反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究

反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究 miRNA 反义寡核苷酸介导的 沉默研究 1 2 3 3，，，夏 新张小敏宋鹏飞王爽 ( 1, 重庆大学生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院基因工程研究中心，重庆 400030; 2, 西南医院感染科，重庆 400030; 3, 深圳华大基因研究院，广东深圳 518083) 22 ，、。miRNA RNA，摘要 是一类内源性的具有调控功能的非编码 长度约为 个核苷酸参与多种生理过程及多种疾病的发生发展过程 miRNA miRNA ，。miRNA 沉默技术是研究 生物学功能的重要工具也为以 为靶点的疾病诊断和治疗提供可能多种化学修饰的反义寡核 miRNA 。苷酸和相应的提呈系统被用于 的研究 miRNA ; ; 关键词 沉默反义寡核苷酸化学修饰 中图分类号 S 132文献标识码 A文章编号 0517 ) 6611( 2011) 24) 14545) 03 Study of miRNA Sencng edated by Antsense OgonuceotdeiliMiilili Xin et al ( Genetc Engneeng Research CenteBo-engneeng CoegeChongqng UnvestyChongqng 400030)XIA iirir，iirill，iiri，iAbstract MicroRNAs ( miRNAs) were noncoding RNAs approximately 22 nucleotides in length that played a key role in the regulation of im- portant boogca processes，ncudng ceuar deveopment，dfferentaton，and apoptoss, miRNA sencng wasn' t ony an mportant tooililililllliiiiililil used forr esearching biological function of miRNA，but also enable the diagnosises and treatmentsta rgeting for miRNA, A variety of chemically modified antisense oligonucleotides and thec orresponding proposed system had been used fmiRNor A research, Key words miRNA silencing; Antisense oligonucleotides; Chemical modification miRNA RNA，miRNA，，是一类内源性的具有调控功能的非编码 都可以达个步骤使细胞内部不能持续地产生成熟 22 ，miRNA 。，pri- 长度约 个核苷酸能通过非完全的碱基配对与靶基因 到沉默 的目的过去的研究中包括细胞核内的 mRNA 3mRNA ’分子的 非翻译区相结合来降解 或抑制miRNA，pre-miRNA Drosha 对 发夹结构以及 酶等多个靶点都 ,1 ) 2,。miRNA ，，。，其翻 译参与生物体内多种重要的生理过程并进行过抑制的尝试但是效果都不理想研究表明只有在 ,3,、。miRNA RISC ， 且与 多种疾病的发生发展有重要关系的成熟阶段 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 反义分子在 虽然很多 内封闭它的功能miRNA ，miRNA 。已 经得到鉴定但只有较少部分的功能被明确阐述才能对 进行有效的沉默该种策略已被广泛地研究 ,4,。， miRNA miRNA 目前鉴定 的功能及其靶基因是 研究的。和使用 。热点内容 miRNA ( miRNA silencing) 沉默是把人工合成的寡核苷 2技术关键 ，miRNA ，酸小分子提呈到细胞内与内源性 形成异源双链使 2, 1 分子改造 miRNA ，降低对靶基因的抑制作用以实现对基因功能的调 2, 1, 1 Antagomir。11 miRNA 最早的研究者把 个与 互补的。( Antisense oligonucleotides，ASO) 控反义寡核苷酸技术被 DNA ，。寡核苷酸注射到果蝇胚胎后观察到许多发育性缺陷miRNA ，miRNA ASO 引入到 的功能研究中并为这种沉默 的 ,7,miRNA ，这表明反义的寡核苷酸抑制了 的活性同时普通 ,5,MO( Anti-miRNA oligonucleotides) 。，A重新命名为 目前这 ,8,miRNA 。的寡核苷酸不能充分地抑制 活性这被认为是由 miRNA ， 种技术被认为是 功能研究中最为行之有效的方法miRNA 。，于寡核苷酸与 之前的亲和力低造成的所以针对 。miRNA 也是最常用的方法笔者就反义寡核苷酸介导的 沉 ( AMO) ，2 : 寡核苷酸分子的研究主要体现在 个方面?增加 、。默的原理技术关键和作用评价等作一综述 AMO ; 。 miRNA 与 的亲和力?延长这些分子在细胞内的时间 ，AMO 2 : 目前分子最有效的修饰是在 个位置?核苷酸的核 1原理,9,2 ( 2-MOE) ; AMO ’糖 位碳的羟基上进行化学修饰?miRNA ，miRNA。在 中具有调节基因活性的是成熟的 ，( 2’-OME) 。分子 核酸骨架的修饰主要是磷硫酰修饰,10, miRNA RNA ，的成熟是 转录后一系列的加工过程可分为如，，AMO 。通常两者 一同运用增加 的功效 : miRNA DNA RNA pri-miR- 的基因 经 多聚酶?转录为 下阶段2-MOE 。RNA ’是最常用的化学修饰分子它是以 NA( Primary miRNA) ; Drosha 核糖核酸酶? 在核内识别发夹 ，2 。为骨 架甲基取代核苷酸核糖 位碳羟基上的氢类似pr-mRNA，70 ii并裂解 产 生 约 个核苷酸的具有 发 夹 结 构 ，2- OME ，’地分子以甲氧乙基取代但是在化学合成上比( Hairpin structure) pre-miRNA; pre-miRNA 的对 对 在转运蛋 。 RNA ，前者麻烦这些基团增加了 对核酸酶的裂解作用也exportin-5 ，Dicer ( 白 的作用下转运到细胞浆中在 酶双链 ,9,miRNA 。2-MOE ，’增加了它对 于 的亲和力与 相比RNA RNA ) ，pre-miRNA 专一的 内切酶的作用下被剪切为约 2’-OME miR- NA ，对于 的沉默作用更大在细胞内更稳22 miRNA; miRNA，个核苷酸的双链 双链中有一条就是成熟 。定 ，，miRNA Argonaute 随后双螺旋解链成熟 与 家族蛋白结合 2 -MOE ，Krutzfeldt ’在 的 基 础 上等利用磷硫酰RISC ( RNA-induced silencing complex) ，RISC 形成 复合体复 AMO AMO，，修饰 分子的骨架制造了一个新的 命名为 ,6,mRNA mRNA 。，合体与 相互作用改变 的表达 antagomir。 AMO miR-122 ，这个 是用来沉默 的称为 ，miRNA ，理论上在 成熟的过程中只要抑制其中任何一 ,11,antagomir-122。 Antagomir 3 : 主要在 个方面做了修饰? RNA 2 1 骨架的每个核 苷酸都在呋喃糖的 位碳羟基上连接 ; ; 3’个甲基?核苷酸两 端都被磷硫酰修饰?在核酸的 。，2 端连上一个功能性的胆 固醇基团其中前 个修饰大大提( 1984 ) ，) ，，，:作者简介 夏新男黑龙江鹤岗 人硕 士 研 究 生研 究 方 向 高了它对于核酸酶的耐 ，E-mail: xiaxin_841101@ yahoo, cn。生物化学与分子生物学 收稿日期2011-05-19 ( Cell-penetrating peptide) PNA，，。性增长了这些分子在细胞内的半衰期的 在靶向连接细胞穿透肽 mR-122 mRNA。mRNA Martn ，PNA ii。i是一个肝脏特异性表达的 它被证明 中有很高的效率等研究表明的寡聚物 ,10,miRNA ，PNA miRNA 。能够有效地封闭 的活性并且 在与 的亲 与血浆内的胆固醇和脂质代谢密切相关向正常小鼠注 antagomir-122 ，miR-122 。射 后的表达水平会明显地降低相 、miRNA 2’-OME 和力活性沉默方面要比 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的 有效，miR-122 mRNA ,20,反肝脏中 预测的靶基因的 表达水平则上升 。 ，，PNA ,11,随后对人和大鼠的细胞系研究表明把 与细胞穿透肽6, 8 。，Krutzfeldt antagomirs 了 倍同时发现系统运用 技术 R6-penetratin ，4 ，连接仅仅是连接 个赖氨酸残基同样可以达 ，11 、、、、、、 后在 个组织和器官包括肝脏肾脏心脏肠肺脂肪miRNA ，。到 抑制的效果没有必要进行转染或者电穿孔 、、、，miR- 皮肤骨髓肌肉卵巢和肾上腺中可明显地降低其他 NA ( mR-16，mR-192 mR-194) ，iii 的表达和 但在大脑中没有 2, 2miRNA 提呈系统 已被证实参与和调控包括时序发 miRNA 。发现 的变化 、、、、、育细胞凋亡脂肪代谢神经元发育细胞分化激素分泌等,21,。，miRNA 、多种生理过程同时在包括神经类疾病肌肉功 、、、能紊乱病毒感染心血管疾病癌症的起始与发展等疾病中 2, 1, 2 ( Locked nculeic acid LNA) 。锁核酸锁核酸是一种特,22,。，有明显地表达谱的变化在不同的疾病中有多个特异 。殊的双环状寡核苷酸衍生物核苷酸中有一个亚甲基桥连miRNA 。，的 表达异常明显的上调或下调所以作为一种天 2 4 。接核糖的 位氧和 位碳这个桥形成一个锁定的内部构 ，miRNA 22 bp 然的反义调节分子这种只有 的小分子在基因 ，，像降低核糖构象的可塑性增强磷酸盐骨架局部结构的稳 。,12, 治疗和药物开发方面展现出极具吸引力的前景用于沉默 。定性miRNA AMO miRNA ，miRNA 的 与各种 模拟物一样分别在 。Orom， 所有新分子的研究都是从体外到体内的过程。的上调和下调的疾病中具有极大的开发潜力与将这些分 U, A ，LNA AMO 通过转染用基于 修饰的 在人的异源胚肾细 ，子通过转染或者电穿孔导入细胞的体外试验不同在体内试 HEK293 KC167 miRNA，胞系 和果蝇细胞 中特异地抑制了 并 验中如何将分子特异性地送达治疗器官或组织是一个关键 WesternB lot miRNA 且通过 检测到 已知靶基因蛋白水平的 。技术 ,13,。，Elmen miR-122 ，上升随后以靶基因已知的 为模型在 ,23,，RNAi 。miR- 在过去的几年里已经被用来基因治疗，LNA miR-122 小鼠上进行了体内试验设计基于 的沉默 分 NA RNA ( siRNA) ，从化学角度上讲与小干扰 相同所以用 ,14,，。，子发现小鼠血清的胆固醇水平明显地下降随后他们 RNAi miRNA 基因治疗的提呈方法从理论上讲在 体内试验 ，。以非洲绿猴为试验动物将这个研究拓展到非人灵长类通 。miRNA siRNA 中可以用来提呈治疗分子胆固醇偶联的 和 LNA ，过给非洲绿猴静脉注射 分子后在细胞浆中检测到 ，。Wolfrum 可以被提呈到体内的细胞内引起基因沉默等研 LNA miRNA ，miR-与 的异源双链的形成与之伴随的是成熟 ,24,，siRNA ，。究表明能够偶联亲脂性分子提高提呈效率高 122 。的清除和剂量依赖的血浆胆固醇的降低这种血浆胆固 ( High-density lipoprotein，HDL) siRNA 密度脂蛋白把 提呈到 ,15,，醇的下降表现为长期性和不可逆转性并且没有发现任 、、，( Low-density 肝脏肠肾和生成类固醇的器官低密度脂蛋白。AMO，LNA miRNA 何副作用相对于其他 与 具有前所未有 ,25,lipoprotein，LDL) siRNA 。miRNA 提呈 到肝脏通过在 上 ，。LNA 的亲和力并且具有良好的错配识别能力的毒性较 ，连接特异性的抗体或其他组织特异性的归巢信号可将特异 ,16,，，低在细胞和体内的代谢稳定性也较高因此它在药物开 miRNA ，。，性 提呈到单一的组织甚至特异的细胞内因此这 。发上表现出良好的开发潜力和应用前景 miRNA 。些分子提供可能的将 提呈到某些组织的潜在机制 2, 1, 3 Morpholino 。Morpholino 寡核苷酸寡核苷酸是一种人 ，、在体内和体外试验中腺病毒慢病毒等已经广泛用作 DNA 。工合成的以吗啉环作为骨架的 类似物作为反义抑制 siRNA shRNA ，siRNA / shRNA 提呈 或 的载体把 提呈到细胞 ，分子常用在斑马鱼胚胎发育生物学研究中来研究基因功 ,17,。LNA antagomir miRNA 能和 对于 的活性敲除是靶向成 miRNA 。，，LNA 熟 的寡核苷酸但是在有些体内试验中和 antagomir 。miRNA 需要的用量特别大在斑马鱼发育的 研究 ,26, ，，Morpholino 。中对于胚胎的毒性也特别大此时需要 寡核苷 内并且稳定地整合到靶基因组中进行基因功能的研究 miRNA。Morpholino miRNA 酸来沉默 寡核苷酸靶向未成熟 Krutzfeldt miR-122 antagomirs 把 和 插入到腺病毒的基因组 ( Nucleolytic processing sites) ，miR- 的溶核加工位点能够抑制 ，miRNA 中通过直接的静脉注射把它转入到细胞内研究 功 NA 。miRNA Morpholino 的成熟靶向初级 成套的不重叠的 antogomir miRNA 。，能和 引起的 沉默最近有报道称通过慢 ，; miRNA 2 寡核苷酸可用于特异控制如果靶向同一个 的 个 ,27, antagomir 。病毒介导 持续表达诱导功能缺失的稳定表型，不重叠的寡核苷酸引发的表型相同那么就能说明表型是由 ,18, ，。不过这种方法的有效性和安全性还需进一步试验验证miRNA ，。于靶 的活性被敲除引起的而非脱靶效应 3 作用评价 2, 1, 4 ( PNA，Peptide nucleic acid) 。肽核酸肽核酸是一种 ，miRNA miRNA 试验中即使 的拷贝水平可以准确反映 DNA ，2 ) 类似物即以中性的肽链酰胺 氨基乙基甘氨酸键取 ，miRNA 。活性定量 沉默程度也是一个挑战由于大多的 miRNA ，mRNA 的靶基因是未知的所以以靶基因的 水平来 。，定量检测困难较大在体外试验中常用的可靠和敏感的技 ,28,。术包括利用荧光素酶和绿色荧光蛋白等 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因相对 ,7,BOUTLA ADELDAS C，TABLER M, Deveopmenta defectsb y ant-，IKIlli 4 特异性评价sense-mediated inactivation of micro-RNAs 2 and1 3 in Drosopha and the ilmiRNA ，许多 都是具有共同种子序列的家族差别在种 identification of putative targetg enes,J,, Nucleic Acids Res，2003，31:4973 。子序列外的核苷酸有一个或多个变化只有这些相关的 ) 4980,miRNA 。miRNA 被认为是调节相似的靶基因只有这些 是共 ,8,HUTVAGNER G，MARTIN J S，CRAIG C M，et al, Sequence-specific inhi- bition of small RNA function,J,, PLOS Biol，2004，2:465 ) 475, ，miRNA 表达的需要沉默 家族的所有成员才能实现表型的 ,9, WEILER J，HUNZKER J，HALL J, Anti-miRNA oligonucleotides ( A- I,29, 。，。，变化因此特异性评价是十分重要的研究表明当 MOs):ammunition to target imRNAs implicated in human idseaseAMO miRNA ，AMO 。与 有一个错配时分子活性明显下降如 ,J,,G ene The，r2006，13:496 ) 502, ,10,ESAU CDAS SMURRA S F，et a, mR-122 reguaton of lipid me- ，VI，Ylili3 ，。，AMO 果有 个错配那么就完全失去活性所以需要多个 tabolism revealed by in vivo antisense targeting,J,, Cell Metab，2006，3: miRNA 。，antagomirs 来抑制整个 家族在试验中需要很高的 87 ) 98,，。，AMO 靶特异性一个突变就会导致下调的损失所以提高 ,11,JAN K，NKOLAUS R，RAVI B，et al, Silencing of microRNAs n vvo withIii ，antagomirs,J,, Nature，2005，438:685 ) 689,‘’分子的特异性对于最小化脱靶效应和特异地区分不同的 ,12,GRUNWELLER A，HARTMANN R K, Lockedn ucleic acid oligonucleoti- miRNA 。功能是很重要的一个磷硫酰骨架修饰的反义寡核 des:the nexgt eneration of antisense agents,J,, Biodrugs，2007，21:235 ) ，，苷酸可以通过结合细胞内的蛋白产生调节作用而不是通 243,,28,。，miRNA ， 过反义作用所以在试验设计研究 功能的时候,13,OROM U A，KAUPPNEN S，LUND A H, LNA-modified oligonucleotides I mediate specific inhibition of microRNA function ,J,, Gene，2006，372: 。需要设置一个乱序的或者错配的对照 137 ) 141, ,14,ELMEN J，ASLI S，MADS B，et al, Antagomism of microRNA-122 in mice by systemcay admnstered LNA-antimiR eads to up-reguaton of a illiillilarge set ofp redicted target mRNAs in th liver,J,, Nucleic Acids Res， 5毒性评价 2008，36:1153 ) 1162,miRNA ，，在 沉默中尤其是在体内的沉默必须要考虑外 ,15,ELMEN J，LINDOW M，SCHUTZ S，et al, LNA-mediated microRNA silen- 。，an- 源分子的毒性及其引起的免疫应答曾有研究发现cing in non-humanr ipmates,J,, Nature，2008，452:896 ) 899, ,16,GRUNWELLER A，WYSZKO E，BIEBER B，et al, Comparison of different tagomir miR-122 。， 有效抑制 的试验中并未发现毒性但是antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids，2’Kutay miR-122 等在人和小鼠细胞长期处理中发现 的降低与 -O- methyl RNA，phosphorothioates and small interfering RNA; ，siRNA 致瘤性转化有关在免疫应答方面在 基因治疗的早 ,J,, Nucleic Acids Research，2003，31(12):3185 ) 3193, ,30,，，。 ,17,NASEVICIUS A，EKKER S C, Effective targeted gene 期适应性免疫应答造成病人炎症甚至造成病人死亡‘knockdown’in zebrafish,J,, Nature Genetics，2000，26:216 ) ，，miRNA 。因此在毒力评价方面需要更多的 相关试验验证 220, 6 问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 与展望 ,18,WIGARD P K，ANNE K L，RENE F K，et al, Targetedin hibition of miR- miRNA miRNA ，沉默技术是 研究中的一个重要工具在 NA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic Islet development,J,, Plos Biology，2007，5(8):1738 ) 1749, 。，基因治疗和药物开发中都显示出良好的前景但是关于 ,19,STENVANG J，SILAHTAROGLU A N，LINDOW M，et al, The utility of miRNA ，沉默的理解在迅速地发展迄今还有诸多的问题亟待 LNA in micro RNA-based canceiarg ndostics and therapeutics,J,, Semi- ，miRNA 。解决如还不清楚寡核苷酸介导的 沉默机制新的 narsi n CancerB iology，2008，18:89 ) 102, ,20,MARTIN M F，MICHAEL J G, miR-122 targeting with LNA /2-O-methyl ，， 提呈系统的研究可以克服血脑屏障把分子提呈到大脑内oligonucleotide mixmers，peptide nucleic acids and PNA-peptide conju- ，miRNA 可组织特异性靶向特异性靶基因从而避免靶向 的 gates,J,, RNA，2008，14:336 ) 346, ，miRNA 非目的基因而现在的 的沉默多是瞬时的沉默目标 ,21,KLOOSTERMAN W P，PLASTEK R H, The diverse functions of microR- miRNA。、NAs in animal development and diseas,eJ,, Dev Cell，2006，11(4):441 ) 如何获得稳定持续的表达沉默方法以及毒副作用 450,。方面也需更进一步研究 ,22,CALIN G A，CROCE C M, MicroRNA signatures in human cancersmiRNA 、随着对模式生物体内 的形成功能及作用机理 ,J,,N ature Rev Cance，200r6，6:857 ) 866, ，miRNA 研究的深入最终将能解释 在动物和植物中功能相 ,23,GRIMM D，KAY M A, RNAi and gene thera:a py mutual attraction,J,,H ematology，2007(1):473 ) 481, miRNA 似而作用机理不同的原因以及 在不同生物体中调控 ,24,CHRISTIAN W，SHUANPING S，NARAYANANNAIR K J，et al, Mech- ，，其生长发育的机制使人类更好地了解生命的本质同时应 anisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs,J,, Na- 。用于重大疾病的治疗 ture Biotechnology ，2007:1149 ) 1157, ,25,UPRICHARD S L，BOYD B，ALTHAGE A，et al, Clearance of hepatitis B参考文献 vrus from the ver of transgenc mce by shorht arpn RNAsJ, PNASiliiiii,,，1BEREZO E，GURYEV V，van de BELT J，et a, Phyogenetc shadowng ,,IKVllii 2005，102:773 ) 778,and computational identification of humamn icroRNA genes,J,, Cell，2005， ,26,MCAELA S，LETZA V，KARIN B，et al, Lentivirus-mediated antagomir III 120(1):21 ) 24,expression for specific inhibition of miRNA function,J,, Nucleic Acids ,2,XIE X H，LU J，KULBOKAS E J，et al, Systematic discovery of regulatory Res，2007，35(22):149 ) 158, motifs in human promoters a3n’d UTRs by comparison of sveeral ,27,IRENE M P，CHENG G F，WIELAND S，et al, Interferon modulation of mam- mals,J,, Nature，2005，434(7031):33 ) 34, cellular microRNAs as an nativiral mechanism,J,, Nature，2007，449:912 ,3,JOSHUA T M, miRiad roles for the miR-17-92 cluster in development and ) 922,diseas,eJ,, Cell，2008，133(2):217 ) 222, ,28,RAPER S E，CHIRMULE N，LEE F S，et al, Fatal systemic inflammatory ,4,KUHN D E，MARTIN M M，FELDMAN D S，et al, Experimental validation response syndromein a ormithine transcarbamylase deficient patient fol- of miRNA targets,J,, Methods，2008，44:47 ) 54, lowing adenoviral genet ransfer,J,, Mol GenetM etabol，2003，80:148 ) ,5, ESAU C C，MONIA B P, Therapeutic potential for microRNAs,J,, Adv 158, Drug Dev Rev，2007，59:101 ) 114,li,29,DAPIC V，BATES P J，TRENT J O，et al, Antiproliferative activity of G- ,6, DAVID P B, MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism and ufnctionquartet-forming oligonucleotides with backbone ansdu gar modifications ,J,, Cell，2004，116(2):281 ) 297, ,J,, Biochemistry，2002，41(11):3676 ) 3685, ,30, KUTAY H，BAI S，DATTA J, Downregulation of miR-122 in the rodent and humanhe patoceuar carcnomas,J,, J Ce Bochem，2006，99(3): lllilli 671 ) 678,