第七章植物细胞培养及次生物质生产植物的单细胞培养植物细胞的悬浮培养植物细胞的大规模培养和次生物质生产一、植物单细胞培养定义植物细胞培养（plantcellculture）：是指在离体条件下对植物单细胞或小的细胞团进行培养使其增值培养形成单细胞无性系或再生植株的技术。目的及意义进行细胞代谢研究用于突变体的筛选、遗传转化次生代谢物质的生产（一）单细胞的分离有完整的植物器官分离单细胞有培养的组织分离单细胞1、由植物完整的器官分离单细胞叶片是最好的材料机械法酶解法1.1机械法用刀片刮叶片（二）单细胞的培养培养方法主要有：平板培养法（platingculture）看护培养法（nurseculture）微室培养法（micro-chamberculture）条件培养法（conditionedculture）平板培养技术二、植物细胞的悬浮培养（一）定义：细胞悬浮培养（cellsuspensionculture）：指将游离的细胞或细胞团按照一定的细胞浓度悬浮在细胞培养基中进行培养的方法。（二）特点1、细胞可以不断增值，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养2、能够提供大量的较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。（三）成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。1悬浮培养体系的建立①材料愈伤组织外植体：幼苗、胚轴、子叶。例如：新疆紫草愈伤组织的诱导种子消毒萌发根、胚轴、子叶（作为外植体）接种到含2.4-D和KT的MS培养基上诱导愈伤组织。筛选方法愈伤组织外观为大小均一的小颗粒，疏松易碎、外观湿润、，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。挑出愈伤组织培养于高有机质、高激素、低糖的培养基中培养，诱导出更多得到愈伤组织。悬浮培养挑选的愈伤组织于液体培养基（2克入40ml）120r/min，25℃，弱光下培养2～3d依次用500um、100um的尼龙膜过滤均匀的悬浮体系培养物悬浮培养体系建立2、悬浮细胞增值的衡量
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细胞鲜重（细胞真空去掉多余水分的重量）细胞干重（细胞收集80℃干燥至恒重的重量）细胞密实体积（细胞悬浮液离心后的体积，以每ml培养液中细胞总体积所占的ml数表示）细胞计数（血细胞计数板计算）3、培养细胞的同步化（周期同步化）定义：指的是同一悬浮体系中所有的细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。目的：使同一体系中细胞能保持相对一致的细胞学和生理学性质。细胞周期同步化方法分选法低温处理饥饿法抑制剂法4、悬浮培养的方式分批培养连续培养（1）分批培养：指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养的技术。即将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养的技术。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。分批培养的特点如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。（2）连续培养指在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养液中的营养物质得到不断补充。类型分为封闭型和开放型两种加入培养基排出培养基及其培养物连续培养图示：排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，进出数量保持平衡。封闭型连续培养的特点悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到培养系统中。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液及其中细胞的容积相等。开放型连续培养的特点培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的恒定水平上（通过调节流入和流出的速度）。三、植物细胞大规模培养和次生物质生产（一）、植物产生的代谢物质1、类型初生代谢物：淀粉、糖类、蛋白质等次生代谢物：酚类化合物、黄酮类、生物碱、帖类、皂苷等。2、植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义例如：麻醉药物：莨菪碱健身药品：人参皂苷、人参三醇心血管系统方面：芸香苷、槲皮素天然色素：叶黄素、类胡萝卜素香水香料类：挥发油3、植物细胞大规模培养是生产植物次生产物的理想途径保护生态环境提高生产效率发展新型生物技术产业植物次生代谢产物市场潜能20～35（美国）心脏病药毛地黄5～10（美国）治疗疟疾奎宁5～25（全世界）循环系统障碍药阿吗灵18～20（美国）治疗白血病长春花碱年销售额（亿美元）用途产品成分（二）大规模培养技术建立三步骤：高产细胞株的建立和筛选高产细胞株的增值培养大规模培养体系建立（三）适合工业生产细胞株的筛选指标：1）分散性好，适合大规模悬浮培养2）均一性好，细胞大小，生理状态一致3）生长速度快，培养周期短4）目标产物含量高，容易分离5）细胞遗传稳定性好生产瓶颈（四）、植物细胞大规模培养系统用培养瓶在摇床上培养培养方式用生物反应器大规模培养搅拌式生物反应器常用的生物反应器气升式生物反应器旋转式生物反应器通气搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器发酵罐
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