中性蛋白酶的固定化及其在烟用香精香料中的应用研究

中性蛋白酶的固定化及其在烟用香精香料中的应用研究 中性蛋白酶的固定化及其在烟用香精香料中的应用研 究 华中科技大学 硕士学位论文 中性蛋白酶的固定化及其在烟用香精香料中的应用研究 姓名:戴魁 申请学位级别:硕士 专业:有机化学 指导教师:龚跃法 2011-01-11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘要 烟用香精香料是现代卷烟产品的重要组成部分,目前烟用香精香料主要依靠对 天然植物的提取、化学合成两种途径得到。由于人工合成的香料存在安全性争议, 天然植物来源的香精香料备受关注。传统的提取方法虽然能够较为全面地对植物中 的致香组分进行提取,但难以避免引入植物中的蛋白质、纤维素、果胶等影响烟草 吸味和香精香料 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 观状态的大分子物质,因此通过对应的酶对这类大分子物质进行 降解可以提高烟用香精香料的品质。由于酶的化学本质是蛋白质,游离酶在参与酶 解特定大分子底物的过程中也同时对烟用香精香料产生污染,固定化酶在这方面的 优越性可以很好解决这一矛盾。本文制备了不同氧化度的海藻酸钠凝胶以及几种磁 性复合二氧化硅载体,评价了固定在这些载体中性蛋白酶的酶学性能,初步考察了 其处理墨旱莲提取物的工艺。本论文的主要工作为: 1 合成了一系列不同氧化度的部分氧化改性海藻酸钠凝胶,并研究了它们共价 固定化中性蛋白酶的效果。结果表明:固定化 pH,载体氧化度,给酶量等因素对酶 的固定化指标有着较大的影响。 2 以磁性四氧化三铁表面上 3-氨丙基三乙氧基硅氧烷和正硅酸乙酯之间简单 聚合反应为基础,通过戊二醛交联和丙烯酸甲酯接枝制备了几种磁性复合二氧化硅 载体。其中经戊二醛交联的载体固定化效果最好,最佳固定化条件为:0.5%戊二醛 用量为 30 mL,交联时间为 2小时;加酶量为 15mg/0.1g 载体,固定化时间 为 50min。 所得到的固定化酶活力达 2500U/g载体。 3 以墨旱莲提取物作为酶解底物,优化了酶处理工艺。最佳工艺为:酶解时间 8 小时,固定化酶加酶量为 3g;外源糖加入量为 6g,80?下加热4小时。所 得到的 提取物添加到卷烟中后与空白对照在香气质、口感、刺激性方面有较大的改 善。GC-MS 成分分析表明挥发性杂环类物质明显增加。 综上所述,固定化酶在处理烟用天然本草提取物中效果较好,有望得到进一 步 的应用。 关键词:固定化酶,复合二氧化硅,氧化海藻酸钠,烟用香精香料I 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Abstract Tobacco flavor, one of the most important constituents of modern cigarette products, is mainly prepared by two ways:organic synthesis and natural plants extracting. For the existing dispute against the security of the synthesized flavor, much attention has been focused on the extractions from natural plants. Despite active substance with fragrance can be well extracted by traditional extracting technology, it is inevitable that some macromolecules like protein, cellulose, pectin and so on, will be introduced into the resulting extraction at the same time. These macromolecules will strongly affect the taste of cigarette and bring instability to the apparent character of the flavor. At this point, enzymatic degradation of those macromolecules by corresponding enzymes has been applied to improve the quality of those flavors for tobacco use. Since enzyme is a protein in chemical nature, use of free enzyme will introduce a new source of contaminate into the extraction. Herein, immobilized enzyme can solve the problem very well for its superiority over free enzyme. In this work, a series of oxidized alginate gel and a few magnetic composite silica carriers were prepared. The application of these carriers on neutrase immobilization was also assessed. The main contents of this paper are as follows: 1 A series of periodate oxidized alginate gel with different oxidation degree were prepared, and their application on neutrase immobilization was studied. The result shows that the immobilization pH, enzyme loading and the oxidation degree will affect the immobilization to a great extent 2 A few carriers were prepared via simple copolymerization between 3-amino propyltriethoxysilane and tetraethyl orthosilicate on the surface of magnetic iron oxide, which were subsequently crosslinked by glutaraldehyde or branched by methyl acrylateNeutrase immobilized on crosslinked carrier gave the best immobilization efficiency. The optimal conditions were: 0.5% glutaraldehyde: 30mL, crosslinking time: 2h, 15mg neutrase /0.1g carrier; the stirring time: 50 min. The activity of acquired immobilized II 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 neutrase was as high as 2500 U/g carrier3 Yerbadetajo herb extraction was prepared for enzymatic catalysis. The enzymatic degradation was optimized: stirring time: 8h, 3g immobilized neutrase, 6g glucose. And the subsequent Maillard reaction process was done by heating the mixture at 80 ? for 4 hIn sharp contrast to the blank sample, the resulting extraction could improve the aroma quantity,taste and irritancy significantly. GC-MS analysis showed that heterocyclic volatile ingredients increase both in kinds and contentIn conclusion, this immobilized neutrase showed its high efficiency in the enzymatic degradation and might have widespread application in this field Key words: immobilized enzyme, magnetic composite silica, oxidized alginate,cigarette flavor III 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研 究成果。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个 人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体, 均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到,本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 年月日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?”)学位论文作者签名:指导教师签名: 日期: 年月日 日期: 年月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 绪 论 1.1 酶与固定化酶简介 1.1.1 酶及固定化酶定义 酶(Enzyme)是生物体活细胞产生的具有催化活性的蛋白质,是生物催化剂。 自 1926年索姆奈(Sumner)首次从刀豆中制备出脲酶结晶以来,人们开展了各种酶 的分离提纯的研究,制备了各种不同的酶制剂。从 20 世纪 50 年代起,大规模的工 业生产的酶制剂品种愈来愈多,如α-淀粉酶、糖化酶、果胶酶、凝乳酶、乳糖酶、 脂肪酶、各种蛋白酶等已经实用化、商品化。上述酶制剂在食品加工、发酵工业、 制革工业、纺织工业、有机酸及抗生素的合成、医疗卫生、能源开发以及环境 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 [1] 中有着日以广泛的应用。 虽然酶能够催化许多化学反应,但是其在工业应用上有着较多的缺陷。因为酶 的化学本质是蛋白质,其催化性能依赖于其蛋白质的三维空间结构,才能使底物与 蛋白质活性部位之间准确的契合对位,所以容易引起蛋白质变性的诸多因素如温度、 pH、有机溶剂、重金属、表面活性剂等对酶的活性影响较明显;并且,大多数商品 化的酶都是水溶性的酶,这些水溶性酶在催化反应结束后很难回收,因而限制了其 进一步的发展。 20世纪 60年代以后,在酶学研究领域内涌现出固定化酶(Immobilized Enzyme),即将酶束缚在水不溶载体上或将酶束缚在一定的空间内,限制酶分子的 [2] 自由流动,但能使酶充分的发挥催化作用。 1.1.2 酶固定化方法简介 酶固定化的方法大体上有包埋法Entrapment、吸附法Adsorption、交联法 Crosslinking 以及共价法Covalent binding,其中包埋法和吸附法属于物 理法,交联 [3] 法和共价法属于化学法 。各固定化方法的原理、载体、优缺点见表 1-1。 固定化酶的应用目的、应用环境各不相同,而且酶的来源、固定化的载体、 固 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 定化的方法的多样性使其成为酶工程方面最活跃的研究领域之一。 表 1-1 固定化方法与特点 固定化方法 固定化原理 载体 优缺点 1. 无机载体:氧化铝、 皂土、白土、高岭土、 优点:操作简便,条件温 通过氢键、疏水键、离 多孔玻璃等。 和,吸附剂可再生反复使 子交换、π-电子亲和力 吸附法 2. 有机载体:纤维素、 用,酶活力回收率很高。 等物理作用力将酶直接 骨胶原、火棉胶、淀粉 缺点:酶易脱落、吸附过 吸附在载体上。 等。 程有不可预见性。 3. 离子交换树脂 1. 凝胶包埋:聚丙烯酰 优点:载酶量大,操作简 将酶定位于聚合物材料 胺、卡拉胶、藻酸盐等 单,酶活力保持较好。 包埋法 的凝胶结构或微囊结构 2. 微囊包埋:乙基纤维 缺点:底物与酶接 触过程 中。 素、聚苯乙烯、卵磷脂 中造成扩散阻力,不适合 等。 大分子底物。 优点:酶与载体结合牢固 将酶蛋白侧链基团和载 不易脱落 共价法 体上的功能基团通过共 缺点:反应条件剧烈,酶 价键相连接 易失活 表面含有醛基、羟基、 优点:酶与载体结合牢 羧基、氨基、巯基等功 利用双功能基团或多功 固,不易脱落,稳定性较 能基团的载体。 能试剂在酶分子间或酶 高; 交联法 与载体之间进行交联反 缺点:固定化操作较复 应 杂,进行化学修饰时易造 成酶失活。 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1.2 海藻酸钠在酶固定化中的应用 1.2.1 海藻酸钠简介 海藻酸钠Sodium Alginate是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种天然线性 多糖类化合物。如图 1-1 所示,其结构由 α-L-古洛糖醛酸 G-block与其立体异构体 β-D-甘露糖醛酸M ?block通过 α 1-4 糖苷键连接而成的线性嵌段共聚物。图 1-1 海藻酸钠结构及其重复单元简图 2+ 海藻酸钠最大的特点在于其重复单元上的羧基能够与二价金属阳离子如 Ca 、 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Ba 、Sr 等通过静电作用而形成水凝胶。虽然 Cu 、Pb 、Cd 、Co 和 Ni 等金 2+ 2+ 属离子也都能与海藻酸钠键合形成水凝胶,而且 Cu 、Pb 与之形成的凝胶稳定性 2+ 比 Ca 强,但是由于这些金属离子具有一定毒性而限制其应用。因此,海藻酸盐作 2+ 为生物、医药及食品组成材料使用时通常选用 Ca 作为交联剂。此外,海藻酸钠无毒、可降解、生物相容性良好的优点使其在食品、药物、水 处理以及生物等多个方面具有非常广泛的应用。 在食品方面,海藻酸钠是一种良好的食品添加剂,其良好的增稠性、成丝性、 成膜性赋予其在改善食品口感、形态方面独特的作用,在美国海藻酸钠甚至被誉为 “神奇的食品添加剂”,在日本则被称为“长寿食品”。 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 在药物方面,海藻酸钠凝胶主要作为药物缓释制剂而被广泛的应用,药物制剂 也根据不同需要而多种多样,如片剂、胶骨架片、微球、微囊、纳米粒、原位凝胶 等。这些应用都利用海藻酸钠对药物的包封使得其在人体内独特的化学环境中来达 到对药物的保护、药物释放速度的减缓或加快、释药部位的控制、提高药物 生物利 [4] 用度等不同的作用。如 Nnesen等 用海藻酸钠与羟丙基甲基纤维素(HPMC)制成 的胃漂浮控释胶囊可以延长药物在胃中的滞留时间,增大 pH依赖药物的吸收窗;李 [5] 沙等 利用海藻酸钠制备微胶囊包封多肽类药物以防止其在胃中的被胃蛋白酶水解 而失活等等。 在生物方面,由于海藻酸钠凝胶内惰性均相体系、缓和的凝胶形成条件、多孔 性的凝胶表面,良好的生物相容性等诸多优点使其成为各种细菌、活体细胞的最适 载体之一。 1.2.2 海藻酸钠在酶固定化领域中的应用 (1)包埋法 海藻酸钠水凝胶表面的多孔性使得其可以作为包埋大分子酶蛋白的载体,一方 面在一定程度上限制酶蛋白向外部环境的逃逸;另外一方面又可以允许底物进入均 相的内部环境,使得酶与底物在内部微环境中接触完成催化过程。 以物理包埋法固定化酶而言大致分为两大类:一类是以单纯的海藻酸钠凝胶作 为载体直接包封需固定化的酶。此类方法过程简便,对酶的活性影响比较小,但由 于单纯的海藻酸钠凝胶的性质与诸多因素有关:如海藻酸钠的来源和种类、海藻酸 钠的浓度、交联金属离子的浓度等等。因此需要调节上述诸多因素来控制海藻酸钠 [6] 凝胶的表面性质从而抑制简单包埋法中酶的遗漏和流失 。第二类是以海藻酸钠作为 [7] [8] 阴离子模板,与其他表面带正电的聚合物(壳聚糖 、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇 、明 [9] 胶 等)进行逐层自组装 Layer-By-Layer assembly,形成杂化的多层结构。这种依 靠层间静电作用自发形成的杂化结构可以改善凝胶的表面特性,增强凝胶的稳定性。 由此类杂化材料制备的固定化酶不易脱落、遗漏。 [10] [11] [12] [13] 此外,在 MCM-41 碳纳米管 、二氧化硅 、硅纳米管 等无机材料制备的 4 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 固定化酶表面覆盖一层保护膜来减轻由于吸附法带来的酶的脱落也屡见报道。 (2)共价与交联法 ? 戊二醛交联 戊二醛 Glutaraldehyde 普遍被认为是一种毒性较低,效果较好的双功能基团交 联剂,因此其应用也最广泛,也特别适合于表面带有氨基,羟基等载体对酶的固定 化。以戊二醛在交联过程中的作用方式来看,大致有三类。一类是戊二醛先直接或 间接与可溶性酶作用,形成不溶性酶颗粒,再由海藻酸钠凝胶包埋。例如 2006年 Simi [14] 等人 在在高浓度的硫酸铵溶液中得到粒径为 1-2μm 的枯草杆菌蛋白酶晶体,然后 用 4%的戊二醛交联 20分钟左右,制得的交联酶晶体(Crosslinking Enzyme Crystals, CLECs)在诸多极性和非极性有机溶剂中表现出非常高的稳定性,而这种经海藻酸 钠包埋保护后的 CLESs 体系可以应用于高浓度蛋白肽类药物的定向给药和 缓释剂的 开发。第二类则是先由戊二醛对海藻酸钠微球进行交联改性,然后在功能团化的微 [15] 球表面共价固定化酶。例如 Ortega 等在 2009 年 先用戊二醛对海藻酸钙微球进行 交联改性,然后将经过纯化的中性蛋白酶固定在此载体上。通过正交实验优化了酶 固定化的条件,在最佳固定化条件下中性蛋白酶固定化率高达 60%以上;同时在固 定化酶的酶学性能方面,pH和热稳定性也显著提高。第三类在交联反应的次序上与 第二类有一些不同,即先用海藻酸钠凝胶对酶进行物理包埋,再由一定浓度的戊二 醛来交联。由于戊二醛的交联活性较高,其在交联改性的过程中的用量或者交联时间的控 制上显得非常重要:用量太少则能够提供的共价结合点较少,固定化效率较低;用 量过大则可能使载体与酶以及酶分子之间交联程度过高,影响到固定化酶的活性。 因此众多以戊二醛作为交联剂固定化酶的例子中,都对戊二醛的用量或者交联时间 [15, 16] 所带来的影响做了比较详细的考察。 ? 碳化二亚胺活化 碳化二亚胺(EDAC、EDC等)与 N-羟基磺代琥珀酰亚胺(NHSS)是常用的羧 酸基活化剂,首先 EDAC与海藻酸钠结构中大量的羧基形成活化酯继而由 NHS 取代 脱除 EDAC,最后在酸性条件下与酶蛋白氨基残基结合,达到共价固定化的目的。 5 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 其固定化步骤如图 1-2所示。 [17] 2009 年,Tee 等人 用碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和 N-羟基磺代琥珀酰亚胺 (NHSS)对海藻酸钠微球上的羧基进行活化后对 α-淀粉酶进行固定化,得到的固定 化酶具备非常显著的热稳定性。 虽然这种以酰胺键共价连接酶与载体的方式有着明显的优点,例如酶与载体结 合牢固,稳定性大大增强,但由于固定化过程通常需要在酸性较强的体系下进行, 因此会在一定程度上造成酶的失活。 H N H N N O O C N O O NH 2 C Alginate Gel Alginate Gel N O O O S O N HO O O O O S O O N O Alginate Gel O O NH 2 Enzyme H N Enzyme Alginate Gel图 1-2 海藻酸钠凝胶上“活化酯”法固定化酶图示 ? 环氧氯丙烷偶联 环氧氯丙烷也是一种活性较高的双功能基团,其一侧可以与载体上的供电基 团 进行结合,结合后经过环氧环的翻转,另外一侧又可以与酶蛋白上的氨基相 连。环 氧氯丙烷在海藻酸钠的改性和酶的固定化步骤如图 1-3所示: 6 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 O OH HO O O Cl O Alginate Gel Alginate Gel OH O O HO O O O HO Enzyme Enzyme O O OH Enzyme-NH2 Alginate Gel O O Enzyme OH OH Enzyme图 1-3 海藻酸钠凝胶上环氧氯丙烷偶联固定化酶 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E c b a E: Enzyme :环氧氯丙烷 :凝胶网格图 1-4 海藻酸钠凝胶上固定化酪氨酸酶 a.包埋b包埋和交联c 包埋、交联和共价 [18] 2005 年,Yahsi A 等人先用海藻酸钙凝胶对酪氨酸酶进行简单的物理包埋, 然后用环氧氯丙烷对内包酶进行交联以及表面羟基的活化,微球表面环氧基 的引入 又使得微球表面也可以与酶的氨基残基共价结合。如图 1-4所示,即以改性 海藻酸钠 微球为载体,以包埋、交联、共价三种固定化方式对酪氨酸酶进行了三重固 定化。 7 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 [19] 类似的,2010 年 Akkaya A 等人 于紫外照射条件下在海藻酸钠的重复单元上 接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯,同时用碳化二亚胺活化其结构上的羧基,以此含有两 种不同共价结合功能基团制备了一种多酶体系共固定化的的固定化酶。 ? 氧化改性共价固定化 海藻酸钠重复单元中存在邻位二羟基结构,在高碘酸钠作为氧化剂的条件下可 以打断连接邻位二羟基的 C-C 单键,如图 1-4 所示,得到高活性的开链的二醛结构 单元可作为偶联活性蛋白、多肽、特异氨基酸序列等生物活性物质的载体。 图 1-4 海藻酸钠的氧化改性 [20] 2004年,Canh Le-Tien等 将海藻酸钠用高碘酸钠氧化后来作为载体固定化过 氧化氢酶。该研究考察了海藻酸钙微球的粒度、氧化度以及包埋方式等对固定化效 果的影响,同时评价了固定化酶的酶学性质。结果显示,在最佳固定化条件下 过氧 化氢酶的活力回收值高达 98%。 ? 三氯均嗪偶联固定化 OH HO Enzyme HN N O Alginate Gel HO OH NN HO Cl图 1-5 海藻酸钠上三氯均嗪交联固定化酶 如图 1-5 所示,三氯均嗪可作为含氨基、羟基、酯基、亚胺基等载体固定化 交联 试剂。这种交联剂的特点在于氯原子被取代后共轭体系的缺电子程度逐渐减 弱,交 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 联反应活性逐渐降低。因此,对于第一个反应的氯原子而言,活性较高,在低 温、 低 pH 下就可以发生交联反应;第二个反应的氯原子具备中等活性,在 25-40?、弱 碱性条件下发生交联反应;第三个反应的氯原子则活性较低,只在较高温度、强碱 性下发生交联。因此,这种反应次序不同的氯原子的活性差异使得交联反应可控性 [21] 和方向性增强,载体活化和交联能按次序进行 。 1.3 烟用天然香精香料及其酶法制备 1.3.1烟用香精香料简介 (1) 烟用香精香料的发展历史 [22] 1948年 Tilley 报道认为烟草制品的最初加香习惯是源于西班牙海员。大约在 16 世纪,海员们为保持烟叶的香气和新鲜,于是喷洒上甘草水来防腐。也有人认为 应当更早一些,早在哥伦布把烟草引入文明社会之前,南美的土著居民已会把其他 方向植物花、果、叶、茎等和烟叶混在一起咀嚼或燃烧抽吸。总之,人们从偶然的 发现中逐渐人为地、有意识地选择添加一些个人偏爱的香味物质,来增强吸 烟所带 来嗅觉上的满足感,从而逐渐的演变成今日的烟用香精香料。随着烟草的传播和发 展,添加香精香料已成为烟草制品的特有加工工艺。(2)烟用香精香料在烟草制品中的作用 烟用香精是随着烟草的广泛传播以及使用而应运而生的,是专供烟草制品增添 烟、改进吸味的烟草调味剂。烟用香精与烟草制品之间可以说有着唇齿相依的关系。 加香的目的一是掩盖杂气,减轻烟气刺激性,使烟味柔和,并改善余味。二是消除 不同等级烟叶之间的差异并使之互相协调。三也可以产生非常特殊的非烟草香气和 香味,使烟香丰满。四则赋予烟草制品优美舒适的嗅香,增强人们的吸烟欲望。 (3)烟用香精香料起作用的原理 [23] 据报道 ,烟用香料可以通过以下多种途径起作用。?卷烟在燃吸过程中,发 生热裂解反应,裂解的产物又发生一系列的连锁反应,以致产生对吃味和香气方面 的传递影响,如还原糖类物质在烟草加香中的应用。?形成香气中间体,例如白肋 9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 烟在烘烤以施加糖汁和氨基酸可以在其燃烧过程中产生诸多杂环类的致香物质。? 燃吸期间由于高温引起的自身的部分变态而产生香气。?基本形态不改变,仅依靠 蒸馏作用由主流烟气带出滤嘴,如滤嘴中的薄荷丝线。从烟用香料起作用的原理来 看,其中一类被称作潜香物质,即在卷烟燃烧过程中发生了裂解、氧化、环化、取 代等化学反应而产生香气;另一类被称作表香型香料,即依靠其较高的挥发性而将 香气带入烟气中。 (4)烟草及其添加剂中部分成份对烟草吃味的影响 [24] 表 1-2 烟草中主要成份对烟草吃味的影响 物质类别 在烟草中的作用 还原糖可单独热解形成多种香气物质如呋喃衍生物、简单的酮类和醛 类、酸类等羰基化合物; 还原糖类 含糖量过高,烟气酸性增强,也易引起“压香”现象,对烟草吸味带 来不利的影响。 影响香烟燃烧速度和燃烧完全性; 淀粉 产生糊焦气味,影响香气。 果胶质 增加烟气刺激性,青杂气变重,吸味变辛辣,烟香不透发 蛋白质 增加烟气苦味,引入杂气,并带来一定的刺激性。 燃烧过程中氨基酸可与还原糖生成吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环 化合物,改善香气; 氨基酸 含量过高则形成具有刺激性的含氮化合物,对烟气香气和吸味产生不 良影响, 个别氨基酸还产生 HCN等危害健康的烟气成分。 有机酸 可使烟草吸味变的醇和、饱满,并增加烟气的浓度,降低刺激性。 酚类物质在烟草燃吸时产生酸性反应,中和烟气,使吃味醇和; 酚类 燃烧时由于干馏、氧化、裂解的作用产生各种芳香成份。 酯类普遍具备芳香气味,分子量较大的甲酯、乙酯可以增加卷烟香气; 酯类 低分子量的酯类具有洋酒、水果的香味,有抑制刺激性的效果。 10 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 由于烟草成分及其燃烧反应极为复杂,烟用香精香料的评价方式主要靠感官 评 吸进行,多年来许多专业的烟草评吸研究者考察了不同类的物质在烟草中的 作用, 表 1-2 列举了一些烟草及其添加剂的成分对烟草吸味的影响。一般而言,淀粉、蛋白 质、果胶等大分子物质被普遍认为会对烟草吸味带来负面影响,而有针对性地添加 一些具备香味的物质则能够丰富和改善烟草的香气,但其用量也必须适当,否则也 会带来负面的效果。 1.3.2酶法制备烟用香精香料 酶法制备烟用香精香料相关的文献,基本可以分为两个大的方面,一是利用酶 独特的催化作用由相关的化学底物在适当条件下合成所需要的香料,这种酶促合成 相比于纯粹的有机合成而言在反应条件、专一性、安全性以及香精品质上有着比较 明显的优势,甚至某些特例中可以得到价值较高的接近光学纯的香精香料。第二个 方面则是先由传统的提取、压榨、蒸馏等方法制备含有底物的香精香料,再通过酶 的参与达到对提取物酶解的作用,得到提取物中所没有的致香物质。 (1) 酯类烟用香精香料的合成和手性拆分 脂肪酶 Lipase,甘油三酯水解酶,EC3.1.1.3 是一类能够催化天然油脂水解 生 成脂肪酸、甘油以及甘油单酯或二酯的酶。研究表明,脂肪酶可以在多种体系中催 化酯的水解、酯合成、内酯合成、酯交换等反应,并且由于这些反应一般都有着高 度的选择性、温和的反应条件、产物纯度高等优点,其在烟用香精香料品质的提高 [25] 和手性香精香料的制备等方面有着广阔的应用前景 。 [26] 以酯类的酶促合成而言,Gubicza等 在正己烷中以 Novozyme-435 催化合成了 [27] 多种具有新鲜水果气息的小分子芳香酯类,产率普遍高达 90%;Redmann 等人 同 样以 Novozyme-435为催化剂在葡萄糖的 6位高选择性的合成了脂肪酸葡萄糖酯,这 类葡萄糖酯的热裂解产物多为醛、酮、酸、酯类小分子挥发性香味化合物,能够显 [28] 著的增加卷烟的香气量; Yamane 等 用脂肪酶催化多种羟基酸成功地合成了包括环 十五内酯在内的许多可以作为烟草加香香味前驱体的大环内酯。 [29] 在手性香精方面,2003年 Brenna 等人比较详尽的综述了常见手性香精单体与 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 其对映体在香气质量、类别以及强度上的差别。尽管至今还没有一个理论给予解释, 但手性的香精香料的拆分特别是脂肪酶促的醇、酯类的拆分却发展迅速,为高价值 的烟用手性单体香精香料的制备提供了途径。表 1-3为几种经典的手性对映体香精在 香气上的差别。表 1-3 几种手性对映体在香气上的差别 香精名称 香气描述 +: 百合花香,略带薄荷味 7-羟基-6,7-二氢香茅醇 ?: 百合花香,略带甜味 +: 略带甜味的苦橙叶味 芳樟醇 ?: 带木质气的薰衣草味 +: 香菜和叶蒿的味道 香芹酮 ?: 荷兰薄荷味 +: 青涩,吖啶味 橙花醇氧化物 ?: 青涩,辛辣,天竺葵气息 ?: 清新透发的薄荷香气 薄荷醇 +: 尖刺木质气 以脂肪酶促薄荷醇和薄荷酯的动力学拆分(Kinetic Resolution)为例,2002 年 [30] Sandra 等人以外消旋的安息香酸薄荷醇酯作为起始物,用重组假丝酵母脂肪酶进 行酶促拆分,在最佳条件下能以 45%的转化率接近 100%的 ee%得到 L--薄荷醇, [31] 同时在其他薄荷酯作为底物的条件下也得到较好拆分效果。Wang 等 在 2002 年比 较系统的研究了脂肪酶来源、固定化载体、载体含水量、酰基供体等因素对外消旋 的薄荷醇拆分效果的影响,研究显示以离子吸附法固定在 DEAE-Sephadex A-25 上的 假丝酵母脂肪酶在载体含水量为 48%、有机相为环己烷、癸酸等长链脂肪酸 为酰基 供体的条件下能够以 44%左右的转化率 95%左右的 ee%得到 L--薄荷醇。总之, 无论是以外消旋的酯的水解途径还是醇的酯化途径,在一定条件下通过特定脂肪酶 12 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 的催化都可以得到光学纯度较高的手性香精单体。 (2) 烟用香兰素类香精的酶促合成 香兰素(Vanillin,4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)具有浓郁的奶香及香荚兰气息,是 当今食品、化妆品、烟草调香中最重要的香料之一,因此被称为“香料皇后” 。香兰 素的酶促合成主要依靠脂肪氧合酶、氨氧合酶、香草醇氧化酶催化氧化相关的底物, 如与香兰素结构比较类似的异丁香酚、丁香酚等还原性物质。由于这类酶尚未商品 化,需要从相关的微生物中提取获得,因此其发展受到一定的限制。表 1-4为相关酶 促合成香兰素的实例。 表 1-4 酶促合成香兰素实例 酶 底物 转化结果 [32] 脂肪氧合酶(Lipoxygenase) 丁香酚、异丁香酚或松柏醇 香兰素浓度可达到 2.85g/L 香兰素的质量分数可达 30%和 脂肪酶(Chirazyme L-2,c-f)[33] 异丁香酚和松柏醛 81% 香草醇氧化酶(VAO, Vanillyl 150 μm底物可以得到 80%的转 木焦油醇或者香草胺 [34] Alcohol Oxidase) 化率 在 2.7 μg/mL 氨氧化酶的条件 [35] 氨氧化酶 AO 香草胺 下 1mM 香草胺在 30 分钟之内 完全氧化成香兰素 (3)酶促降解 β-胡萝卜素制备烟用香精香料 β-胡萝卜素( β-carotene)是以异戊二烯残基为单元组成的一种色素,含有较多 的共轭双键,属萜类化合物。它经氧化降解后可生成许多分子量较小的香味物质, 如大马酮、紫罗兰酮、异佛尔酮、二氢猕猴桃内酯等,是烟草中香味物质来源的重 [36] 要前体之一 。因此 β-胡萝卜素的降解反应是非常重要的香气物质生成途径。其降 解方式也有多种,如高温氧化裂解、热裂解、化学氧化、光氧化等,这些途径一般 条件剧烈或者需要氧化剂抑或光敏剂的加入,比较而言经酶催化的降解途径具有比 [37] 较明显的优势。早在 1936年,Tischer 就研究报道了酶法氧化降解 β-胡萝卜素的反 13 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 应,成功地获得广泛存在于各种新鲜花类中的重要致香组分? β-紫罗兰酮。因为 β- 胡萝卜素不溶于水而溶于有机溶剂,因此起氧化作用的脂肪氧合酶或者黄嘌呤氧化 [38] 酶不能很好的与底物相接触,为了解决这一问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,Wache 等人在 2006 年采用两种 途径解决底物与酶的接触问题,一种途径是脂肪氧化酶催化 β-胡萝卜素与亚油酸的 协同氧化反应;另外一种则是 β-胡萝卜素在氯仿和水的乳化体系中完成酶促降解反 应。结果表明 β-胡萝卜素的降解程度达到 80%以上,产生的挥发性成份质量分数达 3%。 (4) 酶处理烟用天然来源的香精香料 天然本草植物中的很多成份可以作为相关酶催化酶解的底物,如糖苷、蛋白质、 纤维素、果胶等。通过单酶或者多酶体系对这些物质的酶解处理可以产生独特的风 味物质,同时也能够改善烟用香精香料的品质。 作为烟草加香重要香气前驱体的黄酮类及其他致香物质通常以糖苷的形式存在 于大量花类、果汁类烟用香料中,而这些糖苷类物质通常自身没有香气,但通过糖 [39] 苷酶对其水解后可以释放与配糖体连接的苷元从而起到增香的作用。例如姜欣 等 对香草兰进行提取工艺优化后制备了香草兰浸膏,然后采用 β-葡萄糖苷酶对浸膏中 以葡萄糖苷形式存在的香兰素进行酶解,酶解后游离香兰素的含量与空白对比提高 [40] 了 4倍;类似的,Reuveni 等人采用 β-葡萄糖苷酶对水仙花提取物中的多 种葡萄糖 苷的水解,水解后的提取物采用一种顶空闻香装置对香气的强度、类别进行了比较, [41] 结果显示经处理后的提取物香气强度、持久度有了非常明显的改善。郑美瑜等 研 究了橙皮苷酶和柚皮苷酶 2 种糖苷酶对柑橘汁和葡萄柚汁的水解效果,研究显示橙 皮苷降解率达 50%,而柚皮苷几乎完全降解。 [42] 在天然植物中的大分子的降解方面,赵谋明 用不同来源的蛋白酶对低次烟叶 提取物中的活性肽及蛋白质进行有效地水解并通过外源糖的加入产生后续的 Maillard 致香反应,通过这种方式制备的烟用香精评吸分数高达 96 分;阮祥稳等人 [43] 采用果胶酶对极为重要的烟草加料原料??大枣提取物进行酶解处理,开发了一 种香型风格独特的烟用香料,其中通过正交实验优化酶解工艺后的产酯量可达 [44] 5.63mg/mL;徐若飞等人 采用纤维素酶和蛋白酶分别对天然菌类香菇提取物中的可 14 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 溶性蛋白质和多糖进行二次水解, GC-MS成份分析表明提取物中致香成份增加了 27 种,所得香料使卷烟有特殊香韵并能提高烟气舒适度。 综上所述,天然本草植物和酶的多样性为新型天然烟用香精香料的制备提供了 非常广阔的前景。 1.4 主要研究内容本文首先制备了若干载体,研究了这些载体上中性蛋白酶的固定化效果,并考 察了固定化中性蛋白酶用于处理墨旱莲提取物的工艺。论文主要内容如下: (1) 氧化改性海藻酸钠的制备及对中性蛋白酶的固定化; (2) 磁性复合二氧化硅材料的制备及其对中性蛋白酶的固定化; (3) 固定化酶处理墨旱莲提取物制备特色烟用香精香料。 15 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 实验部分 2.1 主要实验试剂和实验仪器 2.1.1主要实验试剂 表 2-1 主要实验试剂 实验药品 规 格 产 地 海藻酸钠(ALG) CP 青岛明月海藻集团有限公司 氯化钙 AR 国药集团化学试剂有限公司 高碘酸钠 AR 国药集团化学试剂有限公司 可溶性淀粉 CP 国药集团化学试剂有限公司 碘化钾 AR 中国医药(集团)上海化学试剂公司 酪氨酸 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 干酪素 CP 上海伯奥生物科技有限公司 中性蛋白酶 生化试剂 武汉华顺生物技术有限公司 三氯乙酸 AR 国药集团化学试剂有限公司 丙烯酸甲酯MA) AR 国药集团化学试剂有限公司 3-氨丙基三乙氧基硅烷 CP J&K CHMICAL LTD正硅酸乙酯 CP J&K CHMICAL LTD氯化铁 CP 上海新宝化工厂 氯化亚铁 CP 上海新宝化工厂 乙酸乙酯 AR 国药集团化学试剂有限公司 二氯甲烷 AR 国药集团化学有限试剂公司 水合茚三酮 生化试剂 上海锐谷生物科技有限公司 无水硫酸钠 AR 国药集团化学有限试剂公司 16 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.1.2主要实验仪器 表 2-2 主要实验仪器 仪器名称 型号 产地 紫外可见分光光度计 BLUE-STAR 北京莱伯泰科学仪器有限公司 磁力搅拌器 85-2 上海司乐仪器有限公司 数显恒温水浴锅 HH-6 常州澳华仪器有限公司 超声波清洗器 SK310HC 上海汉克科学仪器有限公司 数显水浴恒温振荡器 CHA-S 常州国华企业电器有限公司 高速台式离心机 3K15 美国 Sigma 公司 红外光谱仪 Equinox 55 德国 Bruker 公司 天平 CP224S 德国 Sartorius 公司 精密增力电动搅拌器 JJ-1 常州澳华仪器有限公司 精密 pH 计 Delta320 梅特勒-托利仪器(上海)有限公司 旋转蒸发器 LR-4010 德国海道夫公司 真空干燥箱 ZK-1 上海锦翌科学仪器有限公司 GC-MS 气质联用仪 6890-5973 美国安捷伦科技有限公司 2.2 氧化改性海藻酸钠载体的制备 2.2.1海藻酸钠微球的制备 用带 6#针头的医用注射器准确吸取 10 g 2%(w%)海藻酸钠溶液,缓慢滴入 3% (w%)氯化钙溶液中,滴毕,熟化 30 min,蒸馏水洗 3 次并渗析过夜,过滤得 原始海藻酸钠微球,每 10 g海藻酸钠溶液制备的原始微球作为一个实验样。 2.2.2氧化度的定义和测定 氧化度定义为被氧化的糖醛酸单元占总海藻酸钠糖醛酸单元的摩尔百分数。 17 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 将 0.5mL 的淀粉指示剂与等体积氧化后的海藻酸钠凝胶上清液反应,上清液中未消 耗的高碘酸钠与碘化钠发生氧化-还原反应,释放出的碘与淀粉发生显色反应而呈红 [45] 棕色,在 480 nm处测定其吸光度 。通过 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线确定剩余高碘酸钠的量,差减法 得到高碘酸钠消耗量,从而得到海藻酸钠的氧化度,具体计算 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 如下:M × N 氧化度(%) ×100% m0 其中 N为高碘酸钠的消耗量,m 为改性前海藻酸钠的质量,M 为海藻酸钠重复 0 单元相对分子质量。 2.2.3氧化度曲线的测定和氧化改性微球的制备 取微球实验样若干份,尽量吸干表面水份,各置于 50mL 烧杯中,分别加入不 等量的高碘酸钠溶液,用蒸馏水稀释至 10mL,在冰箱中避光氧化 24 h 后分析残余 高碘酸钠浓度,进而得到相应的氧化度-氧化剂用量曲线。根据所得曲线,选 择合适 的氧化剂用量,可得所需氧化度微球。 2.3 氧化改性海藻酸钠上中性蛋白酶的固定化研究 2.3.1酶活的定义与测定 [46] 游离酶和固定化酶的活力由 Lowry法测定 ,即以 1mL 2%(w%)的酪蛋白溶 液作为水解底物,加入 1mL一定浓度的溶液酶, 40?C下保温酶解 10分钟,加入 2mL 0.5 mol/L的三氯乙酸终止水解反应,迅速过滤,取 1mL滤液加入 5mL 0.5 mol/L 碳 酸钠溶液碱化,再加入 1mL稀释过三倍的福林试剂 40?C下保温 20分钟显色, 660nm 下测定吸光度,由酪氨酸与福林试剂显色的标准曲线确定由水解产生的酪氨酸的浓 度。 一个单位的蛋白酶活力定义为 40?C下每分钟水解酪蛋白产生相当于 1μg酪氨 酸,即为 1 U。空白对照仅仅在加入酪蛋白之前用三氯乙酸淬灭酶的活力。 固定化酶活力测定时,由于载体有一定体积,所以等量扩大酪蛋白的用量及其 18 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 他试剂的用量,从而得以完全浸没载体,后续分析步骤不变。 2.3.2固定化酶活力指标加入总酶量-未固定化的酶量 固定化率 ×100% 加入总酶量 固相酶总活力 相对活力 ×100% 加入总酶活力-上清液未偶联酶总活力 固相酶总活力 活力回收 ×100% 加入总酶活力 其中固定化率主要表征酶蛋白与载体的共价结合程度;相对活力主要表征酶经 共价固定化后的活力保持程度;活力回收则表征酶活力的固定化效率。 2.3.3固定化酶的制备 准确称取一定量的中性蛋白酶,加入盛有改性微球样的烧杯中,再加入不同 pH 值的缓冲液定容至 20mL,室温下磁力搅拌 2小时。用滤网过滤,分离载体和滤液, 分析滤液中总酶活、酶蛋白浓度以及固定化酶的总酶活力。 2.3.4酶蛋白的定量 [47] 酶蛋白的定量由 Bradford 法测定 ,即考马斯亮蓝法。根据考马斯亮蓝 G-250 在与蛋白质结合时其λ 由 465nm变为 595nm, 首先配制一系列的标准酶蛋白溶液, 绘制标准吸收曲线,再取上清液中未固定化的酶液与 Bradford试剂显色后 595nm下 测定吸光度,依据标准曲线来确定上清液中的酶蛋白浓度。从而由加入总酶量减去 未固定化酶总含量即可得到固定到载体上的酶蛋白含量。 19 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.4 磁性复合二氧化硅载体的制备和表征 2.4.1磁性复合二氧化硅载体的制备 (1)磁性 Fe3O 纳米粒子的制备 4 [48] 参照文献 ,于 2000 mL三颈瓶中加入 500 mL