胚胎畸形和死亡率极高[43]。在胚胎发育的 早期, Dnmt3a 和 Dnmt3b 功能重叠。Dnmt1 的甲基 化作用发生在植入期, 并在胚胎发育过程中起到了 维持甲基化的作用[43]。这说明, 无论是 DNA从头甲 基化还是 DNA 甲基化的维持都是胚胎发育的重要 环节 , 可能与不同组织细胞中不同基因的表达有 关。另外, DNA 甲基转移酶与胚胎早期植入子宫内 膜也有一定联系。有研究显示 DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B可以联合作用, 调节 E钙粘素(E-cadherin) 的表达, 从而调节子宫内膜对胚胎的接受能力[44]。 这也说明 Dnmt 在胚胎发育中起到的重要作用, 异 常的胚胎植入和流产很有可能与 Dnmt的异常有关。 在神经系统的发育中, 记忆的形成与DNA甲基 化的动态变化有关。一项针对大鼠海马区域的记忆 形成的研究显示, 与记忆形成相关的基因的甲基化 水平在条件反射形成前后发生变化, Dnmt的 mRNA 水平也有所改变。当使用 Dnmt抑制剂后, 已经甲基 化的基因去甲基化 , 条件反射过程会减弱或消 失[45]。这说明与记忆形成有关的 DNA 甲基化并非 长期的、稳定的, 而是动态变化的, 记忆形成与表观 遗传学现象有密切关系。 2.3 DNA甲基转移酶与细胞衰老 DNA 的甲基化是 DNA 亚序列水平的一种遗传 信息 , 可以传递给子代细胞。这种传递主要通过 Dnmt1维持。然而衰老的细胞会出现“DNA甲基化 漂移”。研究者们发现在很多衰老的组织和细胞中广 泛存在 DNA 甲基化程度降低的现象[46]。这种 DNA 甲基化漂移会导致 DNA低甲基化或过甲基化。产生 这两种现象的内源性机理与 DNA 甲基转移酶的不 第 11期 苏玉等: DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能 1091 正常表达有关[47]。在检测不同年龄人群的 T淋巴细 胞表达 DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B水平后, 研 究人员发现 DNMT3A 在 T 淋巴细胞中表达比较低, 且不随年龄变化而变化; 而 DNMT1和 DNMT3B表 达很多, 且随年龄升高而表达下降, 这说明 DNA甲 基转移酶水平下降是组织中甲基化程度下降的原因 之一[48]。本实验室也发现, 正常人成纤维细胞 2BS, p21启动子的甲基化随年龄变化而波动, 而 p21是细 胞周期相关的重要因子[49]。甲基化漂移会导致基因 的沉默或过表达, 使衰老的组织发生基因表达不正 常, 细胞周期调控机制失调。但是引起 DNA甲基转 移酶水平下降的原因尚未明确。究竟是甲基化漂移 引起衰老 , 还是衰老引起甲基化漂移 , 目前还不 清楚。 2.4 DNA甲基转移酶与其他疾病 DNA甲基转移酶的突变会导致一些遗传性疾病。 如 “着丝点不稳定和面部异常”(Immunodeficiency centromeric instability and facial anomalies), 即 ICF 综合征, 是由于 DNMT3B 基因突变引起的。它是一 种常染色体隐性遗传病, 主要表现为免疫缺陷和面 部异常[50]。最近有报导显示, 高同型半胱氨酸血症 (Hypohomocysteine, HHcy)与 DNMT1活性降低引起 的 DNA低甲基化有关, 而 HHcy是动脉粥样硬化和 冠心病的独立危险因素[51]。另外, 与 DNA甲基化异 常有关的疾病还有 Rett综合征, 是MeCP2变异导致 的[52]。 总而言之, DNA甲基转移酶对于调控DNA甲基 化, 从而调节染色质结构和基因的表达起着重要作 用。它们之间既是分工合作, 又可以相互协同和促 进。这种调节在衰老、肿瘤、胚胎发育和其他疾病 中都有所体现。对于 DNA甲基转移酶和 DNA甲基 化机制的研究还有很多未知内容, 但其重要生物和 生理意义已经愈发凸现。完善 Dnmt 的研究对重大 疾病的控制和治疗可能会起到重要作用。 参考文献(References): [1] Cheng X, Blumenthal RM. 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