陶瓷羟基磷灰石CHT应用及放大指南中文

陶瓷羟基磷灰石层析应用及放大手册陶瓷羟基磷灰石层析应用及放大手册（仅用于（仅仅用用于于仅用于参考参参考考参考与与与与交流交交流流交流））））陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册目目录录目录第一章简介................................................................................................................4第二章产品介绍..........................................................................................................72.1陶瓷羟基磷灰石...........................................................................................72.2纯度.................................................................................................................9第三章羟基磷灰石层析............................................................................................103.1CHT羟基磷灰石机制....................................................................................103.2CHT在纯化过程中化学变化........................................................................113.2.1CHT化学反应......................................................................................113.2.2缓冲液中阳离子浓度对于CHT表面化学性质的影响...................123.3 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 指导.......................................................................................................133.3.1化学兼容性.........................................................................................133.3.2洗脱.....................................................................................................143.3.3Co-Buffers使用.....................................................................................153.3.4SNS........................................................................................................163.3.5钙离子.................................................................................................173.3.6磷酸根.................................................................................................173.3.7微量金属元素污染.............................................................................183.3.8磷酸盐制备.......................................................................................183.3.9其他清洗.............................................................................................193.3.10 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 开发IA:lgG................................................................................203.3.11工艺开发IB：lgG.............................................................................203.3.12工艺开发：磷酸盐洗脱...................................................................213.3.13工艺开发：质粒...............................................................................213.3.14工艺开发：酸性蛋白.......................................................................223.3.15条件摸索...........................................................................................223.3.16工艺优化...........................................................................................23第四章再生，灭菌和贮藏........................................................................................244.1再生...............................................................................................................244.2灭菌...............................................................................................................244.3贮藏...............................................................................................................24第五章装柱................................................................................................................255.1一般原则.......................................................................................................265.2.1推荐的装柱缓冲液.............................................................................285.2.2搅拌.....................................................................................................282/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册5.2.3填料传送.............................................................................................295.3开放式柱子装柱...........................................................................................315.4密闭层析柱装填...........................................................................................335.4.1介质转送工作站.................................................................................335.4.2吸入式填料传送.................................................................................355.4.3卸柱...................................................................................................365.5装柱工作站...................................................................................................375.6柱效测试.......................................................................................................395.7装柱...............................................................................................................425.7.1对于可以调节柱头的柱子.................................................................425.7.2对于靠压力的密闭柱子.....................................................................435.7.4调节柱子进行工艺开发.....................................................................435.8实验室规模装柱...........................................................................................445.8.1MilliporeVantageL柱子.....................................................................445.8.2Econo柱装柱........................................................................................47第六章实例分析........................................................................................................496.1装柱—GEChromaflow900/200-400.............................................................496.2装柱-PrototypeMilliporeIsoPakIPP350/500...............................................51附录..............................................................................................................................54A1CHT与缓冲液表............................................................................................54A2EDTA络合滴定测定CHT流出液中钙离子浓度...........................................60A3参考文献........................................................................................................65A4其他资料........................................................................................................65A5订货信息........................................................................................................65A6常见问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ........................................................................................................663/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册第第一一章章第一章简简介介简介羟基磷灰石由钙和磷酸盐形成的化合物。晶体状羟基磷灰石已经被广泛应用于生物活性分子的分析、制备及工业化生产。但是，由于晶体结构的易碎的原因，限制了生产的流速和柱子的高度。20世纪80年代，科学家掌握了高温下烧灼晶体让它形成更加坚固，大孔球状，这允许使用者在非常高流速和压力下不破碎。这就是今天被广泛应用在生物分子纯化的陶瓷羟基磷灰石，该 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 将指导你如何更好的应用陶瓷羟基磷灰石纯化各种生物分子。第二章将详细的介绍陶瓷羟基磷灰石的特性。陶瓷羟基磷灰石（CHT）目前有两种型号：Ⅰ型和Ⅱ型。两种型号主要由不同烧灼温度及时间生成。CHT是一个混合作用的介质。第三章将详细介绍该介质作用机制。CHT在今天更加重视生物下游技术的生物制药企业已经发展成为纯化首选的介质。它混合纯化机制可以提供独特的选择性，能够分离其他介质不能分离的各种比较难分离的、性质比较接近的生物分子。CHT可以用于宿主蛋白(HCP)、脱落的proteinA、抗体二聚体及聚合体、核酸及病毒的分离，可以用于捕获、中度纯化或精纯各个纯化阶段。4/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册表1.1杂质去除ContaminantsReduction，logsAggregates1-2ProteinA1-2Hostcellproteins2DNA>3Endotoxin>44X-MuLV(log10)MVM(log10)2CHT可以提高纯化效率，收率和节约成本：¢在各种规模下和高流速下良好的捕获能力¢各种来源样品保持高的载量¢独特的选择性可以让你减少纯化步骤该指导可以让你在纯化过程中更好地使用CHT，主要包括五个部分：¢产品描述¢纯化¢再生，灭菌及贮藏¢装柱¢纯化应用5/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册该指南是在整理来自全球的层析研究人员的反馈基础上，为你提供从层析方法摸索、优化、装柱等方面全面的指导。如果你有更多的问题，请随时联系当地的销售代表或技术支持。6/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册第第二二章章第二章产产品品介介绍绍产品介绍2.1陶瓷羟基磷灰石羟基磷灰石，分子式：Ca10（PO4）6(OH)2，是一种磷酸钙化合物，包括钙离子(C位点)，羟基，磷酸根（P-位点）。CHT具有独特的分离效果，良好的选择性和分辨率。经常用于分离其他介质所不能分离的、性质比较接近的蛋白。CHT主要应用包括：¢不同亚型抗体及多克隆抗体¢抗体轻链¢抗体片段¢重组蛋白¢病毒颗粒¢疫苗¢酶¢超螺旋DNA¢单链DAN与双链DNACHT是球形、大孔羟基磷灰石，经过高温烧灼和修饰，从纳米晶体形成了陶瓷结构。陶瓷结构保持了纳米晶体结构独特的分离特性，同时批与批之间一致性保证了大规模层析的重复性和稳定性。不像其它介质，CHT既是机制有时功能基团。如果你以前使用晶体状磷灰石开发的工艺，层析的条件仍然可以适用于陶瓷羟基磷7/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册灰石，某些情况可能需要做个小的优化。CHTⅠ型和Ⅱ型都提供三种颗粒规格：20um，40um，80um。两种类型的CHT的洗脱特性与晶体状磷灰石基本一致，但是仍然有些差异。CHTⅠ的蛋白载量比较高，且对酸性蛋白具有更高的载量。CHTⅡ型载量较Ⅰ型载量低，对核酸及某些蛋白具有更好的分辨率。同时CHTⅡ型对白蛋白有低的亲和力，更适合纯化各类免疫球蛋白及其亚型。表2.1技术参数8/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册2.2纯纯度度纯度在陶瓷羟基磷灰石制造过程中，我们选用高纯度的原材料，并且通过电偶和等离子质谱对金属离子分析，通过离子层析控制阴离子，严格控制各种污染物，保证产品的纯度。表3纯度9/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册第第三三章章第三章羟基磷灰石层析3.1CHT羟基磷灰石机制2+3-。羟基磷灰石包括两个结合位点：Ca和PO4这些结合位点按照其自3－有的晶体结构分布。PO4离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有阳离子交换特性；其中的Ca2＋离子与带负电蛋白质的自由羧基簇以金属螯合方式结合。阳离子交换作用：3-阳离子交换作用：当蛋白带负电荷时候，可以与PO4结合，而与Ca2+是相互排斥，这种作用主要是阳离子交换作用。这种阳离子交换作用会受到洗脱缓冲液中的中性盐浓度（如;NaCl）或者平衡液中磷酸盐浓度的影响。这种作用随着pH的增高也会相应减弱。因此，增3-加盐、磷酸盐的浓度或增高pH，都会减弱目的蛋白与PO4之间的相互作用。钙金属螯合作用：Ca2+可以与蛋白或其他分子（如;核酸）表面的羧3-基簇或磷酸基团发生金属螯合作用，而同时与PO4相排斥。这种结合方式作用力是一般离子交换的15-60倍。所以这种结合方式受离子的影响比较小，对NaCl不敏感。而且这种作用力随着离子强度会增加钙金属螯合力，原因是由于离子强度的增加屏蔽了分子表面功能基团与PO3-之间的相互排斥作用。这种结合方式可以通过磷酸钠进行洗脱。10/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册Fig3.1CHT作用机理3.2CHT在纯化过程中化学变化3.2.1CHT化化学学反反应应化学反应2+3--Ca10(PO4)6(OH)210Ca+6PO4+2OH通常情况，羟基磷灰石的Ksp值为10-58.尽管平衡常数非常低，但是在水溶性环境中仍然不能忽视。在溶液中钙离子与磷酸根形成了pH依赖性的平衡。11/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册从化学反应方程式提示CHT的使用：1保持pH高于6.5：保持羟基（OH）浓度尽可能高，这样可以保持CHT维持在不可溶和原始状态。2在各个层析溶液中添加钙和磷酸浓度，可以使得CHT更加稳定。更多的维持CHT稳定性策略将在后面详细讨论。3.2.2缓冲液中阳离子浓度对于CHT表面化学性质的影响CHT的表面结构见图3.2.不同溶液的pH会使得暴露在溶液中磷酸基团不同程度的质子化。特别磷酸酰氧原子质子化。如果溶液中阳离子（图示以Na离子为例）浓度增多，钠离子替代一些质子，质子进入了溶液，引起了pH下降,见图3.3.这种pH下降的现象是可逆的：当溶液中的阳离子浓度降低就会引起质子再吸附到CHT上，导致溶液pH增高。这种质子的吸附和解吸附的过程已经得到深入的研究（Bankstonetal2010,Pabstetal,2008）.在纯化过程中，监控柱子洗脱过程中的pH变化是非常重要的，并且解决任何可能导致pH下降到6.5一下的任何因素。长期暴露在pH6.5酸性条件下降造成CHT的损坏。PH的下降将减少CHT的使用次数。下面我们，我们将介绍几种重要的减轻或消除pH下降的方法。12/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册3.3方方法法指指导导方法指导过程的优化要考虑多种因素：基质相互作用，洗脱条件，放大，法规，药物安全，工艺稳定性及经济性等。下面四个纯化 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 (Fig3.4)可以作为大多数蛋白和核酸纯化起始条件，减少你研发时间。我们将在3.310-3.3.14详细介绍每个方案的关键点。3.3.1化学兼容性所有缓冲液中不能含柠檬酸或EDTA，这些螯合剂会降解CHT。CHT在13/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册含有钙和磷酸根存在，pH6.5-14溶液中,可以兼容以下试剂:¢2MNaOH*¢6MGuanidine-HCl¢8MUrea¢100%acetonitrile¢100%ethanol/methanol¢1%SDSorothersurfactants(notcalciumcompatible)¢4MNaCl¢1Mpotassiumphosphate**¢0.5Msodiumphosphate***NoCaorPO4required**NoCarequired3.3.2洗洗脱脱洗脱在洗脱过程中，缓冲液溶液盐浓度，缓冲液种类或其他元素的变化都可能导致流动相中pH的短暂变化。这种现象主要是流动相中的离子与CHT表面的磷酸基团相互作用的结果。pH的漂移程度主要取决于离子的交换的程度。14/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册3.3.3Co-Buffers使使用用使用Co-buffer，如MES,MOPS或Histidine，加入到洗脱液中可以大幅度减低CHT中质子释放。见Figure3.5.Fig3.5EffectofMESadditiononeffluentpHduringastepelutionofCHTwith0.1M(A)or1.0MNaCl(B)Thecolumnhadpreviouslybeenequilibratedwith10mMphosphate,pH6.8,noMES;,+15mMMES;,+100mMMES;尽管添加Co-buffer之后，pH下降的幅度大大减少了，减少了CHT暴漏在低pH环境的时间。这将会大大提高CHT的使用次数。Co-buffer使用量随着洗脱的条件而变化。Table3.1给出了一些起始Co-buffer浓度建议。备注：对许多Co-buffer，首先以酸形式被添加，溶液用NaOH滴定15/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册到最终pH。如果在Co-buffer研究之前洗脱盐浓度已经确定，那么就需要减少洗脱溶液中NacCl的量，因为Co-buffer中和过程中会产生一些盐。3.3.4SNS理想状态下，如果所有CHT表面的质子在洗脱前能够被中性的阳离子替换而不影响珠子的性能，这样在洗脱过程中阳离子浓度的增加就不会对pH影响。Bio-rad根据这个原理发明了一种称为表面中和溶液（SNS）。简而言之，就是在洗脱之前增加一个弱碱洗脱步骤。见Figure3.6.典型的过程是用25mMTris，25MmNaCl,5Mmphosphate,pH7.75清洗6-8CV。Tris在整个过程中维持整个溶液微碱性，提供大量的氢氧根，与释放的质子迅速结合水。这种溶液已经在20*20cm的柱子上证明能够大幅提高柱子的寿命。许多别的溶液，如Arginie,lysine，histidine,PIPES,HEPES,ACESMOPS,MOPSO,在3.2cm直径柱子也显示有效的提高柱子寿命。单抗研究显示，与传统方法比较，使用SNS后，产品质量（产量，洗脱峰位置，聚合体含量，DNA,HCP）都一样。除此之外，就测试抗体发现，对于使用SNS40次后载量没有发生改变。16/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册在一些研究中，酸性蛋白会在SNS步骤中被洗脱下来。可以对洗脱液质量做个鉴定确定是否可以直接使用SNS作为洗脱缓冲液。3.3.5钙钙离离子子钙离子在3.2.1提到，钙离子也可以增加CHT柱子寿命。通过测量平衡液，上样和洗脱液中的钙离子浓度来决定添加钙离子的数量。这种测定可以通过非蛋白样品在小柱子运行多次获得有效的数值。测试每个样品大概需要10min，直接通过标准的比色法分析获得，详细见附录A2.96孔板也可以利用，具体可以联系Bio-rad.因为钙和磷酸在溶液状态会发生沉淀，确保钙的浓度在缓冲液中低于可溶性限度。钙离子有很好稳定能力，可以添加到任何钙离子泄露的溶液中。对于再生和清洗溶液中可以不需要添加钙离子。3.3.6磷磷酸酸根根磷酸根在3.2.1提到，磷酸根可以提高CHT的坚固性。通常，所有缓冲液都应该包含5mM磷酸盐。当缓冲液pH大于7.0，磷酸盐浓度可以降低到2mM.高于5mM磷酸盐浓度可能会降低蛋白的结合。见Figure3.7,17/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册50MmMES缓冲溶液中随着磷酸盐浓度增加CHT的载量随之减低。3.3.7微量金属元素污染CHT可以与溶液中微量金属元素结合，如铁离子。金属元素污染可能来源于样品，缓冲液和盐，生产用水，或者腐蚀的不锈钢。随着微量金属元素的沉积，柱子上部就形成了一有色层。如果出现了这个问题，可以再过滤之前用CHT预处理缓冲液，或者在上样前安装一根CHT保护柱。也可以添加微量的钙饱和EDTA,具体更多细节请联系Bio-Rad.3.3.8磷酸盐制备在所有缓冲液中制备都需要用含水磷酸盐。不能使用无水磷酸盐，因为这些盐的制造过程会导致焦磷酸盐产生。焦磷酸盐会抑制一些大分子的结合和减少CHT的选择性。配置过程中避免pH反滴定，因为这会增加电导和减少目的蛋白结合。避免使用十二水化合物，因为十二水化合物会自然会降解为七水化合物。18/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册如果钙使用过量，就会与CHT的磷酸根位点结合，同时会与再生的磷酸盐缓冲液形成沉淀。3.3.9其其他他清清洗洗其他清洗如果洗脱液中钙离子水平高于10ppm，在高磷酸盐洗脱之前用pH7.5-8.0的低磷酸盐缓冲液清洗3个柱体积。同时，在涉及高磷酸和高NaOH溶液之间步骤增加0.5CV清洗步骤。19/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册3.3.10工工艺艺开开发发工艺开发IA:lgG3.3.11工工艺艺开开发发工艺开发IB：：：lgG20/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册3.3.12工工艺艺开开发发工艺开发：工艺开发：：：磷酸盐洗脱磷酸盐洗脱3.3.13工工艺艺开开发发工艺开发：工艺开发：：：质粒质质粒粒质粒21/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册3.3.14工工艺艺开开发发工艺开发：工艺开发：：：酸性蛋白酸酸性性蛋蛋白白酸性蛋白3.3.15条条件件摸摸索索条件摸索目的蛋白通常用磷酸盐梯度洗脱。根据最初的洗脱结果调解线性洗脱的梯度。洗脱也可以用阶段洗脱或流穿模式。通常，蛋白的保留时间随着PI的增高而增强。22/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册3.3.16工工艺艺工艺优化工艺优优化化优化1选择最佳的缓冲液试剂，确保添加一定量的钙和磷酸盐维持CHT基质稳定；2样品的离子强度应该与起始平衡缓冲液一致。稀释，超滤或者用Bio-GelP-6DG脱盐等方法都可以使用。3对于层析缓冲液，在使用前用0.2-0.45um过滤。4如果500mM磷酸钠不能洗脱目的蛋白（极少），可以尝试高浓度的磷酸钾。5如果洗脱峰不够尖，尝试使用10CV线性洗脱。6可以把线性洗脱转化为阶段洗脱。7用5mM磷酸盐浓度下得到的最大载量决定最佳pH23/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册第第四四章章第四章再再生生再生，再生，，，灭菌和贮藏灭菌和贮藏4.1再再生生再生需要用500mM中性磷酸盐或磷酸钾溶液或400mM磷酸三钠（pH11-12）清洗3-5CV完成再生。柱子也可以用包含5mM磷酸根中性1-2KCl,NaCl,6M尿素或8M盐酸胍清洗柱子。4.2灭灭菌菌灭菌柱子可以用浓度至2NNaOH消毒，也可以贮藏在0.1-1NNaOH。4.3贮贮藏藏贮藏未开启使用的CHT可以室温保存。一旦浸润，需要保存在0.1NNaOH室温保存。如果使用低于100mMNaOH，请添加10Mm磷酸盐。使用过的CHT，需要再生和灭菌之后，用不高于1NNaOH，室温，避免阳光直射保存。24/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册第第五五章章第五章装装柱柱装柱本章主要介绍如何装柱，装柱之前请自己阅读。好的柱子是指保证填料从上到小均匀和连续，能够保证层析最好的分离效果。下面章节将涉及装柱缓冲液，柱效测定和柱子放大的条件。CHT是坚固，高流速，低反压填料，Figure5.1和Figure5.2显示了40um和80umCHT流速与反压的关系。25/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册5.1一一般般原原则则一般原则1CHT是不可压缩，非球形颗粒，这样仅仅靠填料沉降不可能让填料在柱子里形成完美的立方体的效果。如果有外力的震荡，例如柱子从装住的位置推到生产的位置，柱子里面的填料将会重新调整。另外，柱子使用多次之后也会有轻微的调整。这种现象就会造成：¢由于柱床的压缩就会造成柱高降低（柱头空间增大）¢由于更好的装柱效果，操作压力增高2对于装好的柱子，不要把柱头压进入填料里，柱头与柱床底部总是留出0.1-1.0cm的空隙。这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力盒玻璃柱子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高26/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册度10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以100cm/hr线性速度装柱，同时调整马达以50cm/hr的线性速度提升柱头，当柱头提升0.5cm时候，停止泵和马达。3整个层析过程不能反流和反洗。下面的装柱方法和柱子可以用来装陶瓷羟基磷灰石CHT:¢具有马达控制，柱头可以调节高度的轴向开放式柱子¢柱头可调节高度，流速装柱的开放式柱子¢具有马达控制，柱头可以调节高度的轴向密闭式柱子¢密闭的压力装柱的柱子（需要用装柱工作站）最佳做法：所有类型的轴向流速大规模层析柱都可以用来装CHT。装柱前请仔细阅读相关柱子，接辅助的介质传送装置或层析系统操作手册，确保所有操作都符合该手册的推荐。5.2填料准备CHT最初购买时候以干粉状态保存。当你倾倒干粉时候，请穿戴防尘面罩，手套，安全眼镜和实验室工作服等个人防护装备。5kgCHT储存罐有塑料密封圈和螺旋盖密闭。密封圈确保储存罐填料装好后没有被打开。螺旋盖确保密封圈紧密的被密封。当你发现储存罐上面有灰尘，请用湿布搽干净，然后用干净的干27/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册布搽干。使用前，可以翻转几次让CHT粉末均匀，自由流动。5.2.1推荐的装柱缓冲液对于装柱缓冲液，至少需要150mM离子强度，pH高度6.8。下面的装柱缓冲液已经被成功的应用于40um，80umCHT装柱：¢20mM磷酸盐缓冲液+150MmNaCl，pH7.2-8.0¢200-400Mm磷酸钠或磷酸钾，pH6.8-10¢0.15-1NNaOH最佳做法：对于第一次使用，装柱缓冲液不能低于150mM离子强度，低于该离子强度可能会形成浑浊的悬浮液。如果使用高于150Mm缓冲液，pH高于6.8，就会消除或最大减小这种现象。5.2.2搅搅拌拌搅拌手动搅拌：不管在溶气罐里或开放式柱子里搅拌，推荐使用J形或可以来回移动的单翼的聚丙烯搅拌桨。标准的圆形搅拌可能会导致均匀混合。气体搅拌：如果你的层析朱是用不锈钢筛板，你可以用气体搅拌。气体搅拌需要用干净的压缩空气，氩气，氦气或氮气，低压搅拌至均匀。气体通过到柱子底部的出口与气体口链接。这种方法可以搅拌至50%（V/V）浓度的填料悬浮液。当你的柱子是多孔聚乙28/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册烯，聚丙烯筛网或者没有支撑的尼龙筛网或不锈钢过滤网时候，请不要需用气体搅拌方面。如果你确定你的柱子类型，请联系柱子制造商。悬浮液储罐对于填料储存罐，两种方法推荐。第一方法，使用低剪切力翼型轴流桨，速度控制在镜可以保证颗粒维持悬浮状态而又不引起涡流。第二种方法，气体混合搅拌，气体连接到储液罐的出口。不要用在底部安装的喷射环，因为这种喷射环不能保证让所有的填料颗粒都悬浮。请按照CHT粉末的多少添加正确量的缓冲液。备注：过大的搅拌或非低剪切力叶桨都可能伤害填料颗粒。这种细小的颗粒就会造成柱子反压的增高。不要使用隔膜泵或蠕动泵反复循环填料匀浆，这种过大的物理力可能会破会填料，蠕动泵和隔膜泵将会使得填料破碎，同时也是填料损坏的主要原因。对于用这些些泵单次传送填料悬液可以最大限度的破坏填料颗粒。千万不能用于多次循环填料传送，因为高剪切力和颗粒在管路里的碰撞，挤压都会加速颗粒的破坏。压力储存容器是最好的。5.2.3填填料料传传送送填料传送抽吸或真空填料传送对于一些具有马达的层析柱子可以不用泵完成调料传送，通过马29/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册达控制可调节高度的柱头像针管一样把填料抽吸进入柱子。这种传送可以以200cm/hr（40umCHT）或300cm/hr（80umCHT）线性速度迅速的完成填料传送。介质传送工作站介质传送工作站能够把正在搅拌的存储罐里的调料悬液转入到开放的柱子里。当介质传送工作站用隔膜阀传送时，控制悬浮液浓度小于50%V/V。更低的浓度可以确保更好的装柱效果。如果低于15%V/V(9.5w/v)浓度对于装柱效果提高可以忽略不计。填料装柱工作站填料装柱工作站是通过一个含有多个管口的喷嘴把填料从存储罐中装入密闭的柱子里。当用这种方法装CHT时候，填料悬液浓度应低于25%V/V（15.8W/V）。更低的浓度可以确保更好的装柱效果。如果低于15%V/V(9.5w/v)浓度对于装柱效果提高可以忽略不计。但是由于过度的物理力量可能会对填料造成破坏。蠕动泵和隔膜泵将会使得填料破碎，同时也是填料损坏的主要原因。更低的填料悬液浓度减少了剪切力和管路和喷嘴中颗粒与颗粒之间的碰撞和挤压，最大限度的减少了对颗粒的破坏。所谓低浓度悬浮液是指低浓度于26%V/V或16w/v。对于用这些些泵单次传送填料悬液可以最大限度的破坏填料颗粒。千万不能用于多次循环填料传送，因为高剪切力和颗粒在管路里的碰撞，挤压都会加速颗粒的破坏。压力储存容器是最好的。30/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册5.3开放式柱子装柱开放式柱子是通常用于中试或小规模生产,如¢Bio-RadEasypackcolumns¢BPGcolumns(GEheralthcare)¢Quickscalecolumns(Millipore)首先通过查看附录TablesA1-A5，你可以确定正确的CHT使用量。该附录包含了柱管高度为500,600,700和900mm，最大装填高度为400,500,600,800mm规格的柱子。柱管与装填高度之间100mm高度是由于需要留出柱头的高度。例如：需要装45cm直径的柱子，最终装柱高度为15cm，15.03kgCHT加入58.6L的装柱缓冲液中，就得到37.5%V/V的悬浮液。装柱1调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。2浸润底部筛板，确保没有空气。关闭底部出口阀门。3计算需要装柱的缓冲液体积及CHT重量。反复翻转CHT储罐使得CHT颗粒变松，以便容易倒出。a．把装柱缓冲液倒入柱子里；b．如果采用气体搅拌，把气体调到推荐的压力使得缓冲液能够轻微的搅动；c．如果使用手动搅拌，用搅拌桨搅拌；31/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册d．一边搅拌，一边把CHT粉末倒入到缓冲液中，继续搅拌4CHT完全倒入之后，用洗瓶清洗搅拌桨和柱管壁5把轴头放进柱管，打开入口阀，固定在离液位2cm高位置；6密封轴头（O型圈，膨胀密封圈，压缩密封圈）。使得液体不能通过密封圈，同时又可以降低柱头。7可以静置1min。降低柱头排除柱头里的气体；8完全密封柱头密封装置9打开出口阀，以300cm/hr流速装柱，直至柱床平稳或者使用缓冲液大约3倍柱体积后；10停止流速，关闭出口阀，保持进口阀开着；11降低柱头，让装柱缓冲液从柱子入口流出；12继续降低柱头，指导柱头降到高于10%目标柱高位置。柱床填料面与柱头之间留出0.1-1cm高度是可接受的。这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力和玻璃柱子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高度10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以100cm/hr线性速度装柱，同时调整马达以50cm/hr的线性速度提升柱头，当柱头提升0.5cm。13调整操作流速继续平衡3-5CV；14测试柱效。32/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册5.4密闭层析柱装填大的层析柱都是密闭的层析柱，必须通过介质传送阀把填料传送到柱子中。可以通过多种方法把填料传送到柱子里：¢通过泵或压力容器填料传送¢抽吸进入¢装柱工作站5.4.1介质转送工作站通过这种填料传送方式的柱子，主要包括：¢Bio-RadInplacecolumns¢BioProcessLPLCcolumns（GEHealthcare）对于这种柱子，必须根据你需要的高度计算出确定的CHT数量，然后把所有的填料都转运进入柱子。1调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。2根据柱子大小通过TableA5计算出所需要的装柱缓冲液体积及CHT重量。如果需要，请留出额外的清洗泵和传送管路的缓冲液体积。3按计算的缓冲液体积及CHT重量准备介质悬液。4放置柱头在Inplace的最高处或者BioprocessLPLC柱子的介质传送阀下面；5通过介质传送阀迅速的将填料传送进入柱子，快速的传送同时保33/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册证填料充分混合；6关闭填料进口阀；7保持静置1min或者看到悬浮液有水层出现。减低柱头到悬浮液层，密闭密封圈。8关闭出口阀门，打开进口阀，减低柱头2-4cm排除上筛板和柱管的气体；9关闭进口阀门，打开出口阀门；10对于马达控制的层析柱，调整柱头速度300cm/hr(Bio-radInplacecolumn)或者700cm/hr（80unCHT）和500cm/hr（40umCHT）（LPLC）。不要超出柱子推荐的最大压力。11继续降低柱头，指导柱头降到高于10%目标柱高位置。柱床填料面与柱头之间留出0.1-1cm高度是可接受的。这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力和玻璃柱子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高度10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以100cm/hr线性速度装柱，同时调整马达以50cm/hr的线性速度提升柱头，当柱头提升0.5cm。12调整操作流速继续平衡3-5CV；13测试柱效。34/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册5.4.2吸入式填料传送通过这种填料传送方式的柱子，主要包括：¢Bio-RadInplacecolumns¢AxiChromcolumns（GEHealthcare）对于这种柱子，必须根据你需要的高度计算出确定的CHT数量，然后把所有的填料都转运进入柱子。建议多准备5-10%悬浮液。1调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。2按计算的缓冲液体积及CHT重量准备介质悬液。3放置柱头在Inplace的最低处，柱子和辅助传送管道先用装柱缓冲液浸润，密闭柱子。4以200cm/hr（40umCHT）和300cm/hr（80umCHT）提升柱头，通过底部介质传送阀将填料传送进入柱子；5当达到计算的高度，停止柱头移动，关闭填料进口阀；6关闭柱头进口阀门，打开柱子出口阀，调整柱头速度300cm/hr开始轴向压缩。不要超出柱子推荐的最大压力。7继续降低柱头，指导柱头降到高于10%目标柱高位置。柱床填料面与柱头之间留出0.1-1cm高度是可接受的。这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力和玻璃柱子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高度10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一35/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以100cm/hr线性速度装柱，同时调整马达以50cm/hr的线性速度提升柱头，当柱头提升0.5cm。8调整操作流速继续平衡3-5CV；9测试柱效。5.4.3卸卸柱柱卸柱不管开放式或密闭柱子，所有调节柱头柱子的卸柱程序都比较相似。1给100-200cm/hr向下流速，同时以低于线性流速速度提升柱头维持一个正向流速；2直到柱头出现5-10cm空隙3降低流速至100cm/hr,同时改变流速方向由向下改为向上。4不断的改变流速方向，直至柱床填料坍塌；5释放柱头密封圈a对于开放式柱子，移开柱头b对于密闭柱子，提升柱头至最高位置7从柱子中移除填料a对于开放式柱子，用干净的器皿或隔膜泵转移出填料b对于密闭柱子，打开介质传送阀，用介质传送工作站移出填料36/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册5.5装柱工作站装柱工作站主要用于固定柱头或半移动柱头的密闭层析柱，如：¢Chromaflowcolumn(GEHealthcare)¢Resolutecolumn(Pall)¢IsoPakcolumn(Millipore)¢EasternRiverscolumn附录TableA.5列出了直径40-240cm，装柱高度为10-20cm的密闭柱子所需CHT数量。这种柱子一般柱管高度50cm，柱头固定在5-40cm高度。装柱：1调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。2设定好柱头的高度；3根据不同柱子密封好柱头；4把介质传送系统，柱子充满装柱缓冲液，把柱子和管路里面空气去除干净。5按计算的缓冲液体积及CHT重量准备介质悬液。反复翻转让CHT变得分散而容易倒出。a倒出预算数量的装柱缓冲液至容器罐中；b参考5.2方法搅拌缓冲溶液；c把计算好的CHT粉末倒入到储存罐中，搅拌5min6根据柱子和装柱工作站压力的最大耐压，调整压力用最快的37/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册速度把CHT悬浮液通过上面的喷嘴打入到柱子中a根据产品说明书，一直到装柱工作站停止；b关闭柱子出口阀；7关闭工作站喷嘴，按照产品说明书立刻清洗相关管路；8以操作流速用装柱缓冲液平衡5CV；9测试柱效。最佳做法：对于大于200L的填料悬浮液，用低剪切力的水翼叶轮搅拌。不要用传送泵搅拌和混合填料。对于密闭柱制造商推荐装柱后反冲，可以移除柱子进口的气泡。但是对于羟基磷灰石装柱，我们不推荐装柱后反冲。卸柱请按照下面的指导原则拆柱。对于CHT仔细计划拆卸和重装的策略。高浓度，长时间搅拌，反复的搅拌和反复装柱都会引起CHT颗粒不可逆的破坏。介质装填设备仅用于让装好的CHT填料疏松，导入填料罐。不要用收集的填料悬浮液在循环到柱子里。不要让填料残留在装柱工作站，管路和喷嘴里。如果发生了残留，必须拆掉被堵的部件。拆卸程序如下：1准备一个10倍柱体积容器。例如：如果需要拆100L的柱子，38/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册需要1000L的容器；2设置两个喷嘴“Unpack”;3使用装柱泵把缓冲液（测试或装柱缓冲液）泵入柱子和收集填料；a最好使用填料罐收集填料悬浮液；不是容器经常比较小。1）如果这种情况，拆卸柱子至填料罐体积；2）每次拆卸，停止泵，关闭喷嘴，清洗CHT填料管路；3）把CHT传送到填料罐中：对于40umCHT传送速度180cm/hr；对于80um大颗粒CHT速度设置1000cm/hr;4）把填料吸入到填料罐里。b．重复步骤3直至缓冲液中看不到CHT颗粒。移除填料悬浮液上面的颗粒。4按照制造商的指导清洗柱子。5.6柱柱效效测测试试柱效测试在装柱后直接测试柱效。以后可以再固定时间段，或者当分离性能有所下降的时候，可以测柱效。柱效测试主要是测试装柱效果和监测柱子的使用寿命。柱效可用HETP(等同于理论塔板数的高度)和对称因子（Af）来监测装柱的效果。柱效通过注入2%丙酮和1MNaCl作为测试缓冲液来检测。最好的平衡缓冲液是0.15MNaCl，20MmPB,Ph7.2-8.0.39/70陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层层析析层析应用及放大手册应用及放大手册测试体积最好为1-5%柱体积。流速为75-150cm/hr，但是每次测试的要保持一致。超出此范围的流速对于某些过程也可以接收，然而，Af和HETP测试结果不是最佳。如果已经定义了柱效接收范围，柱子理论大塔板数可以作为装柱使用的一个接受标