土壤酸性磷酸酶活性的测定
⑴原理
该方法以对硝基苯磷酸二钠(即pNPP)为基质,基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚(即pNP),该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值,根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量
分析
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,以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性,采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。
⑵测定方法
①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中,加入0.2 mL甲苯和4 mL ph6.5 磷酸缓冲液,再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液(用磷酸缓冲液配制),摇匀后加盖,放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时;
②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL,摇匀;
③而后在2500r/min下离心5min;取上层清夜于10ml 离心管4000r/min下再离心5min.
④取上清液在410 nm处比色,并MATCH_
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_1714201247770_1吸收光值。
⑶
标准
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曲线的制作
①取13支玻璃试管,按顺序编号,并按
表
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2加入试剂。
表2对硝基苯酚标准曲线配制表
离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
0.005?mol/mLpNP(mL)0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 0.09 0.10 0.11 0.12
H2O(mL)0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.72 0.71 0.70 0.69 0.68
pNP的含量(?mol)0、0.00005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006
摇匀
0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液(mL) 4
0.5mol/L CaCl2(mL) 1
0.5mol/L NaOH(mL) 4
②混匀后,转入10mL的离心管中,在2500r/min下离心5min,再在4000r/min下离心5min以0号作为对照,在A410nm波长下测光吸收值,并记录光吸收值A410。
③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R,即对硝基苯酚含量n(?mol)=a+b×A410.
⑷计算方法
土壤酸性磷酸酶的活性用每克土中的对硝基苯酚的微克数表示,即(?g/ h g W)=n×M×稀释倍数/(W×t)
式中:n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度(?mol);
M—对硝基苯酚的相对分子质量(为139.11 单位是g/mol);
t —反应时间(h);
W—样品土壤的重量(g)
浙公网安备 33021202002483