特发性矮小SHOX基因异常及其表型特征研究（可编辑）

特发性矮小SHOX基因异常及其 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型特征研究（可编辑） 特发性矮小SHOX基因异常及其表型特征研究 朱岷副教授 指导教师姓名 职称、单位名称 重庆医科大学附属儿童医院 ,。 申请学位级别 硕 士 学科、专业名 儿科学 ―内删 称 论文答辩年月 2010年5月 2010年5月 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 而使用过的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意( 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名: 拯盈 甘期( 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学(本人保证毕业高校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅(学校可以公布学 位论文的全部或部分内容 保密内容除外 ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名: 指导教师签名: 日 期: 。沙侈， 够?? 0 目 录 符号说明……………………………………………………(1 特发性矮小SHOX基因异常及其表型特征的研究………………………(2 中文摘要……………………………………………………(2 英文摘要……………………………………………………(5 论文正文:特发性矮小SHOX基因异常及其表型特征的研究………………8 前 言……………………………………………………(8 1 对象与方法…………………………………………((10 2结果………………………………………………((20 3讨论………………………………………………((24 全文小结……………………………………………………27 参考文献……………………………………………………28 图片资料……………………………………………………31 文献综述……………………………………………………34 致 谢……………………………………………………50 攻读硕士学位期间发表学术论文情况………………………………51 acid EDTA diaminetetraacetic乙二胺四乙酸 Ethylene H Height 身高 ISS short stature 特发性矮小 Idiopathic Kb Kilobase 千碱基对 pair LD mesomelic Langer肢中部发育 不良 Langer dysplasia LWD L6ri??Weill LCri(Weili软骨 骨发育不良 dyschondrosteosis mln Minute 分钟 ml Milliliter 毫升 PARl Pseudoautosomal1 拟常染色体区域l region PCR chainreaction 聚合酶链反应 Polymerase of pH Powerhydrogen 酸碱度 Rolls minute 每分钟转数 rpm per SD Standarddeviation 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差 SH Sittingheight 坐高 SHOX Shortstaturehomeobox 矮小同源盒 containing Tris 三 羟甲基 氨基乙 烷 Tris hydroxymethyl ethylamine 嵋 Microgram 微克 山 Microlitre 微升 rhGH Recombinanthuman hormone重组人生长激素 growth PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电 泳 gelelectrophoresis Polyacryamide 重庆医科大学硕士研究生学位论文 特发性矮小8HOX基因异常及其表型特征的研究 摘 要 stature 目的:研究重庆地区特发性矮小患者中矮小同源盒 short homeobox 的关系。 方法: 收集以矮小就诊的患者，共收集矮小患者203例，其中男109例，女 94例。 2(收集203患者和70例正常对照组新鲜全血标本， 3(收集患者和正常对照组的左腕部和左前臂正位x片，测量其腕 尺距离比和垂高,弦长;测量患者及正常对照组体征，体征的测量包括 身高、臂展、前臂长、小腿长、坐高。 微卫星，患者的5个SHOX基因外显子。 5(以正常组为对照，采用微卫星分析法检测可能存在的SHOX缺 失。 6(排除缺失后的患者，SHOX基因外显子测序，将测序结果与 重庆医科大学硕士研究生学位论文 GeneBank的SHOX基因序列进行比对，寻找可能存在的突变。 7(比较203例特发性矮小患者中SHOX异常、无异常组、身高正 常对照组之间体征有无差异。 结果: 例，女7例 ，包括11例缺失，1例点突变。 2(单因素方差分析法比较SHOX异常与无异常组之间及SHOX异 常与身高正常组之间身高、坐高,身高、臂展,身高、前臂长,身高、小腿 ,身高 SH,H 增大，臂展,身高、前臂长,身高、小腿长,身高都减小。 而 两组人群的身高无显著差别 P O(05 。 3(SHOX基因异常患者左前臂和左腕部X线上具有某些类似马德 隆畸形的轻微的骨骼改变，但尚未发现其具体的基因型与骨骼畸形之 间的具体关系。 结论: 1(本研究特发性矮小患者的SHOX异常频率是5(9,1 2(SHOX异常者坐高,身高增加，臂展,身高明显减小，提示躯干的 比例相对增大，肢体短小为主;前臂长,身高、小腿长,身高明显减小， 提示四肢短小以前臂和小腿短小明显。 3(SHOX异常者常有某些类似马德隆畸形的轻微的多样的骨骼改 变，需综合分析。 4(SHOX基因异常的矮身材患者身高波动范围大，多数低于正常， 1 重庆医科大学硕士研究生学位论文 部分在正常底限，尤其在青春前期身高可能无异常，说明SHOX异常 时的表型异质性大。 【关键词】矮小同源盒基因，特发性矮小，表型 重庆医科大学硕士研究生学位论文 AND STUDYoNTHEDEFICENCYOFSHOXGENE THECoRRELATIoNWITH PHENoTYPESoFIDIoPATHICSHoRTSTATRUE ABSTRACT the ofshortstaturehomeobox Objective:Tostudy deficiency of short idiopathic containinggene SHOX deficiency andthe between andits relationshipgenotypes Chongqing phenotypes( Methods: at 1(203childrenforshortstature Medical 2008-7to2009-10were male Uniwsityduring enrolled，included 1 94( 09，female 2(70 childrenforcontroland203 wholeblood healthy patients’flesh werecollected( in and oftheleftforearmsandwrists healthy 3(Radiographs patients toobservetheirskeletal childrenwerecollected measureswere height， anllspan， assessed，includingheight，sitting forearm leglength( length，lower fl DNAwereextractedfromeshwholeblood，then 4(Genomic mey were with to 5 microsatllitesof designed primerpairs span amplified all SHOXand5SHOXexonsof subjects( gene controls，microsatelliteidentified with analysis 5(Bycomparison SHOXdeletions。 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 6(Direct of identifiedthe withoutSHOX eoxns sequencing patients deletions(The were withSHOX seqrencessubsequentlycompared gene intheGeneBankforthe mutations( sequences potential 7(The ofclinicalmanifestationwasmade comparion during SHOX-deficient deficient inallISS group，non―SHOXparticipants thecontrolwithnormal patients，andgroup height。 Results: 1(Elevendeletionsanda mutationofexon2werefoundin203 withISS( patients 2(Differencesof SHOX-deficient physicalsignsduring group、 deficient inallISS thecontrol non―SHOX participantspatients，and group wemtested as ANOVA，such byone-way height，sitting were length,height，lowerleglength,height(There span,height，forearm non??-SHOX differencebetweenSHOX-??deficientand significant group andthecontrol deficient SHOX-deficient group participants，between of withSHOX increased，and group:siRingheight,heightpatients defiency their andlower armspan,height，forearmlength,height leglength,height in decreased(Therewerenodifferencesbitweentwo height groups P O(05 ( leftforearmsandwristsofS 3(In ofthe radiographs weresomemildskeletaldeformitieslike group，there Madelungdeformity in withSHOX the between patients deficiency，butspecificrelationships andbonedeformitieshadnotbeenfound genotypes yet( Clousions: 1(The ofSHOX ofISS inthisresearch frequency defiencypatients was5(9,( 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 with of SHOX height,heightpatients increased， 2(Sitting andlower length,height leglength, height armspan,height，forearm decreased(Theresults ratiooftrunk andmesomelic suggested increasing limb offorearm andlower shortening(Thedecreasing length,height leg thatforearmsandlowershortenedmore suggested legs severly( 3(Thereweresomemildand skeletaldeformitieslike multiple in withSHOX deformity Madelung patients analysis( comprehensive 4(The ofshortstatures withSHOX height patients deficiencymight be fluctuations(Mostofthemhadabnormal wereclosed large stature，some toabnormalbutinnormal evenhadnormal in range，others height a of pre―adolescents(Thissuggestedhighdegreephenotypicheterogeneity ofSHOXdeficiency( gene words:Shortstaturehomeobox Key containing short stature，Phenotypes 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 特发性矮小SHOX基因异常及其表型特征的研究 前言 人体的线性生长是多因素、多基因相互作用的复杂过程，其中基因因素 尤为 stature 重要。人群矮小症的患病率为2,，矮小同源盒基因 short homeobox 2】是致矮小的主要基因之一。 containinggene，SHOX Ih region kb，由6个外显子组成，分别编码292和225个 PARl ，Xp22和Ypll(3，全长40 aristaless rax 结构域。SHOX基因编码产物位于细胞核内，是一种 OAR orthopedia 细胞特殊性转录激活因子【31。 SHOX基因主要在发育中的肢体骨骼生长板和第一二咽弓表达，在人类骨骼 肌、肾脏、肝脏、肺和脑等器官中也有表达。SHOX基因自胚胎12周起，直至青 【4l，主要在增生和肥大软骨细胞和骨髓成纤维细春期持续在生长板处表达 胞表达。 骨骼中SHOX基因主要在四肢骨表达，尤其是尺骨、桡骨、腕骨、胫、腓骨远端骨 骺，促进四肢骨远端软骨细胞分化，调节软骨细胞增殖与凋亡间平衡，并抑制雌 激素加速生长板成熟的作用，利于骨发育和身体线性生长。大量研究证实:SHOX 多倍基因及其基因剂量与人的身高和线性生长密切相关。在多X综合征中 SHOX 基因剂量 多表现为高身材5】;在45 足表现为矮身材。SHOX基因的纯合性缺陷导致严重的矮小，即少见的Langer肢中 mesomelic SHOX基因异常多为杂合 部骨发育不良 Langer dysplasia，LMD [610 性缺陷，导致L&i-Weiii软骨骨生成障碍 L&i(Weill short 特发性矮小 idiopathic 程度的矮小;肢中部发育不良即前臂和小腿短;肘外翻;马德隆畸形;短掌骨、 重庆医科大学硕士研究生学位论文 短趾骨和高颚弓掣7，8，9】。马德隆畸形是L6ri-Weill软骨骨生成障碍的典型特征。 陷，可以引起桡骨骨骺尺侧提前融合，停止生长，从由于桡骨SHOX基因缺 而导致: 桡骨粗短弯曲，腕骨角减小，尺桡骨远端相对侧骨骺及干骺端发育差，远端关节 面向掌、尺侧倾斜，桡骨远端关节面尺侧倾斜导致腕骨尺侧移位，远侧尺桡关节 脱位等。 的矮小，儿童早期身高甚至可在正常范围内;从几乎不能检测出的骨骼缺陷到严 重影响病人生活的肢体畸形，骨骼的畸形程度不一。有些患者骨骼改变类似于马 德隆畸形，但改变较轻不足以诊断为马德隆畸形，因此无马德隆畸形也不能排除 SHOX缺陷。儿童早期和骨骼改变不明显者，可能被诊断为ISS。SHOX基因的同种 突变也可导致不同的表现型。且SHOX基因突变所致的表型又受年龄、性别影响。 研究者们做了大量研究，致力于寻找具体的SHOX基因突变与表型之间的关系，已 取得某些进展，但至今尚未能完全解决。因为SHOX基因无鼠的同源基因，故基因 功能研究的传统方法不能进行，这限制了对其的进一步了解，对于其调控和表达 方面的 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 有诸多未解的疑点，需寻找合适的方法深入研究。寻找SHOX基因异常 的诊断率，同时也为进一步研与相应表型之间的关系，可以提高SHOX异常 究 SHOX的分子功能和机制提供一定的基础。 Sara 带不包括SHOX的新突变，该缺失在SHOX3’末端下游大约30-530kb，大小不同， 和上下游编码区的异常也可以引起矮小和LWD的表现，这可以解释SHOX基因完整 的病人却有LVR 的表现，也说明内含子及上下游区域可能含有SHOX基因的调控序 列。 SHOX基因异常时表型具有高度异质性，即使基因型相同其表型也可能不同， 基因内的异常和基因外的异常均可导致矮小畸形，决定了SHOX基因和SHOX基 因以外拟常染色体区域检测的必要性。可以用微卫星分析及荧光原位杂交等方法 来检测SHOX基因及拟常染色体区域l的缺失，常规SHOX基因微卫星的分子筛 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 l SHOX基因 游约l1(5Kb;DXYS 0092，在SHOX基因上游约400bp:DXYS233 上游11(5Kb到下游575Kb这一区域。外显子的检测可选用直接的测序法。 特发性矮小的诊断标准:?身高低于同性别、同年龄、同地区、同种族、正 常参考值平均数2SD以下;?出生时身长和体重正常，而且身材匀称;?无明显的 慢性器质性疾病 肝、‘肾、心、肺、内分泌代谢疾病和骨骼发育障碍 ;?无心理 和严重的情感障碍，摄食正常;?生长速率稍慢或正常;?染色体检查正常:? 变的频率因种族和人群的不同而各异，国外研究报道，ISS中SHOX异常的检出率 不全的发病率是1,25000，因此SHOX基因缺陷所致的身材矮小远高于软骨发育不 全和生长激素缺乏的总频率。 尽管没有生长激素缺乏，重组人生长激素治疗可以改善SHOX异常患者的最终 身高116,17】。sHOx异常时，抑制雌激素加速生长板成熟的作用减弱。进入青春期后， 用促性腺激素释放激素类似物协同生长激素治疗，可预防骨骼的提前融合，减轻 骨骼异常【18】，并改善最终身高，尤其是SHOX单倍体剂量不足的女性患儿。生长激 HOX异常性矮小人群带来希望;也给临床医生诊断素治疗的良好效果给S SHOX异 常性矮小提出要求，怎样从家族性矮小和ISS中筛选出SHOX异常性矮小人群是非 常重要和必要的课题。 国内尚无有关SHOX基因突变频率的报道。重庆地区人群平均身高低于全国平 均水平，因此本研究以重庆特发性矮小儿童为研究对象，采用微卫星分析和外显 子测序法，调查重庆特发性矮d,JL童SHOX基因缺陷情况，根据其体征和骨 骼改变， 常对照组之间的差异，分析SHOX缺陷与其表型之间的相关性。 1对象与方法 1(1研究对象 10 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2008年7月至2009年10月到重庆医科大学附属儿童医院门诊以矮小为主诉就 诊的患者。筛选标准:1(无宫内发育迟缓;2(无慢性疾病;3(无心理、情感障 碍;4(染色体检查正常;5(GH激发试验除外生长激素缺乏症，甲状腺功能 T3、 T4、TSH 正常;6(排除软骨发育低下等骨骼疾病。身高标准参照《中国儿科杂 志》2009年7月第7期《中国旺18岁儿童、青少年身高、体重的标准化生 长曲线》。 因有报道表明在青春期前或者青春早期时，某些SHOX异常的儿童身高可能 2SD， 性身高 l50cm。共收集矮小儿童203例，其中男孩109例，女9460，平均年龄 10(0l士3(17岁，其身高标准差范围是(2(4士1(ISD。征得病人和 家长的同意后，抽取 3mL抗凝血提取DNA;收集身高正常儿童的血液70例为对照。研究得到重庆医科 大学附属儿童医院院伦理委员会批准同意，符合伦理学标准。 1(2材料 1(2(1主要试剂 三蒸水 重庆医科大学儿研所配制 无水乙醇 重庆川东化工 集团 有限公司 血液基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技 北京 有限公司 北京鼎国生物技术有限责任公司 TEMED N，N，N’，N’一四甲基7,-胺 尿素 北京鼎国生物技术有限责任公司 过硫酸铵 北京鼎国生物技术有限责任 公司 引物 上海鼎安生物技术有限公司 去离子甲酰胺 北京鼎国生物技术有限责任公司 三羟甲基氨基甲烷 Tris 北京鼎国生物技术有限责任公司 电泳载样缓冲液 重庆医科大学儿研所配制 溴化乙锭 EB 溶液 重庆医科大学儿研所配制 氢氧化钠 北京鼎国生物技术有限责任公司 碳酸钠 北京鼎国生物技术有限责任公司 甲醛 天津时永大化学试剂开发中心 Tap酶 天根生化科技 北京 有限公司 重庆医科大学硕士研究生学位论文 HotMaster DNA酶 天根生化科技 北京 有限公司 Tap 超纯dNTP 天根生化科技 北京 有限公司 1(2(2主要仪器 台式离心机 Eppendorf,German 生化离心机 上海安亭科学仪器厂 三用电热恒温水箱 北京长安科学仪器厂 ORE(630D微波炉 电子工业部七七八厂连云港分 厂 金属恒温器 北京鼎国昌盛生物技术有限公 司 紫外透射仪 UVP，美国 ABI3100 DNA测序仪 基景 天津 模塑制品有限公司 Thermo 移液器 Electron，USA 电子天平 A一120(CSi COBOS(Korea 核酸电泳装置 BIO-RAD(USA 梯度PCR仪 Eppendorf,德国 普通PCR仪 Eppendorf,德国 普通冰箱 青岛海尔集团 漩涡振荡器 江苏海门麒麟医用仪器厂 凝胶成像扫描系统 BIO―RADGS-670 imaging Densitometer(USA 核酸电泳装置 BIO―RAD(USA 超纯水处理系统 Millipore，USA TS(2型脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限 公司 核酸蛋白定量仪 GeneQuant，Amersham，Sweden 制冰机 美国SCOTSMAN公司 1(2(3试剂的配制 1 40,丙烯酰胺储存液配制: N，N 7一甲基双丙烯酰胺，加蒸馏水至100mL，抽滤后，棕色瓶40C避光保存。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 10,AP的配制: 3 5xTBE电泳缓冲液的配制: 称取Tris碱549、硼酸27(59、EDTA3(7249，溶解于800mlddH20中，再用 ddH20定容至IL 即为工作液。 4 I型加样缓冲液:溴酚蓝50mg，加去离子甲酰胺至100ml，4?贮存。 5 封底胶:1,琼脂糖溶液。 避免AgN03分解。 7 显色液配方:1 09NaOH，O(29 鲜配制。 1(3方法 本研究共收集特发性矮小儿童203例，男109例，女94例。用微卫星分析寻 找可能存在的SHOX基因缺失，外显子直接测序寻找可能存在的SHOX基因突变 1(3(1血液DNA的提取 严格按试剂盒说明操作，提取所收集的203例病人正常对照组70例的血液。 具体如下: 使用前在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。 解液CL，颠倒混匀，10，000 rpm ,l1,500xg 离心1分钟，吸去上清，留下细胞核 沉淀。收集到的细胞核沉淀q劝n200此缓冲液GS，振荡至彻底混匀。 2 (加3,20gL蛋白酶K溶液，混匀。 3 (力1200gL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56。C放置10min，其间颠倒混匀数 次，溶液应变清亮 如溶液未彻底变清亮，延长裂解时间至溶液清亮为止 。 4 (jJl200gL无水乙醇，充分颠倒混匀。 5 (将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中 吸附柱CB3放 入收集管中 ，12，000 S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 rpm -13，400xg 离一t -,30 重庆医科大学硕士研究生学位论文 CB3放入收集管中。 6 (向吸附柱CB3中加入500pL缓冲液GD，12，000rpm ,l S， 3，400xg 离一1二'30 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 S， 7 (向吸附柱CB3中加入700此漂洗液PW，12，000rpm ,13，400xg 离，tl,30 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 (向吸附柱CB3中加入5001(tL漂洗液PW，12，000rpm ,13，400xg 离心30 s，倒掉收集管中的废液。 9 (将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rain，倒掉废液。 rpm ,13，400xg 离一G,2 将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 10 (将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空 滴加 50-200 rain，1 rain， 2，000 vL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 rpm ,13，400xg 离心3 将溶液收集到离心管中。 11 (DNA保存在(20?。 1(3(2外显子和微卫星的PCR 1 引物: 引物序列由上海鼎安生物技术有限公司合成，各组引物序列、退火温度 如下: 表1微卫星的引物 TablPrimersofmierosatellites 14 重庆医科大学硕士研究生学位论文 耙外显子的引物 ofexons Tab2Primers 引物的溶解:首先将装有引物的试管离心，小心打开管盖，加入适量已 消毒 ×100，即制备成100肛M的引物储存液，引物工作液再稀释10倍。 2 PCR扩增 微卫星的PCR利用TIANGEN Buffer中含200mM Tap酶，(其中10xTap KCL:100mM NI-14 2S04，15mM Tris??HCL pH8(4 :200raM MgCL2。20ill的 各试剂的量为模板2(01al，酶0(41,tl，dNTPl“l，bufferPCR体系中， 缓冲液i(5I-tl， 混合之后置于PCR反应仪进行PCR反应。 HotMaster 5个外显子PCR扩增的酶选用TIANGEN DNA酶，201al的PCR Tap 体系中，模板2(01xl，酶0(4I_tl，dNTP 伸，扩增25(30循环。 表3反应条件 Tab3Conditionsofreaction 15 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 产物琼脂糖凝胶电泳 1 取25mlTBE于三角瓶中 2 称取0(59琼脂糖倒入盛有TBE液的三角瓶中，混匀。 3 微波炉内加热约30s至lmin，待琼脂糖沸腾透亮即可。 4 冷却片刻，安装电泳板，插上梳子并固定。 5 小心倒胶于电泳板上。室温冷却20min。 6 胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部凝胶，。 7 将电泳板安放到电泳槽中，有梳孔的一侧放负极 黑色导线一侧 ， 加上缓 冲液，使缓冲液刚好没过凝胶。 8 取5此PCR产物，与1此6×上样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品 槽中。每加完一个样品更换枪头，以防止样品间互相污染，注意上样时小心操作，避免 刺穿样品槽底部凝胶。余一孔加入Marker。 9 电压150V，室温电泳25min。染色。 将电泳后的凝胶放入溴化乙锭溶液中20分钟，紫外透射仪下观察判断PCR结 果，在凝胶自动成像仪中记录电泳图谱。 1(3(3微卫星分析: 原理:聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacryamide gel 酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。在不 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的制作是分层进行的，因此凝胶不仅具有 分子 筛效应，还有浓缩效应。与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶难于制备和处理。 它们的分离范围较窄。但它们有突出的优点，由于是不连续的pH梯度，因此样 故而增强了分离效果，提高了电泳分辨率。尤品被压缩成一条狭窄的区带， 其是 晰地分开。其次，DNA纯度高。从聚丙烯酰胺凝胶中得到的DNA纯度很高以致 于以后的操作不用任何处理。另外，它的负载容量高。该胶的标准加样槽中可加 入高达10mL的DNA样品，而不会影响电泳分辨率。多应用于分离纯化和鉴定 ---500bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系大小为5" 两种， 前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分 析。后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH值与凝 16 重庆医科大学硕士研究生学位论文 胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成。 1 凝胶的制备: ?用95,乙醇清洗玻璃板和梳子各3遍，晾干。 Gel ?配制变性聚丙烯酰胺凝胶: 8,Acr,Bis Urea 249 40,acrylamide:bis 38:2 10ml 5xTBE 10ml waterto 50ml deioized 在磁力搅拌器上使尿素溶解。待尿素溶解后，用抽滤凝胶液，倒入烧杯。 然后迅速加入: TEMED 50ul 10,AP 过硫酸铵 250ul Freshlyprepared ?吸取凝胶混合液混合均匀，小心加入封好底和边的两块玻板间，让液 体自 底部向上连续注入直至液面到达玻板顶端，避免气泡产生。 ?迅速在顶端两玻板间插入梳子，并固定玻板。 ?室温下静置凝胶聚合l小时。 ?安装电泳装置。 ?配制琼脂糖凝胶，加热凝胶至沸腾，稍冷却后即吸取适量封玻板边缘， 以 免电泳液漏出，保证上槽中的电泳液始终高于薄板上缘。 2 预电泳 ?待凝胶聚合好后，去掉夹子，将凝胶板固定于垂直电泳槽上。 ?在垂直电泳槽的上下槽分别加入适量0(5xTBE缓冲液。 ?小心去掉加样梳，用移液器小心冲加样槽以去除尿素。 ?接通电源，电泳40分钟。 3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ?按说明组装好电泳装置，拔出加样梳，加入电泳缓冲液。 DNA ?将2ul扩增产物、2ulMarker分别与等量甲酰胺载样缓冲液DN,x,标 记好 的微量离心管中，混匀。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ?将扩增样本及DNAMarker的混合物在沸水中煮沸10分钟变性，然后立即 取出置于冰上冷却。 ?凝胶预电泳结束后，用移液器再次冲洗加样槽中的尿素，然后用微量进样 器按顺序依次将样本加入凝胶加样槽。注意动作轻柔，以免样品漂移，避免进样 器破坏进样孔。 ?恒电压200v电泳2(0小时。 4 银染:银染技术，是近年发展起来的一种敏感性高、操作简便、无毒污染、快 速省时的新方法。电泳后的聚丙烯酰胺凝胶 PAGE 干胶片可长期保存。并可直 接投影。因此，银染技术的应用提高了临床基因诊断及研究的阳性检出率。 ?将凝胶剥下，双蒸水冲洗一次，l5s; ?加染色液，摇床轻摇8,10min; ?双蒸水冲洗一次，15s; ?加少量显色液，轻摇15s，弃去反应液; ?加入200ml显色液，轻摇2---,3min，带显后，立即将凝胶置于双蒸水终止反应。 ?观察结果，凝胶成像仪上照相记录结果。 按上述方法筛选出70例正常对照组中片段最小者为参照，寻找矮小患者中可 能存在的微卫星缺失。有可疑阳性时，重复2次以明确。 注意事项 由于微卫星分析技术是基于PCR的一种分子标记，因此模板DNA、DNA聚 合酶、dNTP以及M92+的浓度等因素可能会影响微卫星分析的结果。若参与 反应 的某些因子条件不适合，则会导致图谱弥散状背景杂带的产生，扩增产物的消失 及电泳谱带位置的改变，影响判断。改进反应的措施主要有: 板中蛋白质、糖及其它杂质含量低。 2 不同引物的退火温度应根据引物的Tm及实验结果调整。 3 寻找模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及buffer的最佳浓度。 1(3(4外显子扩增产物测序: 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3100DNA 测 将外显子的PCR产物送重庆医科大学测序中心进行测序 ABI 序仪 ，测序结果通过BLAST比较。 1(3(5统计方法 采用SPSSl7(0软件包进行分析。各组数据均服从正态分布，共三组:SHOX 异常组、SHOX无异常组、正常对照组，采用单因素分析法，两两比较三组之间 体征差异。两组之间比较采用t检验。 1(3(6临床资料分析 以基因分析的结果为基础，将收集的203例特发性矮小患者分为SHOX异常 与无异常组。 1 表型的研究: 为观察SHOX基因异常时的表型，对所收集的203例病人进行详细的体征测量， 测量指证:身高，坐高、臂展、前臂长、小腿长，同时测量身高正常儿童的这些 指征，前臂长、小腿长均测量左侧。分析SHOX异常、无异常组与正常组之 间坐高 ,身高、臂展,身高、前臂长,身高、小腿长,身高有无差异，以及SHOX异常与SHOX 无异常矮小患者之间身高有无差异。为方便比较，在计算各指标与身高的比值时， 身高采用米为单位，而坐高、臂展、前臂长、小腿长均采用厘米。 臂展:双臂侧展，与肩平行，掌心向前，两中指之间的长度。 前臂长:手臂自然下垂，桡骨茎突最突出点至肘窝的距离。 小腿长:腓骨头至距骨最突出点的距离。 图1垂高,弦长 Vertical Figl height,chordallength 19 重庆医科大学硕士研究生学位论文 图2腕尺J巨离比L2,LI CubitdistanceratioL2,L1 Fi92 2 骨骼特征的研究: 收集矮小患者和身高正常组的左前臂正位和左腕部X线正位片，测量下述指 标:?垂高月玄长，反映桡骨的弯曲程度，桡骨弦长是指桡骨骨干突出弧度之长， 桡骨垂高指桡骨骨干弧度最突出点至弦长垂线 如图1 :?腕尺距离比，反映腕 骨尺侧移位程度，腕尺距离L2是尺骨纵轴线到腕关节旋转轴的距离，腕尺距离比 是指L2与第3掌骨长度Ll之比，如图2。桡骨弯曲时，垂高,弦长增大，腕骨尺侧移 位时腕尺距离比减小。 分别比较垂高,弦长和腕尺距离【 tSHOX异常组与无异常组、SHOX异常组与身 高正常组之间有无差别。 2结果 2(1实验结果 2(1(1SHOX缺失 图4外显子2的突变 2 Mutationofexon Fi94 测序结果经BLAST比较，只发现一例杂合性点变突，外显子2:115T―G 如 图4，箭头所指出处 ，氨基酸缬氨酸替代亮氨酸。 2(2临床资料分析 左腕部和左前臂X线正位片，观察SHOX异常患者的骨骼特征，如表4。具 体改变见附图片资料。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表4SHOX异常儿童的骨骼改变 Tab4Skeletaldeformitiesof withSHOX patients deficiency 腕骨角:分别做手舟骨、月骨的切线和月骨、三角骨的切线，此两线的夹角 为腕骨角。正常时腕骨角为130。，小于117。称为腕骨征阳性，马德隆畸形时小 于90。[191。 第四掌骨短小:连接第三掌骨和第五掌骨远端，正常时第四掌骨远端超过此 连线，反之，就称为第四掌骨短小。 桡骨弯曲:从附图片可以看出先证者l和先证者12桡骨弯曲明显，其垂高, 弦长的比值，更远高于SHOX无异常组和正常对照组的平均值。 前臂短:从左前臂x线可以看出，先证者l前臂相对短，且其前臂长,身高为 14(21cm，低于SHOX无异常组及正常对照组的平均值。 桡骨骨骺三角形:指桡骨骨骺外侧缘连线与内侧缘连线长度之比大于4。 测量矮小患者左前臂及左腕部x线正位片，得到腕尺距离比和垂高,弦长的值， 确定3组数据都服从正态分布后，单因素方差分析法分析SHOX异常组、无异常 重庆医科大学硕士研究生学位论文 组及正常对照组之间，两两比较垂高月玄长及腕尺距离比之间的差异，结果 p O(05， SHOX异常组与无异常组之间无统计学差异。SHOX异常组与正常对照组之间也 有P 0(05，亦无明显差异。 2(3SHOX异常的表型特征 无异常组的年龄和性别构成比与SHOX异常组相同，故SHOX无异常组共选择36 例，其中男15例，女2l例，平均年龄9(!-4-3(02岁。采用单因素方差分析法，对 SHOX异常、无异常组与正常对照组之间进行两两比较，分析坐高,身高、臂展,身 高、前臂长,身高、小腿长,身高的差异，发现SHOX异常与无异常组、SHOX异常 与正常对照组之间并无差异 P 0(05 ，即SHOX异常者坐高,身高增大，臂展, 身高、前臂长,身高、小腿长,身高都减小，有SHOX异常者前臂和下肢短 小。而 两组人群的身高无统计学差异 P 0(05 ，无显著差别。 表5体征测量比较l Tab5 ofclinicalmanifestations1 Comparions 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表6体征测量比较2 Tab6 ofclinicalmanifestations2 Comparions t检验法比较SHOX异常组和SHOX无异常组矮小患者之间身高的差异，结 2例未低于一2SD，即身高在正常范围，其年龄和身高情况:先证者7，4(8岁，女， 一1(9SD 。 3讨论: 本研究收集矮小患者203例，其中男109例，女94例。微卫星分析及外显子测 变。基因缺失明显多于突变，这可能与SHOX基因周围散在分布大量的重复序列有 多发的原因。由于本研究所选取的微卫星未能包括全部的内含子及其上下游区域 的全部序列，故实际的SHOX异常率应高于此值。 SHOX异常为常染色体显性遗传，本研究选取的研究对象标准患者身高 性遗传方式突出，因此家族史也可作为判断SHOX异常的一条线索。 SHOX基因主要在四肢长骨表达，其单倍体剂量不足可致肢体短小为主的矮 小，即显著特征是非匀称型短肢性矮小。本研究发现SHOX异常者坐高,身高增加， 臂展,身高明显减小，提示躯干的比例相对增大，肢体短小为主;前臂长, 身高、小 腿长,身高明显减小，提示四肢短小以前臂和小腿短小明显，此与SHOX基因主要 重庆医科大学硕士研究生学位论文 小组的身高标准差 (2(4+0(93SD ，无统计学差异，这说明特发性矮小的儿童中， 素引起的矮小，身高方面可能并无差别。但是已有研其SHOX异常与其他因 究指出， 矮小的程度与骨骼畸形的严重程度有关，即骨骼畸形严重时，身高矮小越明显。 仔细的人体测量可及早诊断受累的LWD患者，可提高SHOX异常的诊断率。 观察12例基因异常患者左前臂及左腕部X线正位片，发现9ff4 男4例，女5例 患者分别有腕骨角减小，第四掌骨短小，桡骨骨骺三角形，桡骨弯曲，尺桡骨远 端相对侧骨骺发育差的骨骼改变，即有轻微的马德隆畸形骨骼特征，但其程 度不 足以诊断为马德隆畸形。提示对SHOX异常的骨骼特征，需综合分析;寻找轻微的 马德隆畸形骨骼特征有助于SHOX异常的诊断。利用腕尺距离比和垂高,弦长观察 但并未发现SHOX异常SHOX异常所引起的桡骨弯曲和腕骨尺侧移位的情况， 与无 正常的SHOX基因抑制雌激素加速生长板成熟，阻止雌激素促进骨骼不均衡的提前 融合，因此骨骼异常随年龄增加会逐渐明显【211。本组SHOX异常患儿的平均年龄为 异常组和身高正常对照组之间，腕尺距离比及垂高月玄长的差别，3例无明显骨骼改 (8岁 女 、8(2岁 男 和7(6岁 女 ，均为青春变的患儿年龄分别为4 期前儿童， 这些均可能支持SHOX异常时，抑制雌激素加速生长板成熟的作用减弱，青春期雌 激素的分泌增加促进骨骼不均衡的提前融合。故应动态随访其骨骼的特征性变化。 骨骼畸形。另外因本组资料样本量少，不能就此定论，需进一步扩大样本量，以 更明确的寻找骨骼改变的规律。 龄同性别儿童的(2SD。有2例未低于(2SD，即身高在正常范围:先证者7，(8岁， 4 女，(1(8SD，原因可能为有些SHOX异常者，在青春期前身高可能正常，但青春期 雌激素的分泌增加促进骨骼不均衡的提前融合，导致最终成人身材矮小;先证者4， 12(4岁，女，(1(4SD，这说明SHOX异常时表型异质性大。因此，对于身高在正常 低限，但有遗传因素的儿童应随访其身高和骨骼的动态变化情况，及时应用生长 激素治疗，以改善最终身高。本资料尚未发现SHOX异常者的身高分布与年 龄的关 重庆医科大学硕士研究生学位论文 系，原因可能是例数少，应继续扩大样本量研究。 以上研究和发现都表nf]SHOX异常的表型异质性较大，可以高于矮小的标准。 目前表型异质性分子的机制还知道的很少。以往研究已经排除TSHOX基因缺失的 大小与不同表型的之间关联，亦除外SHOX基因的突变类型与其表型的多样性相 关。表型高度异质中可能原因有:1(未分析的区域可能存在着变异，如SHOX上 游区、下游区调节序列等等;2(性染色体特异性的调节;3(修饰基因受剥22l;4(遗 传不均一性。也有人推测复杂的异质性与SHOX蛋白在骨骼不同部位的表达程度不 同有关。另外也可能与本研究样本量少有关。 本研究收集的重庆地区203侈1J特发性矮小患者中共有12例SHOX基因异常， SHOX缺陷的频率为5(9,。SHOX异常时表型异质性较大，表现为肢中部短小，即 非匀称型短肢性矮小，尤以前臂和小腿短小明显。SHOX异常患儿多有轻微的骨骼 需综合分析，从左前臂及左腕部X线正位片寻找轻微的马德隆畸特征改变， 形骨骼 特征有助于SHOX异常的诊断。下一步工作是扩大样本量和对基因其他位点进一步 研究，进一步了解SHOX基因异常者骨骼改变特征及其规律。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 全文小结 本研究共收集203例特发性矮小的儿童为研究对象和70例健康儿 童为对照，提取血液基因组DNA后，通过微卫星分析和外显子的直接 测序检测SHOX基因的异常情况，测量所有研究对象的相关体征，收 集左前臂和左腕部X线正位片，研究SHOX异常与相关表型之间的关 系，本研究提示如下: 1(本研究特发性矮小患者的SHOX异常频率是5(9,; 2(SHOX异常者坐高,身高增加，臂展,身高明显减小，提示躯干的 比例相对增大，肢体短小为主;前臂长,身高、小腿长,身高明显减小， 提示四肢短小以前臂和小腿短小明显。 3(SHOX异常的患者常有某些类似马德隆畸形的轻微的多样的骨 骼改变，需综合分析。 4(SHOX基因异常的矮身材患者身高波动范围大，可以严重矮小， 也可以在正常底限，且在青春期前身高可能无异常，说明SHOX异常 时的表型异质性大。但因本实验例数少，故应综合分析。此外对于有 遗传背景的儿童应密切关注身高和骨骼的动态变化。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 参考文献 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