分子生物学技术在食品微生物检测中的应用1

分子生物学技术在食品微生物检测中的应用核酸的发现 1869年，F.Miescher从脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，因存在于细胞核中而将它命名为“核质”(nuclein）。但核酸(nucleicacids）这一名词在Miescher发现“核质”20年后才被正式启用，当时已能提取不含蛋白质的核酸制品。早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能这样的重要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 DNA遗传物质 1944年，Avery等为了寻找导致细菌转化的原因，他们发现从S型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化为S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不发生。结论是：S型菌的DNA将其遗传特性传给了R型菌，DNA就是遗传物质。从此核酸是遗传物质的重要地位才被确立，人们把对遗传物质的注意力从蛋白质移到了核酸上。DNA双螺旋 1952年，奥地利裔美国生物化学家查伽夫（E.chargaff，1905—）测定了DNA中4种碱基的含量，发现其中腺嘌呤与胸腺嘧啶的数量相等，鸟嘌呤与胞嘧啶的数量相等。这使沃森、克里克立即想到4种碱基之间存在着两两对应的关系，形成了腺嘌呤与胸腺嘧啶配对、鸟嘌呤与胞嘧啶配对的概念。 1953年2月，沃森、克里克通过维尔金斯看到了富兰克琳在1951年11月拍摄的一张十分漂亮的DNA晶体X射线衍射照片，这一下激发了他们的灵感。他们不仅确认了DNA一定是螺旋结构，而且分析得出了螺旋参数。他们采用了富兰克琳和威尔金斯的判断，并加以补充：磷酸根在螺旋的外侧构成两条多核苷酸链的骨架，方向相反；碱基在螺旋内侧，两两对应。一连几天，沃森、克里克在他们的办公室里兴高采烈地用铁皮和铁丝搭建着模型。1953年2月28日，第一个DNA双螺旋结构的分子模型终于诞生了。双螺旋模型的意义 探明了DNA分子的结构 更重要的是它还提示了DNA的复制机制：由于腺膘呤(A)总是与胸腺嘧啶(T)配对、鸟膘呤(G)总是与胞嘧啶(C)配对，这说明两条链的碱基顺序是彼此互补的，只要确定了其中一条链的碱基顺序，另一条链的碱基顺序也就确定了。 DNA复制主要包括引发、延伸、终止三个阶段。DNA的生物合成DNA复制的过程 DNA双螺旋的解旋 冈崎片段与半不连续复制：因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5’—〉3’方向，另一条是3’—〉5’方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—〉3’方向，不是3’—〉5’方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。 为解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象，日本学者冈崎等人提出了DNA的半连续复制模型。 DNA复制所需的蛋白质和酶： 酶和蛋白质 作用 拓扑异构酶 帮助解开复制叉前后的超螺旋结构 DNA解旋酶 揭开螺旋 Rep蛋白 帮助揭开双螺旋结构 引物合成酶 合成RNA引物 单链结合蛋白 稳定单连区 DNA聚合酶Ⅰ 消除引物，填满裂缝 DNA聚合酶Ⅲ 合成DNA DNA连接酶 连接DNA末端 DNA复制是指DNA双链在细胞分裂以前的分裂间期进行的复制过程，复制的结果是一条双链变成两条一样的双链（如果复制过程正常的话），每条双链都与原来的双链一样。这个过程通过边解旋边复制和半保留复制机制得以顺利完成。DNA复制的特点1．半保留复制：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制。2．有一定的复制起始点：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。3．需要引物（primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3'端自由羟基（3'-OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。DNA复制的特点4．双向复制：DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制。5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的，这一条链被称为领头链（leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的，这条链被称为随从链（laggingstrand)。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段（Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。RNA的生物合成 转录（Transcription）是遗传信息从DNA到RNA的转移。即以双链DNA中的一条链为模板，以腺三转录磷（ATP）、胞三磷（CTP）、鸟三磷（GTP）和尿三磷（UTP）4种核苷三磷酸为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。 在转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端；RNA链的合成方向是从5′端向3′端。RNA的合成一般分两步，第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）；第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转变成有生物功能的成熟RNA。 双链DNA只有一条链是模板，称为模板链，又称为反意义链或负链（-）；另一则称为编码链，又称有意义链或正链（+）。由于转录仅以DNA的某一个区段为模板，因而称为不对称转录。 转录作用可分成三个阶段：起始、延伸和终止。蛋白质的生物合成 蛋白质生物合成亦称为翻译，即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。 不同mRNA序列的分子大小和碱基排列顺序各不相同，但都具有5ˊ-端非翻译区、开放阅读框架区、和3ˊ-端非翻译区；真核生物的mRNA的5ˊ-端还有帽子结构、3ˊ-端有长度不一的多聚腺苷酸(ployA)尾。 在mRNA的开放式阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 一种氨基酸或其他信息，这种三联体形势称为密码子（codon）。 核糖体就像一个小的可移动的工厂，沿着mRNA这一模板，不断向前迅速合成肽链。转录翻译1、PCR技术 PCR(PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链式反应,也称无细胞克隆系统,是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术,该技术自问世以来,就以惊人的速度广泛地应用于生命科学的众多领域。目前在食品工程领域中致病性微生物、转基因食品的检测等方面的应用也越来越受关注。1.1PCR技术的基本原理与方法 PCR技术是一种利用DNA变性与复性原理,在体外利用DNA聚合酶活性,在引物的引导和脱氧核糖核苷酸(dNTP)等参与下将模板DNA在数小时内进行百万倍扩增。 该技术利用两段寡核苷酸作为反应的引物,以及四种脱氧核苷三磷酸dNTP、DNA聚合酶作为反应物,将提取到的DNA(称为模板DNA)片段精确扩增。 该酶促反应最基本的3个环节是:①模板DNA的变性,即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA;②引物与模板链的特异性复性;③由TaqDNA聚合酶催化引物引导DNA链由5'向3'延伸,从而完成一个变性-复性-延伸的PCR循环。至此完成了PCR的第一轮反应,而后反复进行变性、复性和延伸的循环,从而使扩增DNA产量呈指数上升。1.2PCR技术在食品微生物检测方面的应用1.2.1单核细胞增多性李斯特氏菌 过去对食品中LM进行检测时,克隆培养的标准方法需要3～4周的时间才能得出结果 血清学检测方法(如ELISA等)也存在着特异性、敏感性差等问题 PCR运用实时荧光PCR(Real-timePCR)技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法,设计的引物和探针的序列特异性强,省去凝胶电泳的繁琐,降低了污染的可能性。对26种病原菌进行的检测结果表明,用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌,更快速、敏感、特异性更高。1.2.2金黄色葡萄球菌1.2.3沙门氏菌1.2.4肠毒素大肠杆菌1.3常见的基于PCR的食品致病菌检测方法1.3.1常规PCR聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）1.3.2多重PCR（multiplexPCR） 原理与PCR基本相同，只是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。其由于具有高效性、系统性、经济简便性等特点，而在食品检测中得到广泛应用。 Kawasaki等应用多重PCR技术同时检测肉制品中沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌O157：H7，其检测敏感度可以达到40CFU/kg。 Hwang等建立了检测19种金黄色葡萄球菌毒素基因的多重PCR方法，灵敏度为0.2pg，并用该方法检测了143个从韩国鸡肉和猪肉中分离的金黄色葡萄球菌品种，发现有72个品种至少含有一种毒素基因。 多重PCR虽然是一种特异灵敏、简便快捷、高通量的检测技术，但其在应用中也存在一些不足，污染问题就是其中之一。 一旦有极少量外源性DNA污染，就有可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都有可能降低其灵敏度和特异性。 此外，对食品样品进行检测时，增菌培养基选择不当易使有些细菌生长缓慢或被抑制，导致假阴性结果。1.3.3实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（real-timePCR） 实时定量荧光PCR技术一般是通过对探针或引物进行荧光标记，并利用荧光共振能量转移来获得荧光。该方法的出现使极微量的mRNA精确定量成为可能，还可以在同一试管中同时定量多种靶基因。 荧光定量PCR在生命科学各个领域的应用都非常广泛，但仍然存在一些问题，比如采用标准曲线法进行实时定量时，没有统一标准品，实验结果缺乏可比性；其次，进行相对定量时，内源性参比基因有时会受到实验条件的影响，从而影响实验的可靠性；另外，实时定量试剂和染料价格昂贵，若是加上复孔和标准曲线，实验成本就更高，这也限制了它的应用领域。2、基因探针技术 基因探针技术又称核酸分子杂交技术，该技术发明于1968年，由华盛顿卡内基学院的Britten等共同创建。它是分子生物学中DNA分析方法的基础，也是当今分子生物学技术中应用最为广泛的一种。 基因探针是带有标记的基因特异片段。基因探针检测技术主要利用碱基配对原理，使互补的2条核酸单链通过退火形成双链。近年来基因探针技术已被广泛应用于食品微生物的检测中，可灵敏、快速、直接地检测出致病性微生物，不受非致病性微生物的影响。 每一种病原体都有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，利用带有标记物的已知序列的核酸探针，与待测样品进行杂交，如样品中含有特定病原体，探针将与目的核酸序列特异结合，最后使用特定的方法测定标记物，便可确定样品中有无特定病原体。基因探针检测技术不仅具有特异性、灵敏度高的优点，而且兼备组织化学染色的可见性和定位性。核酸探针技术主要用于食品中致病性病原菌的检测。 目前，国内外研究者已开发出多种基因探针用于食品微生物的检测。 Moseley等以生物素标记的沙门菌基因片段作为探针，对食品中的沙门菌进行了检测，效果良好效果。 Kerdahi等使用自动化酶连接的非放射性DNA探针，迅速准确地检测出了单核细胞增生李斯特菌。 陈倩等使用针对ESIEC大肠杆菌HPI毒力岛基因设计的rp－z探针，成功地鉴定出了ESIEC大肠杆菌。 法国梅里埃公司研制的GENE－PROBE系统采用杂交保护分析法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测。 其原理如下：带有标记物的基因探针与金黄色葡萄球菌的rRNA进行杂交，形成有标记的杂种基因，在选择性试剂的作用下游离探针的发光标记物溶解，杂种基因的化学发光标记受到保护，此后加入检测试剂，化学发光分子被氧化或水化发出强光，用发光计量仪可检测光的强度，以确定金黄色葡萄球菌的数量。3、基因芯片 基因芯片技术是鉴别微生物和转基因成分最有效的手段之一,为全面、快速、准确地进行食品安全检测提供了一个崭新的平台。 基因芯片(DNA芯片、DNA微阵列)技术是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术,是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术,他综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术,在生命科学和信息科学之间架起了一道桥梁,是当今世界上高度交叉、高度综合的前沿学科和研究热点。 目前基因芯片正在成为食品和食品原料检测中一种较新的方法,检测食品的营养成分,监督食品的卫生、安全和食品质量,保证人类健康,并且将对整个食品领域产生深刻的影响。3.1基因芯片技术的基本原理与先进性 将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA经PCR扩增后,制备荧光标记探针,然后再与芯片上的寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。 该技术可检测各种介质中的微生物,研究复杂微生物群体的基因表达。与传统的检测方法(细菌培养、生化鉴定、血清分型等)相比,基因芯片技术的先进性主要体现在:①基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测,一次实验即可得出全部结果;②操作简便快速,整个检测只需4h基本可以出结果(而传统方法一般需4d~7d);③特异性强,敏感性高。Microarray3.2探针的制备 是基因芯片研究中最为关键的因素之一，目前常用的探针有寡核苷酸探针、cDNA探针和基因组DNA探针。 寡核苷酸探针是根据待测靶基因特点，设计多条特异性寡核苷酸片段，固定在芯片的特定位置上，与PCR扩增、标记的靶基因相应区段杂交，根据特定位置上杂交信号的有无来判定待测基因是否存在。 cDNA探针是通过PCR扩增cDNA文库中的基因，点样、固定于芯片上，与带有不同荧光的对照样品cDNA片段同时杂交，对比不同标记杂交信号变化，并据此检测样品基因表达水平的变化。 探针设计好后要在其末端连接上10～15bp的po1ydT作为连接分子臂，经5＇端氨基修饰后，分子臂末端被连上氨基，便可与活化玻片表面上的功能基团发生连接反应而固定在玻片表面上。3.3基因芯片试验流程RNA 提取全RNA 检测RNA数量 检测RNA质量 纯化RNA 检测RNA数量 RNA反转录为cDNA cDNA纯化DNA 全基因提取gDNA 检测gDNA数量 检测gDNA质量 消化gDNA 纯化gDNA 检测gDNA数量 cDNA、gDNA荧光染色 检测cDNA、gDNA数量 cDNA与gDNA杂交 检测杂交后数量 芯片清洗、稳定 芯片扫描 数据分析107接种量，750mlBMM，187.5乙醇苯酚80:20混合液（-80oC预冷过夜）30分钟-1小时冰水中静置，9krpm低温离心，沉淀存放于-80oC保存。RNA电泳AgilentBioanalyserRNA6000Nanokit01234567891011RNA电泳TapeStationLab90112131415161718192021222324252627芯片扫描-GenePix读图Microarrayresults沙门氏菌SL1344全基因组图谱（基因组4527，质粒1-104，质粒2-103，质粒3-14）红色为正向调节，蓝色为逆向调节，黄色为未变化。*GeneSpring读图3.4基因芯片技术在食品微生物检测方面的应用 近年来，许多学者利用基因芯片对常见致病菌进行了分析检测。 Jin通过设计通用引物扩增细菌核糖体16S及23SrRNA，并将扩增产物与含有探针的芯片进行杂交，从而在3h内快速鉴定出了致病性肠道微生物。 Chiang等使用通用引物扩增出了细菌核糖体16SrRNA，并将扩增产物与生物素标记的探针进行杂交，结果可在4h内快速检测出大肠杆菌、沙门菌及葡萄球菌，检测准确率高达98％。 Wang等也采用该技术在4h内快速检测出了食物中的致病菌，准确率为97.4％。 Kim等采用比较基因组学技术，针对11种常见的食物源性致病微生物设计出了新型探针芯片，与全基因组芯片相比，可更加快速准确地检测出食品中的微生物。3.5基因芯片技术存在的问题与展望 基因芯片技术的研究和应用前景十分诱人,但作为一项新技术,仍有一些问题需要解决:①该技术需要大量的已测知的、准确的DNA、cDNA片段的信息,他们使该技术成为大规模、集成化和整体获取生物信息的有效手段;②由于芯片制作 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 复杂,信号检测也需专门的仪器设备,一般实验室难以承担其高昂的费用;③样品制备和标记比较复杂,没有一个统一的质量控制标准;④实验室不能共享数据和资料库等。这些都在一定程度上限制了基因芯片技术在食品检测中的应用。 基因芯片技术尽管存在一定的不足和局限,但该技术具有检测系统微型化、检测样品微量化的特点,同时兼具检测效率高、能同时分析多种基因或诊断DNA序列的优势,很适于食品中病原微生物和转基因成分的检测及鉴定。随着研究的不断深入和技术的完善,基因芯片技术一定会在食品科学研究领域发挥越来越重要的作用。4、DNA指纹图谱技术4.1以电泳为主导技术的DNA图谱技术4.1.1变性梯度凝胶电泳标记技术（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE） DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，因解链行为不同，使不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。DGGE技术被广泛应用于分析食品中微生物分离和鉴定及其相关产品的微生物群落种群数量动态变化。 2004年J.Theunissen和T.J.Britz等人对南非益生菌食品进行了抽样检查，他们用DGGE法确认了食品中的微生物 MilicaNikolic等人通过PCR-DGGE的方法成功鉴定了当地自制山羊奶干酪中的乳酸菌。4.1.2温度梯度凝胶电泳(TemperatureGradientGelElectrophoresis，TGGE) 温度梯度凝胶电泳是继DGGE之后发展起来的DNA指纹图谱技术，与DGGE不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度，而是温度梯度以及在引物的5′端加入3050bp的GC片段。应用此技术能快速地检测单独区系菌群的构成，也可以发现存在的尚未被认识的肠道细菌， Zoetendal等首次用TGGE技术研究了人粪样微生物区系，但该技术在食品中应用较少。4.2随机扩增多态DNA技术（RandomAmplificationofPolymorphicDNA，RAPD） RAPD分析是一种利用随机引物，通过PCR反应扩增靶细胞DNA，分析DNA片段大小和数量多态性，利用不同基因组DNA差异,进行分子标记研究。该技术以整个细菌DNA基因组为研究对象，具有很高的敏感性和特异性,特别适用于分子生物学研究甚少、分子生物学特征不明确或不了解基因组DNA序列的真菌和乳酸菌。 G.Spano等从红葡萄酒中分离出一株菌株，经过RAPD-PCR技术鉴定为植物乳杆菌 Walczak等通过RAPD分析鉴定出非生产用酵母菌株与标准清酒假丝酵母菌株的遗传相似性 除此之外，应用该技术对食源性致病包括葡萄球菌、大肠埃希氏、沙门氏菌和志贺氏菌都有一定的研究。4.3扩增片段长度多态性分析技术（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP） AFLP是对基因组DNA酶切片段进行选择性扩增，将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不同扩增片段长度的多态性。AFLP技术可以分析任何来源DNA指纹图谱的一项通用技术，最早应用于植物学，目前在食品微生物中主要应用在遗传多样性及分类研究、未知菌株鉴定、分析多种来源DNA指纹图谱。 李海星等人运用AFLP技术对发酵酸面团中乳酸菌多态性进行了研究 NairS等人研究了AFLP在对伤寒沙门菌的分型能力上比基因探针技术和脉冲场凝胶电泳更高4.4对PCR产物进行分析和另处理的DNA图谱技术4.4.1限制性片段长度多态性分析技术（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP） RFLP基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割基因组特定片段的PCR扩增产物，得到大小不等的DNA片段，通过凝胶电泳分析这些片段。对于RFLP技术，通常和PCR技术结合在真菌和乳酸菌的分型鉴定上有较广泛的应用，也叫PCR-RFLP技术。 JohnW等应用PCR-RFLP对拟南芥中的细菌群落进行了菌群分析，并确定植物乳杆菌为优势菌群 GiraffaG等人对分离自当地不同乳制品中的35株德式乳杆菌和保加利亚乳杆菌在亚种水平上进行了鉴定。4.4对PCR产物进行分析和另处理的DNA图谱技术4.4.2单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）分析 SSCP是一种以PCR为基础，基于DNA构象差别而进行快速、灵敏、有效检测基因点突变的方法。目前SSCP已被广泛应用于微生物学研究，包括细菌的耐药机制，流行病学的研究等，其中在微生物学的分类鉴定及群落多态性分析中也有广泛的应用。 Satheesh等用PCR-RFLP及PCR-SSCP分析了来自41株10种不同血清型沙门菌的基因，分别得到3种RFLP带型和14种SSCP带型 王永等对食源性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌进行单链构象多态性分析，PCR-SSCP技术可以用来对以上致病菌进行检测。4.5核糖体RNA基因分型技术 核糖体广泛分布于现存的所有生物，且同种生物细胞中的rRNA序列完全一致或极少差异，使得不同微生物种间产生相应的碱基差异，这些碱基差异可以通过相应的技术方法来分析，从而进行菌株的分类鉴定。 目前应用较为广泛的是自动核糖体分型技术（Riboprinter），研究人员已经采用Riboprinter系统对副溶血性弧菌、李斯特菌及沙门氏菌等进行了初步分子分型研究。 李迎慧等采用该系统对食源性单核细胞增生李斯特菌进行基因分型 潘劲草等对O139群霍乱弧菌进行核糖体基因分型并研究其与药物抗性相关性进行了研究。4.6核糖体间隔区分析技术 核糖体间隔区分析技术原理是利用微生物核糖体基因间隔区（IGS）的差异，在菌株水平上被广泛用来对微生物进行分型研究。 其中应用较多的是对酵母菌进行分型，Fell和Blatt通过IGS区分红酵母和红法夫酵母等4种酵母. 目前以该技术为核心的是自动核糖体间隔序列分析技术（ARISA），就是用荧光标记的通用引物PCR扩增群落总DNA中各种细菌的16SrRNA和23SrRNA基因之间的序列，随后在自动化系统上进行凝胶电泳分离，激发光检测代表不同种类微生物的大小不一的DNA扩增片度。 ARISA技术已经成为研究微生物生态学的常用方法，但在食源性微生物中分析应用较少。4.7单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)分析 单核昔酸多态性(SNP)是人类和动物基因组中普遍存在的一种分子标记，主要是指在基因组水平上由单个核昔酸的变异所引起的DNA序列多态性，是第三类分子标记中最为典型的一种。 目前，依据SNP建立的检测技术有等位基因特异性杂交、内切酶酶切技术、引物延伸法、寡核苷酸连接反应。检测技术平台主要有经典的荧光检测技术，还有高通量检测技术：基因芯片、微球阵列技术、质谱仪等。 SNP的研究是目前人类基因组研究的一个热点，目前主要应用在群体遗传学、制药学、法医学、癌症及遗传性疾病等，在物种鉴定及微生物多态性分析中应用较少。4.8肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术（EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus，ERIC-PCR） ERIC-PCR技术是利用ERIC序列中的高度保守区来设计的一对反向引物进行PCR扩增，因此通过该技术扩增基因组DNA。 ERIC-PCR是在随机引物RAPD的基础上发展起来的对细菌DNA进行指纹图谱分析的一种方法，有研究指出，ERIC-PCR与RAPD-PCR相比，稳定性，重复性更好。 目前，ERIC-PCR技术在细菌分类、分子微生物生态学研究中有着广阔的应用，已成为细菌鉴别和细菌分类的分子遗传分析的有力工具，近年来该技术在混合菌群分析、李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌等食源性致病菌中得到广泛应用。