无花果叶抑菌活性成分的实验研究

无花果叶抑菌活性成分的实验研究 无花果叶抑菌活性成分的实验研究 第18卷第3期 2005年9月 青岛大学(自然科学版) JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(NaturalScienceEdition) V0l|18NO.3 Sep.2005 文章编号:1006—1037(2005)03—0037—04 无花果叶抑菌活性成分的实验研究 赵爱云,吴神怡,杜桂彩 (1.青岛大学天然色素研宽所,山东青岛266071;2.青岛大学理工学院生物系,山东青岛266071) 摘要:以无花果叶提取物对供试菌进行抑菌实验.结果表明,无花果叶提取物具有较强的 抗菌活性;其对供试菌金黄色葡萄球菌,枯草杆菌,四联微球菌,普通变形菌的最低抑菌浓 度均为0.025g/mL,对大肠杆菌,噬夏孢欧文氏菌,灰葡萄孢,枯斑拟盘多毛孢的最低抑 菌浓度均为0.050g/mL.对有抑菌活性的组分利用柱色谱进行分离并用波谱进行鉴定, 得到两个抑菌化合物分别为补骨脂素和香柠檬内脂. 关键词:无花果叶;抑菌活性;分离;鉴定 中图分类号:Q946.91,R282.71文献标识码:A 无花果叶系桑科无花果属植物的叶,其含有多种化学成分,主要含有补骨脂素,氨基酸,果胶,树脂,黄 酮,呋喃香豆素,香柠檬内酯,维生素c等物质?,无花果叶的水提物再经乙醚萃取后的萃取物经气质联用 测定发现86个吸收峰,已经鉴定出59个化合物.,其中呋喃甲醇,苯甲醇,对羟基苯甲醛,补骨脂素,肉豆 蔻酸等成分含量较高.对无花果叶的研究,以往的研究者多集中在抗肿瘤方面?],而在抑菌活性方面报道 不多,本文对无花果叶提取物的抑菌活性及抑菌活性成分做了初步研究. l实验材料与方法 1.1材料 新鲜无花果叶于2003年10月采于青岛大学,经阴干,粉碎过40目筛,密闭封存备用;革兰氏阳性细菌: 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),枯草杆菌(Bacillussubtilis),四联微球菌(Micrococcustetrage— nus);革兰氏阴性细菌:大肠杆菌(Escherichiacoli),普通变形菌(Proteusvulgaris),噬夏孢欧文氏菌(Er— winiauredovora);真菌:灰葡萄孢(Botrytiscinerea),枯斑拟盘多毛孢(Pestalotiopsismangiferae),酿酒酵 母(Saccharomycescerevisiae),以上菌种由青岛大学生物系微生物实验室提供;所用培养基为牛肉膏蛋白胨 培养基,麦芽汁琼脂培养基,马铃薯培养基;实验用硅胶为青岛海洋化工厂生产的100,200目硅胶. 1.2仪器 UV一1601紫外可见分光光度计(日本岛津公司),HPG一280B光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术开 发有限公司制造),HZS—H水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司制造),RE一52旋转蒸发仪 (上海亚容生化仪器厂). 1.3方法 *收稿日期:2005—05—11 基金项目:青岛市科技局资助项目(03—2一jz04) 作者简介:赵爱云(1973一),女,山东泰安人,硕士,助理研究员,主要从事天然产物的 研究与开发工作. E—mail:zhaoaiyun@sina.com. 38青岛大学(自然科学版)第18卷 1.3.1无花果叶浸膏的制备 将预先采集的无花果叶洗净,阴干,粉碎过40目筛.取6kg,用36L体积分数为95的乙醇浸泡一 周,减压抽滤,残渣继续浸泡,重复两次,抽滤,合并滤液,减压浓缩,共得浸膏约1400g,浸膏提取率为 23.33. 1.3.2无花果叶浸膏的抗菌活性测定 抑菌圈测定准确称量一定质量的无花果叶浸膏,溶于二甲基甲酰胺(DMF)中,依次稀释得到不同质 量浓度的无花果叶浸膏.将实验用各种细菌,酿酒酵母活化制成一定浓度的菌悬液,加入到冷至50?的牛 肉浸膏培养基(细菌)和麦芽汁琼脂培养基(真菌)中,摇匀,倒平板.待培养基凝固后,在各培养皿内打孔,加 入不同质量浓度的无花果叶浸膏,对照用浸膏稀释剂,培养后,测量抑菌圈大小]. 对于霉菌,用马铃薯培养基(PDA)培养.在制备好的PDA平皿的中央接种霉菌,待长至直径占整个平 皿直径的一半时,在菌苔周围打孔加入样品,培养后,测量抑菌圈大小. 最低抑菌浓度测定采用试管稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)L7],取无花果叶浸膏配成2g/mL固形 物的原液,然后取8支无菌小试管,于第1管中加入牛肉浸膏液体培养基(NB)1.9mL,2,8管各1mL.于 第1管中加入上述样品1原液0.1mL,混匀后取1mL加入第2管,依次倍比稀释,自第7管吸去1mL弃 去,第8管作为空白对照.然后在各管中加人事先制备好的菌悬液20L,混匀后放至37.C的培养箱中培养 24h,观察结果. 1.3.3活性成分的分离与鉴定 将得到的无花果叶浸膏用水悬浮,用石油醚,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇依次萃取,且均萃取至有机溶剂层 澄清无色为止,浓缩合并提取液,得石油醚浸膏,氯仿浸膏,乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏四部分,将此四部分 对Bacillussubtilis做抑菌实验,对抑菌活性较好的乙酸乙酯部分做进一步分离,利用硅胶柱色谱,以石油醚 一 丙酮梯度洗脱,分成不同部分,对有抑菌活性的组分反复用小硅胶柱和SephadexLH一20处理,得化合物 A和B,利用光谱测定其结构. 2结果与讨论 2.1无花果叶的抑菌活性 2.1一无花果叶浸膏的抑菌圈 从表1可知,无花果叶浸膏对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌及真菌中的灰葡萄孢和枯斑拟盘多毛孢均 有不同程度的抑制作用, 表1无花果叶浸膏对供试菌的抑菌作用 第3期赵爱云,等:无花果叶抑菌活性成分的实验研究39 且抑菌活性具有量效关系,对真菌中的啤酒酵母则没有抑制作用.其中无花果叶浸膏对StaphyIococcusau reus,Bacillussubtilis,Micrococcustetragenus和Proteusvulgaris的抑菌效果较为显着. 2.1.2无花果叶浸膏的最低抑菌浓度 表2无花果叶浸膏的最低抑菌浓度 菌种最低抑菌浓度(g/mL) 0.O25 0.025 0.025 0.05 0.025 0.05 0.05 0.05 表2结果表明,无花果叶浸膏对 StaphyIocDccusaureus,Bacillussubtilis,Micrococcustetragenus和 Proteusvulgaris的最低抑菌浓度均为0.025g/mL,对Escherichiacoli,Erwiniauredovora,Botrytiscine— rea,Pestalotiopsismangiferae的最低抑菌浓度均为0.05g/mL,因为无花果叶浸膏对Saccharomycescerevi— siae没有抑制作用,故没测其最低抑菌浓度. 2.1.3无花果叶萃取物的抑菌作用 用石油醚浸膏,氯仿浸膏,乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏对Bacillussubtilis的抑菌作用见图1.由图可见 四种浸膏对Bacillussubtilis的生长皆有抑制作用,其中氯仿浸膏,乙酸乙酯浸膏的抑菌活性较为显着,可进 行进一步分离纯化. 化合物A和B对Bacillussuhtilis的抑菌作用见图2.由图2可知,化合物A和B对Bacillussubtilis 皆有抑菌作用. 1石油醚浸膏;2氯仿浸膏;3正丁醇浸膏;1A;2B;3,4,5为一块做的其它提取物; 4乙酸乙酯浸膏;5和6为对照用稀释剂DMF6为对照用稀释剂DMF 图1四种萃取浸膏对Bacillussubtilis的抑菌作用图2A和B对Bacillussubtilis的抑菌作用 2.1.4化合物A和B的结构鉴定 晶体A无色细针状结晶,mp188~189?(甲醇);254nm下呈淡黄色荧光,异羟肟酸铁反应显红色.IR (KBr)ul730,1669,162O,158O,1475,136O,1218,116O,1122,900,838,75Ocm1.;MS(EI) m/z(相对丰 度%)218(M+2,2.7),217(M+1,19.4),216(M,100),201(M—CH.,35.7),188(M—C0,14.6),173(M — CH.一CO,47.8),145(M—CH.,2C0,26.7),89(10.1),51(18.3).晶A的IR谱,MS谱与文献[3]基本 一 致,由此鉴定晶体A为香柠檬内酯. 一m兰 40青岛大学(自然科学版)第18卷 晶体B无色细针状结晶,mp188,189?(乙醇).IR(KBr)u1720,1635,1580,1542,1460,1390, 1320.1290,1260,1230,1190,1160,1135,1025,920,900,840,825,760,750cm;MS(E1)m/z (相对丰 度)188(M+2,1.5),187(M+1,12.7),186(M,76.1),158(M—CO,100),130(M一2C0,28.1),102 (48.2).77(22.1),76(23.8),63(10.2),51(37.3).其IR谱,MS谱与Sigma公司所提供的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品的图谱一 致,所以鉴定为补骨脂素. 3结语 本文中以抑菌活性实验做追踪,测定了无花果叶浸膏及各级提取物的抑菌活性,并对抑菌活性较好的乙 酸乙酯部分利用硅胶柱色谱分离得到两个抑菌化合物,经光谱鉴定为香柠檬内酯和补骨脂素,氯仿萃取部分 的抑菌活性成分有待于进一步研究. 参考文献: [1]马木提,地拉拉.无花果叶中补骨脂素的提取[J].化学世界,2000,8:444—445. 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