耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核表达载体的构建

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核表达载体的构建 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核 表达载体的构建 ? 984?中国药物与临床2010年9月第lO卷第9期ChineseRemedies&ini塑 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 mecA基因原核表达载体的构建 郭慧芳张燕军 【摘要】目的对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因片段进行扩增表达,纯化及鉴定.方 法应用聚合酶链反应(PCS)扩增技术获得编码PBP2a转肽酶区的meeA基因片段,将此目的基因片段与pET一 21a(+)载体连接,构建pET一21a(+)一mecA的重组质粒,经双酶切,测序正确后,将重组质粒转入E.coliBL21DE3 中.用IPTG诱导meeA融合蛋白,并对表达产物进行鉴定.结果构建了mecA基因的原核表达载体,并获得高效 表达.结论获得了mecA基因编码的PBP2a蛋白,为MRSA的耐药机制,药物治疗等进一步研究奠定了基础. 【关键词】葡萄球菌,金黄色;基因;青霉素结合蛋白2a ConstructionofaprokaryoticexpressionvectorofmecAgeneinMRSAGUOHui-fang,ZH ANGYah-jan.De— partmento厂Clinicol己aboratory,ShanxiProvincialPeopleSHospit01,Taiyuan030012.China 【Abstract】ObjecfiveToamplifiy,express,purifyandidentifythemecAgenefragmentofmethicillin—resistant Staphylococcusaureus(MRSA).MethodsPCRamplificationwasusedtoobtainmecAgene fragmentcontaining transpeptidasePBP2acodingregion,whichwasconjugatedwithpET一21a(+)carriertoestablishrecombinantplasmid ofpET一21a(+)一mecA.Afterdoubleenzymedigestionandsequenceverification,therecombinantplasmidw astrans— formedintoEcoliBL21fDE3).IprrGinductionofmecAfusionproteinwasperformedandex pressionproductswere verified.ResultsTheprokaryoticexpressionvectorofmecAgenewasestablishedwithahigh lyefficientexpression. ConclusionAnmecAgenefragmentcodingPBP2aproteinwasobtained,whichmayprovide abasisforfurtherstudy ofdrugresistanceandmedicaltreatmentofMRSA. 【Keywords】Staphylococcusaureus;Gerie;PBP2a 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是威胁人 类健康的重要耐药致病菌之一[,随着其感染率的 不断上升,已引起全球范围内的广泛关注.MRSA不 仅对B一内酰胺类抗生素均耐药,而且对氨基糖苷 类,大环内酯类,四环素类,氟喹诺酮类,磺胺类,利 福平均产生不同程度的耐药.MRSA的检出率正逐 年递增.耐药情况也愈发严重,一旦临床上出现 MRSA的感染,对于临床医生来说都是很棘手的. MRSA的主要耐药机制与其mecA基因大量表 达一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a有关,PBP2a 与8一内酰胺类抗生素结合活性很低,可替代高亲和 力的PBPs行使功能,因此了解关于PBP2a的结构 和功能,对于研究和开发拮抗MRSA的药物具有重 要的指导意义.本研究应用聚合酶链反应(PCR)方 法扩增出mecA基因片段,克隆至原核表达载体,诱 导其在大肠杆菌中表达,以期为后续的药物研发,检 测试剂盒的研制等提供数据. 1材料与方法 基金项目:山西省人民医院青年基金(200751) 作者单位:030012太原,山西省人民医院检验科 1.1菌株来源:2008年8月至2009年8月.我科共 收集134株MRSA,从中选取20株进行试验. 1.2主要试剂:pET一21a(+)质粒,大肠杆菌XL1一 BLUE,细菌DNA柱提取试剂盒,质粒抽提试剂盒, DNA胶回收试剂盒均购自上海生物工程有限公司: MRSA分离株,ATCC25923由本科微生物室保存;限 制性内切酶为Takara公司产品;所有引物由上海生 物工程有限公司合成 1.3主要实验仪器:Vilber凝胶成像分析系统 (France);Mx3000P基因扩增仪(美国). 1.4MRSA菌株的鉴定:所有我室保存的MRSA菌 株均是由头孢西丁筛选得到的.从中选取2O株进行 mecA基因的检测.引物:上游5一GCAATCGC— TAAAGAACTA一3,下游5一TGGGACCAACATAAC— CTA一3,以敏感的金黄色葡萄球菌的标准菌株 ATCC25923为阴性对照进行PCR,在加好的PCR 体系中分别直接接种2O株MRSA(约0.5)作为 模板,条件为94?变性5rain后,94?30S,50oC 30s,72eC40S循环30次,72.C延伸10rain结束. 1.5mecA基因的PCR扩增:?细菌DNA模板的制 中国药物与临床2010年9月第lO卷第9期 ChineseRemedies&Clinics,September2010,v01.1O,No.9 备:用接种环挑取单个菌落接种于装有5mlLB培 养液的锥形瓶中,37?,150r/min恒温摇床过夜;取 出培养瓶.取1.5ml置于EP管中.按DNA提取试 剂盒,用柱抽提的方法提取出DNA.?引物:上游:5一 CCGGATCCACTATTCATGCTAAAGITCAAAAG一3. 下游:5一CCCAAGCTYATI~CATCTATATCGTA1_I?,一 1rrATTA一3.?扩增:反应体系:细菌DNA模板1 l,10mmol/L的引物各4,dNTP8l,反应缓冲液 2Ol,加灭菌去离子水至总体积5Ol.PCR反应条 件为94?变性5min后94?30S.48cc30S和 72cClmin,循环35次,72?延伸10min结束反 应;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,并进行琼脂糖凝 胶回收 1.6目的基因与载体连接:?将纯化的目的基因片 段,与PET一21a进行BamHI和HindIII双酶切.37 ?过夜.?将酶切后的目的基因和pET一21a进行连 接(配好体系后,4?过夜). 1.7重组子提取和鉴定:?感受态细菌DH5o~的制 备:将E.coliDH5c~在LB培养基分离两代后转移到 一 无菌的,冰预冷的聚丙烯离心管中,冰上放置l5 min,4000r/rain,4?离心20min,弃上清.加入预冷 的10ml0.1mol/LCaC1悬浮细菌,冰上放置lO min,弃上清.加入预冷的1ml0.1mol/LCaC1(含 15%甘油)悬浮细菌.分装(80Ixl/管)于预冷的离心 管中.一70?保存备用.?连接产物的转化:取出感 受态细菌,一管加入mecA—pET21a连接物5l,另 管中加入一标准质粒1Ixl,混匀后置于冰上30min. 42?水浴60S.迅速放置冰上3,5min,每管中加入 900txlLB(不含Amp),置37cc摇床震摇1h.?质 粒DNA的提取鉴定:蓝白斑筛选细菌菌落后,进行 质粒抽提,并送上海生工生物工程技术服务有限公 司测序分析. 1.8mecA基因的诱导和表达:将确证的pET一21a (+)一mecA转化到感受态E.coliBL21(DE3)中,挑取 单菌落,接种于含2mlLB/Amp+试管中,37qC震摇 (225r/min)过夜,次日将过夜菌以1:40倍稀释后再 37继续震摇.取出1ml细菌做对照用,其余菌液 分于4个大试管中,分别加入IPTG至终浓度为 0.5,1,2,4mmol/L,继续震摇4,5h,各取出1ml菌 液加入到1.5ml离心管中,12000r/min离心1min 收集细菌,向沉淀中加入50l2×十二烷基硫酸钠 (SDS)上样缓冲液,混匀后煮沸5min,取20l进行 10%SDS一多丙烯酰胺冻胶电泳(PAGE),80V电泳2 ? 985? h.电泳结束后,考马斯亮蓝染色. 1.9重组蛋白纯化和鉴定:挑选一株表达量多的细 菌,IFrG诱导融合蛋白表达,取诱导后菌液.经离 心,重悬,溶菌,温育等过程后,得到不溶的包涵体. 经两次透析复性,测AA的值,按公式计算蛋白 浓度.取融合蛋白10l进行10%SDS—PAGE,80V 电泳2h进行鉴定,确定其相对分子质量是否正确. 其余冻存于一20?冰箱. 2结果 2.1MRSA鉴定结果:20株经头孢西丁筛选的 MRSA有l8株在223bp处出现明显条带.将没有 出现mecA基因的2株细菌去除后.其余进行后续 试验. 2.2mecA基因的扩增:经PCR扩增后的产物进行 电泳,在1000bp处出现明显条带,与片段预期结果 一 致见图1 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M:DNAmarker;l:lilacA 图1PCR扩增目的基因片段 2.3重组质粒pET一21a(+-mecA酶切鉴定结果: 将重组子pET一21a(+)一mecA同时用进行BamHI 和Hindm双酶切后.进行凝胶电泳.可以看到含有 插入片段的重组载体.经酶切后得到1条约为3400 ,与实验预期相符.见图 bp及l条1000bp的条带 2 3400bo 1000bp 1:pET一2la(+)质粒(未重组的);2,4:经BamHI和Hing~[酶切过 的不同pET一21a(+),meeA重组质粒;M:marker 图2重组质粒PET一21a(+)一mecA双酶切鉴定 ? 986?中国药物与临床2010年9月第10卷第9期ChineseRemedie— s&— Cli— nics 2.4重组子的测序:将重组子送上海生物工程技术 服务有限公司进行测序.测序结果与Genebank X52593基本一致. 2.5重组蛋白的表达与纯化:重组质粒经IPTG诱 导后.在38000bp处新增明显条带,且基本未见杂 蛋白带.见图3. 175ooO 83ooO 62O00 475o0 3250o 250oO l65o0 6500 M:marker;I:对照组:2:1P'I~诱导后的重组质粒;3:纯化后的融台蛋白 图3重组蛋白的表达与纯化 3讨论 MRSA产生4种主要的青霉素结合蛋白PBPs, 即PBPI,PBP2,PBP3和PBP4.PBPs是细菌细胞壁 合成过程中所必需的转肽酶,它通过催化肽链之间 的连接,构成细胞壁肽聚糖的多层网状立体结构, 13一内酰胺类抗生素通过与PBPs结合而抑制PBPs 的酶活性,阻碍细胞壁黏肽合成,使细菌细胞壁缺 损,菌体膨胀崩解;而MRSA产生了一种特殊的 PBP2a.PBP2a约含有668个氨基酸,相对分子质量 约为78000.该蛋白由N一末端跨膜区,非青霉素结 合区和转肽酶区三部分组成[2],第327,668位氨基 酸为转肽酶区,内含低亲和力的B一内酰胺类抗生素 作用的位点,因而很少或不被该类抗生素结合,当 B一内酰胺类抗生素破坏高亲和力PBPs时,PBP2a 仍能维持细菌的生长和繁殖,表现出耐药性. MRSA的耐药决定因子为mac,其中mecA为结 构基因.它大量表达这种特殊的编码PBP2a蛋白, 从而导致了金黄色葡萄球菌耐药.mecA基因是金黄 色葡萄球菌通过转座机制获得的外来基因,它不仅 介导金黄色葡萄球菌对B一内酰胺类抗生素的耐药 性,而且mecA基因所在的DNA片段SCCmec还能 不断的获得积累其他的耐药基因,促进金黄色葡萄 球菌多重耐药性的发展. 选择的质粒pET系统是目前最理想的利用大 肠杆菌表达外源基因的原核载体之一.具有如下优点:?N端含有17启动子,1_7转录起始元件,17启 动子是目前大肠杆菌中最强的启动子,只有在1_7噬 菌体RNA聚合酶的作用下才能被启动;?载体上有 大肠杆菌trxA基因,编码109个氨基酸的硫氧化蛋 白,外源蛋白与硫氧化蛋白的融合表达可以保护外 源蛋白不易被降解:?具有氨苄青霉素抗性基因,可 以抑制大肠杆菌其他基因的表达,从而提高目的基 因的表达效率,同时还可作为阳性克隆的筛选标志; ?含有laclq阻遏蛋白基因.可诱导高效表达;?c 端含有HisTag.便于镍柱亲和层析纯化蛋白. 金黄色葡萄球菌能引起严重的感染,广泛向社 区扩散,而且其严重的耐药性使之成为世界范围内 医学领域的一个重要难 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .因此对其耐药机制的研 究成为众人关注的热点,近年来,随着各种检测技术 的进步,金黄色葡萄球菌的耐药机制也更为清晰,由 于mecA基因的存在是MRSA耐药性表达的前提, 所以本实验针对其mecA基因进行研究.在基因水 平上对mecA原核表达载体的构建,诱导其在大肠 杆菌表达,这对进一步研究其生物学特性以及结构 和功能有重要意义.也为深入研究MRSA的耐药机 制及抗MRSA的新型药物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 提供理论依据. 参考文献 1PearsonH.Bacteriadefte8last—resortantibiotic.Nature,2002,6: 469 3/JimD,StrynadkaNCJ.Structuralbasisforthep—lactamresis- tanceofmethicillinresistantstaphylococcusaureus.NatstrutBi- ol,2002,9(11):870. 2樊新,岳乔红,杨柳,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因 的鉴定分析.现代检验医学杂志,2007,22(6):66—67. (收稿日期:2010—06—24)