蛋白质水解度测定方法综述

蛋白质水解度测定方法综述 综述食品研究与开发2oo7.Vo/.28.NO.o7 蛋白质水解度测定方法综述 徐英操,刘春红 (东北农业大学理学院应用化学系,黑龙江哈尔滨150030) l73==I 摘要:对目前国内外常用的蛋白质水解度测定方法进行了综述,其中pH—state方 法是通过滴定水解过程中释放的 质子测定DH;OPA,TNBS及国内常用的水合茚三酮和甲醛等测定方法是利用游 离氨基的反应测定DH. 关键词:蛋白质;水解度;游离氨基;测定 INTR0DUCT10N0f'METH0Df'0RDETERMINATIONOFDEGREE0FHYDROLYSISOF PROTEINHYDROLYSATES XUYing-cao,LIUChun—hong (DepartmentofChemistry,CollegeofScience,NortheastAgricultureUniversity,Harbin15 0030,Heilongjiang,China) Abstract:Thispaperisasummarybasedonthecurrentdomesticandforeignusedmethodsfor measuringthe degreeofhydrolysisofproteinhydrolysates,whichpH-statemethodisusedtodetermineDH( degreeofhydroly— sis)byprotonsreleaseofthehydrolysisprocessintitration;OPA,TNBSanddomesticcommo nlyused,suchas ninhydrinandformaldehydearemeasuredbyflee—amido'Sresponse. Keywords:protein;degreeofhydrolysis;freeamidogen;determination 蛋白质由不同的氨基酸通过肽键相连所组成,在 这些氨基酸中一部分可以由人体自己合成,称为非必 需氨基酸;而另外约有八种氨基酸必需由食物供给, 称为必需氨基酸.食物中如含有全部的必需氨基酸, 而且数量又多,这种食物蛋白质营养价值就高.但是, 存在一个问题,就是如何使蛋白质或氨基酸更有利于 人体的吸收,因此国内外通过对此进行大量的研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:蛋白质通过水解,水解为二肽或三肽的产物在人 体内要比自由氨基酸易于吸收,比没有水解的蛋白质 更易于吸收『l1.因此在用不同的蛋白质酶对蛋白质进 行水解时,必须要对水解度进行测定. 1水解度的定义 蛋白质的水解度DH(Degreeofhydrolysis)代表蛋 白质在水解过程中,肽键被裂解的程度或百分比,数学 表达式为: DH:×100% 式中:h是被裂解的肽键数,h是原蛋白质中的总 作者简介:徐英操(1978一),男(汉),助教,研究方向:食品蛋白质及酶 水解. 肽键数,这里的h和h单位经常用mmol/g表示.对于 一 个特定的蛋白质,h是一个常数,一般采用文献中 的经验值,比如:大豆蛋白质的h值为7.8mmol/g,酪 蛋白质的h值为8.2mmol/g,也可以根据蛋白质中氨 基酸的组成成分计算得到翻. 在水解过程中,当肽键断裂后,就会有一个新的 一 COOH和一NH形成,因此,水解肽键的数,就可以根 据水解后测定新形成的末端一COOH或一NH基团的 量确定. 2水解度测定方法 2.1pH—state法 pH—state法主要是基于蛋白质水解过程中,总是 要伴随质子的释放或吸收,质子化的多少,依赖于溶液 的pH,通过加入的用于维持体系pH的碱或酸的量直 接计算出水解度嘲.计算公式如下: L,,, DHxl00%=Bx×xlO0% ?"?…" 式中::是碱液的体积mL;?b是碱液的浓度 mol/mL;ot:是氨基的离解度;Mp是底物中蛋白质总含 量g;h是底物中蛋白质中肽键的总数mmol/g(protein). —一J7742DD7.Vo1.28.,,『O.D7食品研究与jj}发综述 一 氨基的解离度可以用下面的公式计算: :J+10PK*H a 因为蛋白中亮氨酸游离的氨基的量与碱液的量成 正比关系,斜率用b表示,那么分别在pH和pH:下进 行水解,就可以利用下面的公式计算pK值: pK=pH2+log(b2-b1)一log(1O吩×6厂61) pH—state法的优点在于操作简单,快速,可重复 性高,通常被用于水解度的连续测定.然而这种方法 一 是在研究中需要用其他的方法进行校正;二是这种 方法仅适用于中性及碱性(pH>7)或pH<3的酸性溶 液中进行的水解,并且需要特别的仪器控制水解过程 中的pH. 袁斌等人四在基于国外通用的pH—state法基础上, 介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方 法,采用本方法测定蛋白质水解度时,不需要经典的 pH—state法那样,对反应体系的pH值进行在线控制, 而只需在水解结束后将反应体系的pH调至7.0,并记 录下所用的碱液的量即可.具体方法如下:水解开始 时,调节反应体系的pH为7.0,反应结束后测定反应 体系的pH值,用O.5mol/L的NaOH将反应体系的pH 调到原来的pH, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 下所用的碱液的量,按下式即可 计算出酪蛋白的水解度: 111 DH=BxMb a×亩×0o 式中:B:NaOH的体积(mL);慨:NaOH的浓度 (mol/L);在pH7.0,50?的实验条件下,对于酪蛋白, 1/为2.26;Mp:蛋白质的质量(g);:每克原料蛋白 质中肽键的毫摩尔数,对于酪蛋白,该值取8.2mmol/g. 2.2三硝基苯磺酸法(TrinitrobenzenesulfonicAcid TNBS) 这个方法由JensAdler-Nissent~于1979年进行了 详细描述.TNBS能与游离的氨基酸反应生成能在 340nm处有吸收峰的物质.反应是在弱碱性环境中, 在酸性中终止.水解度的计算公式下: DH:_盟×10o /vpo 式中:AN.指蛋白水解前氨基氮的含量【mgig(pro— tein)];A?2指蛋白水解后氨基氮的含量【mg/g(pro— tein)];?p6指蛋白底物中肽键的氮含量.A?.和A?2的 值可由标样在340nm时的吸收曲线得知(标样一般采 用L_亮氨酸)网. Y.L.Xiong等圈引用Adler—NissenTNBS法测定了 酶水解WPI(wheyproteinisolate)的水解度,计算如下: DH:阜×100ttt--tt. 式中:和分别代表WPI水解产物中和没进行 水解的WPI中氨基酸浓度;代表用6mol/L盐酸完全 水解WPI产物中总的氨基酸的浓度.没有酶的没水解 的蛋白质溶液视为0%DH. 2-3邻苯二甲醛(Ortho—phthalaldehyde,OPA)法 Church等f9]人首先于1983年应用OPA测定了蛋 白质水解度,OPA是在碱性介质中与游离氨基反应生 成具有荧光性的异吲哚衍生物,其反应如下: 0H CH, CH, s' … CHO - }-HS-CH2-CH2-OH-}-H2N-一 啦 使用荧光光度计在吸收波长为340nm条件下测 定衍生物的荧光度.水解度的计算公式: D日=10o,删 式中:n代表牛乳蛋白水解后肽键的平均数,N代 表每个蛋白分子的肽键总数.n可用以下公式表示: 3,4bsxMxd ,×C 式中:?A6s指被测样品在340nm处的吸收峰与 未水解样品在340nm处吸收峰的差值,M指被测蛋 白的分子量,d指稀释因数,,指340nm处的摩尔消 光系数(6000/mol?cm),C指蛋白浓度(g/L). KangS.Lee等fl0]利用荧光法测定游离氨基酸原 理,针对半胱氨酸与胱氨酸与邻苯二醛反应生成的 衍生物具有低荧光性的缺陷,进行研究,建立了通 用,高灵敏度的利用OPM2一ME进行蛋白质微量氨 基酸分析. 2.4水合茚三酮(ninhydfin)法 早在1949年TheodoreB.Schwartz?广就已经对此做 了详细的描述,水解样品的光密度可由下式求得: ,,(cz0一口)+,la+~Dx 其中:.为底物的初始浓度,为每个水解产物 的浓度,mo为光密度对底物浓度的直线关系的斜率, m和m:为两种水解产物的斜率.任一水解样品的 光密度. 水解度可由下列方程求得: DH=x(Dx-DD) K等同于100/(.m.+m2-mo)),D.初始底物浓度 的光密度. 水合茚三酮与一氨基酸一起在水溶液中加热. 可发生反应生成蓝紫色物质.首先是氨基酸被氧化分 食品研究与开发2oo7.VoL28.No.o7 解,放出氨和二氧化碳,氨基酸生成醛,水合茚三酮则 生成还原型茚三酮.在弱酸性溶液中,还原型茚三酮, 氨和另一分子茚三酮反应,缩合生成蓝紫色物质. 根据水解度的定义如果直接用水解后游离氨基总 含量计算水解度,由于用水合茚三酮显色法无法判断 水解后的游离氨基是原样品中本来就含有的还是经水 解产生的,因此,赵新淮,冯志彪【此进行研究,并对 原料大豆中游离氨基酸进行测定,计算如下: 肚蟹×100% /.dmmok'~) 其中:0.33是原料大豆样品中游离氨基含量,可根 据自己样品测定值代人. 但是由于不同氨基酸和水合茚三酮显色不同,对 测量结果有部分偏差,例如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三 酮反应产生黄色物质,因其d一氨基被取代,所以产生 不同的衍生物.郭兴凤【31利用待水解原料的完全水解 液作为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产 物的呈色度不同对测定结果造成的误差,并依据 QinYunChent?41的方法和现行的方法进行改进,使测定 结果更接近真实值. 计算F:×V1X×100 式中:查表得蛋白质的毫克数;W:称样重(g); I,.:水解液的总体积(mL);V:显色时所用稀释液的体 积(mE). 2.5甲醛滴定法 此方法基于甲醛与游离氨基结合,可形成一NH — CH20H,一N(CH一OH)等羟甲基衍生物,使一NH,上 的H+游离出来,这样就可以用碱滴定一NH+放出的 H+,测出氨基氮,从而计算游离氨基的含量. 甲醛滴定法常用以测定蛋白质水解程度,随着水 解程度的增加,滴定值增加,当水解完全后,滴定值即 保持衡定. 但是脯氨酸与甲醛作用后,生成不稳定化合物,致 使滴定结果偏低,酪氨酸的酚基结构,通常会使滴定结 果偏高. 3其他方法 3.1凝固点降低法 蛋白质通过酶水解形成多肽溶液,水解液分子数 量的增加,导致凝固点降低.可以通过凝固点仪进行测 定.这种方法可以用监控水解过程中水解程度,并且计 算水解度. l75=:I 3.2水溶性蛋白质的测定 蛋白质通过酶水解,形成易溶解的小分子的多肽 溶液,使得溶解性增加,因此在一定程度上,水解度的 增加及可溶性蛋白的含量也可以用来表征蛋白质水解 的程度.测定水溶性蛋白质的方法很多,有福林一酚 法,双缩脲法,考马斯亮蓝等. 4小结 在以上的方法中,pH—stat方法是通过滴定水解过 程中释放的质子测定DH,OPA,TNBS,水合茚三酮测 定方法及甲醛滴定法都是利用游离氨基发生化学反应 进行测量的,其中用OPA和TNBS测定DH会有很高 的相关性,更精确些,但时间较长.水合茚三酮法测定 的DH一般都很低[】5/.OPA法优于TNBS,因为更快速 更精确.在用游离氨基显色反应进行测定时,必须要考 虑到,水解后测定的游离氨基含量包括水解释放的游 离氨基和水解前本来就含有的游离氨基. 参考文献: [1】1DiPasquale,M.G.(1997)Aminoacidsandproteinsfortheathlete: Theanabolicedge.BocaRaton,FL.CRCPress [2】2Adler-Nissen.EnzymaticHydrolysisofproteins[J1.ElsevierApplied science.1986aLondon 【31Adler-Nissen,J.EnzymicHydrolysisofFoodProteins.1ondon:E1一 sevierAppliedSciencePublishers;1986.PP.116-124 [4】4Adler-Nissen,J.EnzymicHydrolysisofFoodProteins.1ondon:E1一 sevierAppliedSciencePublishers,(1986)132-142 [5】5袁斌,吕桂善,刘小玲.蛋白质水解度的简易测定方法.广西农 业生物科学,2002,21(2):113—115 [6】6Adler-NissenJ.Determinationofthedegreeofhydrolysisoffoodpro- teinhydrolysatesbyacid叨.JAgrFoodChem, 1979a,27:1256-1262 [7】Adler-NissenJ.Determinationofthedegreeofhydrolysisoffoodpr reinhydro~atesbytrinitrobenzenesulfonicacidmethod叽NovoEn— zylneProductsLtd1979b,TechnicalInformation,TN/O04 【8】E丸Pefia—RamosandY.LXiong.AntioxidativeActivityofWheyPro- teinHydrolysatesinaLi~somalSystem3.DairySci.84".2577-2583 【9】ChurchFC,SwaisgoodHE,PortedDH,eta1.Spectrophotometric assayusingo-phthaldialdehydefordeterminationofproteolysisin milkandisolatedmilkproteins|JDairySci,1983,66:1219—1227 【lOlKaa4~S.LeeandDennisG.Drescher.DerivatizationofCysteineand CystineforFluorescenceAminoAcidAnalysiswiththeo-Phthal— dialdehyde/2-MercaptoethanolReagent.TheJournalofBiolog~ical Chemistry,Vo1.254,No.14,IssueofJuly25,(1979)6248—6251 【11】TheodoreB.SchwartzandFrankL.Enge1.Aphotometricninhydrin methodforthemeasurementofpmteolysis.J.Bio1.Chem.1950184: 】97—202 ._==l762oo7.Vo/.28.NO.o7食品研究与再发 牛乳中13一内酰胺类抗生素残留 及检测方法的比较 李延华',王伟君",张兰威 (1.通化师范学院制药与食品科学系,吉林通化134002;2.哈尔滨工业大学食品科学 学院,黑龙江哈尔滨150086) 摘要:介绍了牛乳中抗生素残留的原因及危害,描述了B一内酰胺类抗生素在牛乳 中的残留特性及残留现状,阐述 了不同抗生素残留检测方法的优缺点,为牛乳中抗生素残留的检测提供理论参考. 关键词:牛乳;B一内酰胺类抗生素;检测方法 CHARACTERANDSCREENINGMETHODSOFB— LACTAMANTIBIOTICRESIDUESINMILK LIYan—hua1.WANGWei-jun1,.ZHANGLan—wei (1.DepartmentofMedicineandFoodScience,TonghuaTeacherCollege,Tonghua134002,J ilin,China;2,FoodScienceand GeneticsEngineeringResearchInstitutes,HarbinIndustryUniversity,Harbin150086,Heil ongjiang,China) Abstract:Thecauseandhazardofinmilkwereexplmned,Therudimentalcharacterandstatus weredescribed, thenthecharacterofB— lactamantibioticresiduesscreeningmethodsinmilkwasexpatiatedandcompared,which willbethetheoreticrefe~encefordetectingantibioticresiduesinmilk, Keywords:milk;B—lactamantibiotics;detectionmethod 乳中残留抗生素影响乳制品加工,降低食品安全, 危害人体健康,同时也影响乳制品的进出El贸易I1..我 国原料乳及乳制品中抗生素残留严重,对乳中抗生素 的检测是我国乳品加工中需要极为关注的问题圈. 为使原料乳和乳制品中抗生素残留量符合最大残 留限制(MRLs)要求,奶牛场,乳制品厂,政府监督部门 都在努力寻求准确可行的抗生素检测方法,许多大型 化学试剂和仪器公司也致力于开发抗生素残留检测的 方法和仪器.牛乳中抗生素残留的检测方法依据检测 原理的不同,大体可分为三大类:微生物受阻检测法, 作者简介:李延华(1979一),女(满).硕士,讲师,从事发酵食品与乳 制品 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 学方面的研究. 通讯作者:王伟君.男.讲师.从事发酵食品与功能性食品方面教学 及科研工作. 理化检测法,免疫学分析法. 1牛乳中p一内酰胺类抗生素残留的原因及危害 1-1牛乳中B一内酰胺类抗生素残留的原因 牛乳中抗生素残留有三大方面原因:治疗目的用 药,非治疗目的用药和非法人为污染.具有B一内酰胺 环的抗生素由于其廉价广谱的抗菌性而被广泛且频繁 地超剂量使用,因此导致牛乳中高浓度的B一内酰胺 抗生素残留. 1.1.1治疗目的用药 在奶牛场抗生素的主要用途是预防和治疗奶牛疾 病,奶牛在接受治疗后,乳中的药物残留期可延缓到停 药3d,5d后.不同给药途径,不同剂量会造成不同残 留时间.如果治疗后停止挤奶时间不够,或无意中将正 ?I??l?}?tl,?'?I??.?l?I??I?tl,?II?Jl?l??l?????I?'f??l?????IFI????II,??-e.???ii?I??'??【l-e.I?Il???Il?? [12]赵新淮,冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究【J】_东北农业 大学,1995,26(2):178 [131郭兴风.蛋白质水解度的测定叨.中国油~,2000.25(6):176—177 [14]QinyunChen.EffectofAmidecontentsinwheatglutenhydrolysates onthethermalflavorgeneration,ph.D.thesis,RutgersUniversity, USA1995:54—56 [15】PanasiukR,AmarowiczR.KostyraH,andSijtsmaL.Determination ofalpha-aminonitrogeninpea.proteinhydrolysates:Acomparisonof analyticalmethods.FoodChem,1998,62:363-367 收稿日期:2006—12—04