Elisa配方
抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制 1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS
0.39克 NaH2PO4?2H2O
1.27克 Na2HPO4
0.85克 NaCl
NaN3 200mg H2O(蒸馏水) 至 1000ml 2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4，PBST
2.0克 NaCl
0.2克 KH2PO4
2.9克 Na2HPO4?12H2O
0.2克 KCl
0.2克 NaN3
至 1000ml H2O
吐温(Tween)20 0.5ml
3、包被液(简称CB)pH9.6
1.59克 Na2CO3
2.93克 NaHCO3
0.2克 NaN3
至 1000ml H2O
4、ELISA底物液(可溶性底物)
磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0 0.1mol/L柠檬酸(21.014克/100ml) 24.3ml 0.2mol/L Na2 HPO4(28.4克/1000ml) 25.7ml H2O 50ml
5、DAB底物液(不溶性底物，组化病理等)
0.05mol/L pH7.6 Tris-HCL
6.05克 Tris
3.15克(约2.7ml浓HCL) HCL(36%)
至 1000ml H2O
DAB为3?，3?二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色
6、DAB溶液配制:(组化及Western blot 显色)
称DAB30mg，用0.05mol/L pH7.6Trs-HCL缓冲液100ml溶解,如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制使用。用前加入1%H2O2 1-1.5ml,H2O2浓度为0.01%，混均后使用。 7、3?，3?，5?，5?，-四甲基联苯胺(TMB)溶液配制:
用二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)或无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4?C保存半年以内使用。使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml(1mg/TMB)1%TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H2O2 1ul，混匀后立即使用。2N H2SO4终止后，450nm测定OD值。 8、1%离子琼脂胶配制液
作免疫双相扩散，单相扩散及免疫电泳中使用。
0.05UpH8.6巴比妥钠-HCL缓冲液
巴比妥钠 23.8克
1mol/L HCL 34.5ml
H2O 2150ml
ELISA试剂盒的组成及试剂配制方法 ELISA试剂盒主要有以下系列:1.细胞因子检测试剂盒 2.内分泌检测试剂盒 3.肝纤维化检测试剂盒 4.心肌梗塞检测试剂盒 5.肿瘤标志物检测试剂盒 6.自身免疫检测试剂盒 7.优生优育检测试剂盒 8.传染病检测试剂盒 等等;
各种种属有:人、大小鼠、豚鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛、羊;植物。
ELISA试剂盒组成: 1. 酶联板:一块(96孔)
2. 标准品(冻干品):2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1,600 pg/ml，将其稀释为400 pg/ml后，再做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)，分别稀释成400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。如配制200 pg/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 400 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液:1×20ml。
4. 检测稀释液A:1×10ml。
5. 检测稀释液B:1×10ml。
6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
SO4)。 10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2
11. 覆膜:5张
12. 使用说明书:1份
自备物品
1. 酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)
2. 微量加液器及吸头，EP管
3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸
标本的采集及保存
1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4?过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20?或-80?保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8? C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20?或-80?保存，但应避免反复冻融。
3. 其它生物标本:请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20?或-80?保存，但应避免反复冻融。
4. 样本处理:血清或血浆标本推荐稀释5,000倍。
注:以上标本置4?保存应小于1周，-20?或-80?均应密封保存，-20?不应超过1个月，-80?不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
实验操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37?溶解);试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37?反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜, 37?反应60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl，酶标板加上覆膜37?反应60分钟。 5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37?避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。 注:
1. 试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2. 加样:加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。 3. 孵育:为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4. 洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
5. 试剂配制:Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6. 反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7. 底物:底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 洗板方法
1. 手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。 2. 自动洗板:如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)，在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
? 注意事项:
收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4?备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20?或-70?条件下保存。避免反复冻融。标本2-8?可保存48小时，-20?可保存1个月。-70度可保存6个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。
? 液体类标本
标本必须为液体，不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血浆。每个标本量收集体积,100ul×检测种类。取材前须向销售人员索要说明书。
? 血清:
室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
? 血浆:
应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入10,(v/v)抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。如有沉淀
形成，应再次离心。
? 尿液、胸腹水、脑脊液:
用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
? 细胞培养上清:
检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
? 组织标本:
切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，缓冲液中可加入1μg/L蛋白酶抑制剂或50U/ml的Aprotinin(抑肽酶)。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清置于-20度或- 70度保存，如有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
寄标本时需注明以下情况:
标本编号;2、所测项目;3、是否做复孔;3、联系方式;4、实验后标本是否寄回
上海索莱宝生物科技有限公司 低价 提供各种种属各种系列ELISAkit酶联免疫检测试剂盒。 主要用于科研方面，不用于临床诊断。可以用于检测各种指标。
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毛细管电泳原理
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)是20世纪80年代初发展起来的一种新型分离分析技术，乃经典电泳技术和现代微柱分离有机结合的产物，是继高效液相色谱(HPLC)之后，分析科学领域的又一次革命。
毛细管电泳泛指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳仪的基本结构包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
毛细管电泳仪的工作原理:毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在pH>3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动的现象叫电渗。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出;中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向与电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
理论基础:如果溶质纵向扩散是区带展宽的唯一因素，对于CE来说，可以通过增大分离高压和缩短毛细管来提高速度，同时兼顾分离效率。在任何给定的时间内要获得最高的理论塔板数，分离电压与毛细管长度的比例应该最大，也就是说在只考虑溶质纵向扩散的前提下，采用尽可能高的分离电压和短的毛细管，可以实现高柱效和快速分离。高电渗流同样可以提高分析速度和柱效。
焦耳热:但实际上，分离高压增大和毛细管长度缩短时，除了扩散外，还有诸多因素影响柱效，其中最严重的是温度效应，即毛细管的焦耳热问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
，这是HSCE中不可忽略的问题。
焦耳热随着分离高压增大和毛细管的缩短而增大。焦耳热过大会造成峰扩展、变形。
减少焦耳热的方法:理论上，当G小于1W,m时，焦耳热造成的峰扩展可以忽略不计。采用小内径毛细管可以降低焦耳热、施加高电压，实现快速分离而不影响柱效。在HSCE的许多实例中，通常采用内径低至10 m的毛细管和2,5 kV,cm的高电场。但内径低于50μm的毛细管对进样和检测提出了更高的要求。另一种减少焦耳热的方法是采用低电导率的缓冲溶液，如具有高的相对分子质量、小电荷的溶液或窄pH范围的两性电解质。这种方法很有
吸引力，因为它对仪器没有特殊要求，可以应用于商品CE仪上。综上所述，要在维持高效情况下加快CE的分析速度，可以采用以下几种方法:(1)短而窄内径的分离毛细管;(2)高分离电压;(3)高电渗流。另外，对于带负电荷的分析物，通常在缓冲溶液中加入阳离子表面活性剂，通过改变E0F的方向来提高。
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DNA的凝胶电泳
质粒DNA的凝胶电泳和纯化回收
l 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
1) 将正确量粉状琼脂糖加入测定量的电泳缓冲液。
2) 在沸水浴或微波炉中加热到琼脂糖溶解。
3) 冷却溶液至50?，加入溴化乙锭 (取自10 mg/mL贮存液，用避光瓶保存于4?下)，其终浓度为0.5% µg/mL。
4) 用高压灭菌胶带将清洁、干燥的玻璃皿边缘封口以便形成一胶模。 5) 用巴氏移液管吸取少量琼脂糖凝胶溶液封住胶模的边缘。
6) 胶模的边缘封好后，将剩余的热琼脂倾入模内，立即放梳子(其形成样品槽)至接近凝胶底部并固定，检查梳齿底与凝胶底之间应有0.5-1.0 mm距离。 7) 室温下放置凝胶30,45分钟，仔细移去梳子和高压灭菌胶带，将凝胶放到电泳槽中。
8) 加电泳缓冲液(如果需要，含0.5µg/mL溴化乙锭)至刚好覆盖凝胶达1mm深。 9) 样品与上样缓冲液混匀，进样至被电泳缓冲液淹没的凝胶样品槽内。在一定的电压和电流条件下开始电泳。
u 注意
? 用不同浓度凝胶可分辨不同大小的DNA片段。
? 在低电压状态下，线性DNA的移动速率与所用电压成比例变化。然而，随电场强度的升高，高分子量DNA片段的迁移率增高不同。因此，随着电压的升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围则降低。为获取DNA片段的最大分辨率，凝胶电泳应不超过5 V/cm。 ? 琼脂糖凝胶中DNA电泳状况不受DNA碱基成分或电泳温度的明显影响。因此，不同大小DNA片段在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率在4~30?范围内并无变化。总之，琼脂糖凝胶电泳可在室温下进行。但是，含低于0.5%琼脂糖的凝胶则相当容易断裂，最好是在4?
下电泳以使凝胶获得一些韧硬度。
? 含Tris-乙酸盐或Tris-硼酸盐或Tris-磷酸盐的几种不同电泳缓冲液(大约是50 mM， pH 7.5~7.8)。这些缓冲液常常以浓缩液形式配制，并贮存于室温下。 l DNA凝胶的纯化、回收(Vitagene DNA凝胶回收试剂盒)
1) 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶。
2) 根据凝胶浓度加适当体积的DE-A溶液，混合均匀后于75?加热(低熔点琼脂糖凝胶于45?加热)，间断混合，直至凝胶完全溶化(约6,8min)。
3) 加0.5个DE-A体积的DE-B溶液混合均匀。
4) 吸取C中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min，弃滤液。
5) 将制备管置回离心管，加0.5ml W1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。 6) 将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用0.7ml W2溶液洗涤一次。
7) 将制备管置于离心管中，最高速度离心1min。
8) 将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备管膜正中央加25ul水或洗脱液，室温静置1min，最高速度离心1min洗脱DNA。
u 注意
? 以上操作步骤适于从TAE或TBE琼脂糖凝胶中提取DNA.从其他缓冲液电泳胶中提取DNA时，加入DE-B溶液后，溶液的pH应调整到6.5以下。
? 在步骤A中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶溶化时间(线性DNA长时间暴露在高温条件下易于水解)，从而提高回收率。勿将DNA的凝胶长时间的暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。
? 步骤B中凝胶必须完全溶化，否则将严重影响DNA回收率。 ? 将洗脱液或水加热至60?，有利于提高洗脱效率。
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至10ug DNA(100bp-150kb)，回收率为70%-90%。 15:40 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日志 | Cell
动物组织石蜡切片HE染色方法
动物组织石蜡切片HE染色
一、 载玻片及盖玻片的清洗
1. 用洗衣粉液浸洗半小时，蒸馏水冲洗多次致完全无泡沫。
2. 用95%酒精浸泡数半小时，再次用蒸馏水冲洗。
旧切片需用稀清洁液配方浸泡:
重铬酸钾(工业用) 2份
浓硫酸(工业用) 3份
水 50份
配制事宜，先将重铬酸钾溶于水中(可加热溶解)，然后慢慢加入硫酸。 将玻片一片一片浸入清洁液，一般浸泡12-24h。从清洁液中取出后，用水浸洗12-24h(与清洁液浸洗的时间等长)，中途须换几次水，然后再浸入95%酒精中，浸数小时到一天。取出擦干，便可应用
二、 Bouin 氏液
Bouin氏液配方:
苦味酸饱和水溶液 85份
福尔马林 10份(4%)
冰醋酸 5份
三、 盐酸酒精 多配成0.5-1%浓度，用作染色后的分色。
盐酸酒精配方:
盐酸 0.5ml
5%的酒精 100ml 四、 Mayer 氏苏木精 此种染色液有多种配方，根据我们使用的经验，下列配方效果很好。
Mayer 氏苏木精配方:
苏木精 25mg
蒸馏水 75ml
钾明矾(硫酸铅钾) 1.25g
碘酸钠 5mg
配制事，碘酸钠的量切勿多加，因为它是强氧化剂，加多后反而失效。配好后可立即使用，也可置冰箱内保存使用多时，且使用时毋需过滤。此液另一优点是大大节约了苏木精的用量。 此液能使细胞核染得非常细致，尤其是对菌类、藻类的细胞核的染色特别有效。经我们应用于动物组织的整块染色，获得良好效果。 复制曙红 先将0.5g曙红溶于5ml蒸馏水中，溶解后一滴一滴加入冰醋酸，边滴边搅动，可见有沉淀生成，至成浆糊状时，再加数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加时，过滤。将沉淀物连同滤纸一起置于50-60?C温箱中烘干。将烘干物溶于100ml 95%酒精中即成。用复制曙红染色很易染上，尤其用于动物组织块的整块染色，效果很好。
15:39 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日志 | Cell
动物细胞培养: 培养基的配制
(一)准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0(22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。 过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制
1(去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏(去除无机和有机杂质)，制3 000 mL三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理(15磅20 min)。
2(待水温降至15—30?C，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间(2—4 h)使之充分溶解。
3(配制RPMll640培养基时应通入适量C02或加入6 mol,L盐酸调pH至6(0左右，这样才能充分溶解。
4(加入一定量NaHCO，调节pH至7(0左右。
5(加水至最终体积。
6(在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。
7(瓶口封好，4?冰箱贮存(RPMI1640培养基可以-20?贮存)。
(三)小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处
理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。 1(将血清加热至56?并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 2(处理后的血清贮存于4?。
3(小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量(见八、新生牛血清的筛选)。 (四)生长培养基的配制除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌素。
1(培养基分装成小瓶(100,200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。
2(按如下比例配制: 基本培养基占80,,90,，小牛血清占10,,20,。 按1,体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U,mL和100 μ,mL,。
根据表2—3—4的实验安排进行实验，实验结果中填写:遇到什么问题?如何解决?实验结果怎样?
表2—3—4培养基的配制:
1(培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。因为用于处理提取RNA的DEPC水(0(1,焦炭酸二乙酯)是一种致癌剂，并可能影响细胞生长;而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。
2(过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3(5次用完为宜，并且每瓶只能装2,3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。
3。滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。
电泳仪
15:34 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日志 | Cell
酶连免疫ELISA分析技术及应用
ELISA知识讲座之一
免疫检测的基础知识
ELISA是一种【免疫测定】。免疫测定(immunoassay，IA)是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
1.1 抗原
【抗原】是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原(hapten)。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenic determinant)，或称为表位(epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如中可带有等决定簇。
1.2 抗体
1.2.1 抗体的结构
【抗体】是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为(γgamma)链和μ(mu)链。
IgG的结构见图。
? 木瓜酶裂解部位
? 胃蛋白酶裂解部位
重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合 部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合(见图)，是抗体专一性结合抗原的结构基础。
IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段(Fab)。每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。
IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F(ab')2，能和两个相同的抗原结合;另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。
IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。
机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。
因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
右图为为甲型肝炎病人血清中IgG抗体和
IgM抗体出现的时间和水平。
1.2.2 抗体的产生
机体受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应的抗体。含有抗体的血清称为抗血清(antiserum)。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb或Mab)。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞(含产生抗体的B细胞)与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。
1.3 抗原抗体反应
1.3.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为:Ag+Ab?Ag?Ab 抗体的亲和力(affinity)是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K表示:K=[Ag?Ab],[Ag][Ab] Ag?Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。
1.3.2 最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量见图1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象(zone phenomenon)。抗体过量称为前带(prezone)，抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。
1.3.3 特异性
抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg)，随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如:绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成激素(LH)均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断(敏感度应达到50mIu/mlhCG)的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。
1.3.4 敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定:
1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。
2) 激素，包括小分子量的甾体激素等。
3) 抗生素和药物。
4) 病原体抗原，HBsAg、HBeAg等。
5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs等。
5( 标记的免疫测定
如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达5~10μg/ml，但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物分别为放射性核素和酶，最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量，敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中，一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体(Ab※)检测抗原(Ag)为例，反应式如下: Ag+ Ab※ ? AgAb※+ Ab※在反应产物中有与Ag结合的Ab※和游离和Ab※，如不将两者分离而测定标记物，测得的结果将为两者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段，固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反应，结合的标记物被固定在载体上，而游离的标记物留于
溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab※除去，结合标记物的测定可在固相上进行。 6( 酶免疫测定
酶免疫测定(enzyme immunoassay)可分为均相(homogenous)和非均相(heterogenous)两种类型。在均相EIA中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力，因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相EIA在临床检验中较少应用。非均相EIA需先进行游离的和结合的标记物的分离。如前所述，固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay)，简称ELISA，在国内有译作酶联免疫吸附试验的，虽然含义不完全确切，但已习用。
ELISA的原理和类型
1. ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2. ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型: 2.2.1 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2) 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2，图1-4)，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect)，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2)。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2.2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 2.2.3 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法(见图2-3)。操作步骤如下: 1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗
体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 2.2.4 竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
2.2.6 捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒(HAV)抗体的检测模式见图2-7。
类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。 2.2.7 ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。
ELISA的试剂(上)
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文(2.2)已述，ELISA中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:
(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);
(3)酶的底物;
(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中); (5)结合物及标本的稀释液;
(6)洗涤液;
(7)酶反应终止液。
3.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8?)干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。
3.1.1 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/ml)包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可应用如下的试验:用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就是这一ELISA测定项目的最合适的固相载体。
在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸附面积约为200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA板孔
的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体，反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。 3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法(见2.2.4)，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如30W紫外灯，75cm照射12小时)，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg
可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假阳性， 因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。 3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的)，在抗血清中将出现杂抗体，必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8?冰箱中放置过夜，37?中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与
包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用(5%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的(见2.2.2)。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
ELISA的试剂(下)
3.2 结合物
结合物即酶标记的抗体(或抗原)，是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外，结合物尚要有良好的稳定性。
3.2.1 酶
用于ELISA的酶应符合以下要求:纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化 酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数)表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ??.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。常用的AP有两个来源，分
别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000，酶作用的最适合pH为8.0;用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000，最适pH为9.6。在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。
3.2.2 抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab')2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
3.2.3 结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
(1)戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为:酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高;结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合
物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条筒舛ǚ延玫慕谑 ,兔副?br> 抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
3.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液(见3.2.5)临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8?保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠)，以防止细菌生长。
3.2.5 结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%牛血清白蛋白)，通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
3.3 酶的底物
3.3.1 HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下:
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺
(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD?2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制
成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温(2,8?)可稳定1年。
3.3.2 AP的底物
AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。
AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)，可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
3.4 洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
3.5 酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
3.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定
其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
3.7 参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒(例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等)应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA知识讲座之五
ELISA的操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 4.1 标本的采取和保存
可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4?，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂(见3.2.4)。
4.2 试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出
的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
4.3 加样
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
4.4 保温
在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完 成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43?、37?、室温和4?(冰箱温度)等。37?是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37?经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43?进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4?更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25?，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
4.5 洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲 洗式两种，过程如下:
(1)浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液;b.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去);c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短;d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;e.重复操作c和d，洗涤3-4次(或按说明规定)。在间接法中如本 底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
(2)流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 4.6 显色和比色
4.6.1 显色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。
OPD底物显色一般在室外温或37?反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加
入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。
4.6.2 比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。
比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔)，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。
比色结果的表达以往通用光密度(oplical density，OD)，现按规定用吸光度(absorbence，A)，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。
4.6.3 酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为?1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083?0.01(1.073~1.093)，重复测定数次，其A值均应1.083?0.05(1.078~1.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30?，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。
测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W2，最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。
4.7 结果判断
4.7.1 定性测定
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。
(1) 间接法和夹心法
这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物(见3.6)。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。
目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件
许可
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下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本(sample，S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。
a( 阳性判定值
阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。
用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值
公式
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中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9?2ng/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值(例0.400)，试验才有效。3个阴性对照A值均应?0.5×NCX，并?1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:
阳性判定值=NCX+0.05
标本A值,阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。
根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。
b.标本/阴性对照比值
在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性(positive)，而是病人(patient)的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05(或其他数值)，则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。
(2)竞争法
在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。
竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。
a. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125?100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如0.300),试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应?0.5×NCX并?1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX;如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:
阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
标本A值?阳性判定值的反应为阳性，A,阳性判定值的反应为阴性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算:
抑制率(%)= (阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值
一般规定抑制率?50%为阳性，,50%为阴性。
4.7.2 定量测定
ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。甲胎蛋白质ELISA测定的标准曲线示例见图4-1。
测定小分子量物质常用竞争法(参见2.2)，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线示例见图4-2。注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。
有关质量控制问题
从1949年美国College of American Pathologists(简称CAP)首先开始研究临床实验室室内质量控制(简称质控)问题，美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。
到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理，推行Good Laboratory
Parctice(简称GLP)。进入80年代末期，GLP的统一标准产生了，发展到"认证实验室"管理阶段。
全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。
本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为ELISA是目前临床上最常用的一种免疫学检验方法，就以ELISA检验为例，介绍一下有关问题。
卫生部临床检验中心免疫质控室从1988年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完善，希望能找出一条适合中国国情的，行之有效的质量管理的道路。
5.1 基本概念
5.1.1 质量控制(Quaility Control,Q.C)
质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。
1)确定控制的对象;
2)规定控制对象的标准(预期值);
3)制定或选择控制方法和手段;
3)测量实际数据;
4)比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预
定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
5)采取行动，解决差异。恢复原状(原标准状态)的手段发挥作用。
质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查"性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍(见5.3.室内质控程序)。
5.1.2 误差
实验误差分为三种:系统误差、随机误差和过失误差。
系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。
随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。
过失误差是人为的
责任
安全质量包保责任状安全管理目标责任状8安全事故责任追究制幼儿园安全责任状占有损害赔偿请求权
误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。 5.1.3 正态分布及标准差
ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据(指测定结果的吸光值)分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中心对称分布，这就是正态分布。
正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数(X)和标准差(SD)来表示，其计算 方法如下:
均值、标准差和概率的关系如下:
X?1SD，概率0.68 X?2SD，概率0.95 X?3SD，概率0.99
换言之，当ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值(X)的
?1SD范围内的数据，占该组数据的68%，在X?2SD范围内分布的数据占总体的95%，在X?3SD范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X?2SD范围内为合格时，
将有95%的数据可能合格。
5.1.4 真值
用确切的、最理想的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。
5.1.5 准确度(accuracy)
是指测定结果与真值(或靶值)接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。
绝对偏差=检验的均值-真值(或靶值)
相对偏差=绝对偏差真值?(或靶值)×100%
5.1.6 精密度(Precision)
是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间的符合程度。
5.1.7 标准品
1、国际标准品 由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。
2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材料。 3、参考标准血清 国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。
5.1.8 临床决定性水平(clinical decision leuel)
当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性水平。
5.2质量控制血清
质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。
5.2.1 质控血清的使用
卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20?保持半年定值不变。冰
冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4?保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。 5.2.2 临界值质控血清
质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。
5.2.3 质控血清的制备每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清(以乙肝质控血清为例)。
1) 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2) 56?加热10小时来活。
3) 离心或过滤除去沉淀。
4) 用10%的小牛血清或正常人血清(PBS缓冲液)将收集的血清稀释至所需的浓度。如
能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。
5) 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20?保存备用。不可反复冻融。
被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要
求，则应加所要求浓度的质控物。
6) 标定含量。20-30次测定结果删除>?2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对
比测定。
5.3 室内质量控制程序
临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。
1) 最佳条件下的测定误差。
2) 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3) 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4) 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。
5.3.1 最佳条件下已知值质控血清变异(optimal conditions variance,简称OCV)的测定
在本实验室最佳条件下(包括操作者、试剂、仪器等)检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差(SD)表示该实验室的最佳工作质量。
现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门测定，选用最佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值(A值)，求出X。连续作20次，求出20个X，即X1……X20。从这20个数据中，求出OCV的X和SD。
5.3.2常规条件下已知值质控血清变异(routine conditions variance-known value,简称 RCVK)的测定。
做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后(例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等)，重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。
5.3.3常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU)的测定
有时为了避免主观性,再作RCVU测定。测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。
5.3.4质控图
通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。
质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。
ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为:?一次超出3SD;?连续二次超出2SD;?3-5次连续处于一侧的2SD之内;?5,7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第?、?种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。
5.3.5统计学计算方法--"即刻性"质控
以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但ELISA有其特殊性，最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。"即刻法"的建立具体计算方法如下: 1)先将测定值从小到大排列
2)计算X和SD。
3)计算SDI上限和SDI下限值。
4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值,n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算;当SDI上限和SDI下限有 一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于"告警"状态;当SDI上限和SDI下限有一值,n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属"失控"。数值处于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。
即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。
当检测的数值超过20次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即可。 5.4室间质量评价(external quality assessment,简称EQA)
室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。
5.4.1室间质评的方法
1、 发质控物进行调查
这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。
这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。
2、 派观察员到实验室进行试剂调查
这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。
这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。 ELISA试剂的临床质量评价
ELISA试剂的评价(evaluation)分两个方面:一是试剂本身的质量评价，符合一定要求后才能生产供应;一是在临床应用中效果的评价。以肝炎ELISA诊断试剂为例，首先必须通过中国药品生物制品检定，以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、说明书等外，对试剂的性能，如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定，通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才为合格。ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测，以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作，通过质量评价，促进了试剂质量的提高。
6.1 诊断试剂临床质量评价要点
从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，是以其能否区分健康与疾病的能力作为依的。目前还很难找到100%可靠的试验，任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准。临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示，特异性以无病者试验阴性的百分率表示。进行这种评价，首先需要收集有关的病人血清，然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定，以确定其为阳性或阴性。这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"(panel)。被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表:
表中a为真阳性，b为假阳性，c为假阴性，d为真阴性。
被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算:
灵敏度(%)=a/(a+c)×100%
特异性(%)=b/(b+d)×100%
符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%
一般认为灵敏度或特异性>90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。 6.2 临床考核血清盘的制备要求
1、 采用人的原血清;
2、 血清盘应具有相应的稳定性;
3、 血清盘中样本不含防腐剂，或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂; 4、 血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半;
5、 阳性样本中，应有一定数量的强阳性和弱阳性样本;
6、 血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品，以检验试剂的灵敏度。 7、 血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质(RF因子)的样本，
以检验试剂的特异性。
6.3 临床考核血清盘的建议
以抗-HBc-IgM为例，部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本，经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选。选出血清70份，其中阳性29份，阴性41份，组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘。在70份样本中，除7份为无病历的质控血清外，抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例;抗-HBc-IgM阴性的40份样本中，含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例(均为恢复期采的血样)、慢性活动性肝炎8例(其中5例为恢复血样)。
因此，这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核，可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开，具有临床诊断意义.
关于ELISA测定错误结果的原因分析
中国医科大学第一临床学院 张丽霞教授
ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA)"。 ELISA的基本原理是:?使抗原(或抗体)结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性;?使抗原(或抗体)与某种酶联结成酶标抗原(或抗体)，而且此酶标抗原(或抗体)既保留其免疫活性，又保留其酶活性;?测定时将受检标本(抗体或抗原)和酶标抗原(或抗体)按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例;再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色
反应的深浅进行定性或定量分析，以解被测标本中抗体或抗原含量。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果(即假阳性或假阴性结果)。引起ELISA测定错误结果的原因主要有:?标本因素;?试剂因素;?操作因素。本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种:
1( 内源性物质
有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
(1)类风湿因子 人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是:?用F(ab)2替代完整的IgG;?标本用联有热变性(63?，10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效);?检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。
(2)补体 ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是:?用EDTA稀释标本;?用53?，10 min或56?，30 min加热血清使C1q灭活。
(3)嗜异性抗体 人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是:可在标本稀释液中加入过量的动物Ig (s) ，但加入量不足或亚类不同时无效。
(4)嗜靶抗原的自身抗体 抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，解决的办法是:测定前需用理化方法将其解离后再测定。
(5)医源性诱导的抗鼠Ig (s) 抗体 临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体;另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig (s) 抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是:测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，从而克服由于上述原因造成的假阳性。
(6)交叉反应物质 类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
(7)标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ELISA测定结果有干扰作用。
2( 外源性物质
外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。
(1)标本溶血 由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。
(2)标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
(3)标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性;标本放置时间过长(如一天以上)，有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4?，1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
(4)标本凝集不全 在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后1/2~2h开始凝固，18~24h完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果;这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
(5)标本管中添加物质的影响 抗凝剂(如肝素，EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性)及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。
综上所述，对临床检验ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。
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mRNA分离纯化磁珠
Dynabeads® Oligo(dT)25 mRNA分离纯化磁珠
北京思尔成生物技术有限公司
产品描述:本产品用于从总RNA或直接从动物组织、植物或细胞中快速分离出高纯度且完整的mRNA。可以广泛的应用到各种样品中。磁珠上的oligo-dT与mRNA的polyA杂交。
操作简单易行，仅需几步洗脱和磁分离，所有操作都在单管中一次完成。磁操作最大的优点就是容易清洗、分离以及浓缩磁珠结合的材料。用很小的体积就可以把mRNA从磁珠上洗脱下来，用于各种分子生物学应用。事实上，磁珠不会干扰下游酶学反应，因此分离的mRNA不需洗脱。如果需要，固定于磁珠上的oligo-dT还可以作为逆转录的引物用于固相cDNA文库的构建或直接进行RT-PCR分析。
优点和特性:
独特磁性技术便于流水线操作并可实现自动化
不需要预处理、过柱、离心和沉淀
灵敏度高，可分离或克隆单个细胞的mRNA
分离的mRNA可以用于基因克隆及基因表达分析，也可直接应用于所有分子生物学下游研究。
应用:简单、快速分离纯化完整的mRNA
浓度:5 mg/ml
储存条件:2-8?C
-------------------磁性纳米材料制备的免疫磁性微球在生物医学方面的应用 目前磁性微球在生物医药方面的应用以免疫磁性微球为代表，发展较快，已有产品上市，而且有很多成功的应用。磁性纳米材料是构成磁性微球的重要组成部分，因此磁性微球的应用也就是磁性纳米材料的应用。
1 磁性纳米材料的制备与性能
常用的磁性材料为三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等。这些磁性材料具有较好的磁响应性，采用适当的方式可以方便地得到这些大小在纳米尺度的磁性材料。例如:取一定量的磁性材料分别溶于适量的蒸馏水中，过滤后混合，加入一定量蒸馏水稀释，搅拌均匀，加入适当的表面活性剂作为分散剂。在一定温度下，保持搅拌，以一定速度向体系中加入溶液，滴加完后继续搅拌半小时。取出，放置于磁铁上，使氧化铁颗粒沉降，除去上层清液，再加入分散剂的水溶液适量，用超声波分散，过滤，即得氧化铁磁性纳米粒的色胶体溶液。
制备过程中碱液的浓度对氧化铁纳米粒的性能影响较大，碱液浓度低则磁性材料的磁化强度就低;碱液的滴加速度影响磁性材料的性能，滴速越慢，则磁性材料的粒度越小，磁化强度越低;体系的反应温度也有影响，温度则粒度变大，磁化强度增强。
通过上述方法获得的磁性纳米材料，用水适当稀释后，可摄制电镜照片，经图象分析仪测定粒度的大小与分布，或用激光粒度测定仪直接测定，可以获得大小不等的纳米材料，最小可获得平均粒度为几个纳米的磁性材料，粒度一般呈正态分布。还可用X衍射测定仪分析磁性纳米材料的结构，用磁强计测定其磁化强度。
2 用磁性纳米材料制备磁性微球
磁性微球可由磁性纳米粒和高分子骨架材料制备而成。其中的高分子材料包括聚苯乙烯、硅烷、聚一烯、聚丙烯酸、淀粉、葡聚糖、明胶、白蛋白、乙基纤维素等。有天然的也有合成饿，可以单独应用也可以合用作骨架材料。这些骨架材料应该性质稳定、强度较高、无毒副作用。
制备磁性微球的方法可分为一步法和二步法:一步法是在成球前即加入磁性纳米材料，成球时聚合物将其包裹于其中;二步法是先制备非磁性小球，然后通过处理使磁性材料进入其中，最后磁性纳米粒以分散的形式存在微球的骨加材料中。
一步法发展较早，有很多种方法，仅介绍以下四种。
(1)将磁性纳米材料(如四氧化三铁纳米粒等)分散于水中，加入高分子聚合物的单体，再加入引发剂，在适当条件下引发聚合反应，使单体在四氧化三铁纳米粒的周围聚合形成磁性微球[73]。合成高分子材料作为骨架的磁性微球多用此法制备。
(2)将磁性纳米材料分散在高分子骨架材料的水溶液中，加入适当的表面活性剂，在一种疏水性溶剂中乳化成为W/O型乳剂，用热固化法或交联固化法使高分子骨架材料固化成磁性微球。以天然高分子材料为骨架的磁性微球多用此法制备。
(3)首先在碱性溶液中沉淀Fe2+和Fe3+使成超顺磁氧化铁，然后用硅烷包衣为微球。所制硅烷磁性微球可以分散在水性介质中，而不会快速沉淀，可用磁场方便地进行回收。 (4)将磁铁矿本身作为氧化-还原系统的一部分，聚合物可以完全包裹在磁铁矿周围。聚合物是由从磁铁矿颗粒中扩散出来并通过对过硫酸的还原而成为自由基的铁离子引发的。用此方法可以制得一种包含丙烯酸树脂的水性凝胶磁性微球。
二步法文献较少。
3 【免疫磁性微球】的制备、性能与作用原理
(1)免疫磁性微球的制备 免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres，IMMS)，或称免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMB)，是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。由于需要在磁性微球的表面结合上适当的抗体，因此要求所用的磁性微球能通过其表面的化学基因与单抗结合，或有较大的表面吸附力能与单抗牢固结合。交联聚苯乙烯微球强度高，表面易进行化学修饰，是比较理想的制备免疫磁性微球的骨架材料。
微球与抗体的连接有吸附结合与共价结合两种形式，吸附结合依靠微球表面对抗体的非特异吸附力，而共价结合依靠微球表面的活性基团与抗体共价反应。吸附结合只有在微球具有非常大的表面积时才有可能比较牢固，这样，对于表面比较平整的微球，就要通过对其表面进行处理来提高它的抗体结合力，以保证IMMS表面有足够的抗体[75]。经过表面处理的磁性微球与单抗在适当的缓冲液中培养，抗体通过物理吸附很快地与磁性微球结合，如果微球表面有活性基团，则接下来就会通过较慢的化学反应共价结合在磁性微球的表面。 (2)免疫磁性微球的性能与作用原理 免疫磁性微球主要用于细胞分离等方面。由于它能特异性地与靶物质结合并使之具有磁响应性，因此将免役磁性微球与含有靶物质(欲分离的物质)的复杂混合物共同培养。则免疫性微球可以通过抗原抗体反应选择性地与靶物质结合，当此化合物通过一个磁场装置时，与免疫磁性微球结合的靶物质就会被磁场滞留，从而与其他复杂物质分离开来。
用于细胞分离的免疫磁性微球具备以下条件:化学性能稳定，不产生凝聚;不与细胞发
生非特异性的结合;磁性微球与抗体的结合牢固;磁性微球的大小均匀，磁响应性好，磁性纳米材料的含量均匀一致;磁性微球大小适当，不易被细胞所吞噬。
IMM与细胞的结合可以采取两种方法，直接法和间接法。直接法是指抗体直接连在磁性微球上，然后与靶细胞结合。间接法是指先将细胞与特异抗体混合培养，使特异抗体结合在细胞表面，然后加入预先用抗鼠IgG(二抗)处理的磁性微球。使磁性微球间接地与靶细胞结合。直接法可以减少洗涤和培养步骤，但对IgM单抗很少能使用。间接法与直接法相比，除适当范围广外，还可以使用一组单克隆抗体，因而会获得更好的细胞清除效果。但要经过多次的洗涤步骤，特异性也会有所降低。
针对单核细胞的单克隆抗体的发展使得分离带有特异表面标记的细胞成为可能。一般有3类不同的方法，即流式细胞仪技术(PACS)、表面联上二抗的异体红细胞花环技术、将抗体被动吸附在聚苯乙烯组织养板上的Panning技术。这些技术都有各自的缺点。FACS价格昂贵，技术复杂，经常会被所分选细胞的容量、活性、无菌度等问题所困扰;红细胞花环技术无法处理大量的细胞，另外，至今尚无一成熟、简便的方法能够将抗体偶联至红细胞膜上;Panning技术也有很多局限性，它难与放大操作，步骤烦琐，不能定量，靶细胞经常混杂着非特异抗体吸附在培养板底部的其他细胞。相对而言，免疫磁性微球具有操作简便、分离迅速完全、细胞纯度高等优点，尤其在操作简便省时方面，其他分离方法很难比拟。 4 免疫磁性微球在生物医学方面的应用
(1)免疫磁性微球在自身骨髓移植中的应用 在过去10多年中，高剂量化疗后给予自身骨髓移植(ABMT)已经成为某些患有急性白血病、何杰金氏淋巴瘤(NHL)、神经母细胞瘤及wilms肿瘤的可选疗法。最近，ABMT用于小细胞肺癌、睾丸癌和乳腺癌也取得了饿令人鼓舞的结果。但是，ABMT也有限制条件，那就是肿瘤转移细胞有可能累及骨髓。因此，在体外清除骨髓中的癌细胞是保证ABMT成功的必要条件。体外净化骨髓已发展起来多种方法。其中，运用免疫磁性微球物理地清除癌细胞的方法具有安全、效果好、操作简单的特点，得到广泛应用。免疫磁性微球技术发展起来的原因之一，就是越来越多的证据表明，肿瘤细胞亚类可以排斥补体介导的细胞溶解反应。而IMMS净化骨髓不需要特异的ISOTYPE抗体，也不受正常骨髓中抗补体因子的影响，可以清除低水平抗原表达的肿瘤细胞。自免疫磁性微球问世以来，至今已经应用于几乎所有的需要进行骨髓净化的癌症类型。如神经母细胞、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小细胞癌、乳腺癌等[76]。
?用于清除神经母细胞瘤细胞 IMMS最早应用于神经母细胞瘤细胞的清除。1984年，Treleaven等人建立了运用IMMS从骨髓中清除癌细胞的模型系统。清除过程为:将磁性微球与IgG1族的6个单克隆抗体(UJ13A、UJ223.8、UJ127.11、UJ181.4、Thy-1和H11)在4?、转动状态培养2h后，混合物放在传送装置上通过一系列的磁场。则神经母细胞瘤细胞被滞留，“干净”的骨髓自然流下。结果表明，在有核骨髓细胞中混有1%的神经母细胞瘤细胞(cell line CHP100)时，用IMMS可清除99.9%的肿瘤细胞。而对正常细胞的损害极小，通过分离装置后，细胞的活性超过了98%。聚落分析证明，BFU-E、CFU-C、CFU-GEM和CFU-E均无显著降低。
?用于清除淋巴瘤细胞 De Rosa等人将IMMS应用于2例淋巴瘤病人的自身骨髓移植。首先，将骨髓与4种单克隆抗体(CD10、CD19、CD20、CD22)一起培养，再与包有二抗的磁性微球一起培养，最后通过分离装置。微球与靶细胞比例为50:1。清除后，单核细胞的
恢复率分别为56%和40%，CFU-GM恢复率分别为45%和38%。两例病人移植顺利并无并发症。1例4个月后复发，另1例在5个月后依然处于缓解期。实验证明，应用免疫磁性微球在自身骨髓移植前清除癌细胞是一种安全、简单、可重复的技术。
Combaret等人建立了应用免疫磁性微球净化感染了Bmrkitt淋巴瘤或神经母细胞瘤的骨髓移植的模型系统。能够可重现地清除3,4个对数级的恶性细胞，此结果与应用Burkitt淋巴瘤的补体溶解方法所得类似。对123例患神经母细胞的儿童病人在自身骨髓移植时应用免疫磁性微球进行骨髓净化，结果表明:该过程会导致单核细胞的显著损失，但对骨髓造血细胞五毒。病人表现出严重的T细胞缺陷，在移植后一年内不能检测出IL2的分泌，但NK细胞的功能在移植后一个月正常，在第二和第三个月甚至超出一般水平，在20例病人中，应用联合免疫荧光法证明自身骨髓移植包含有能够被免疫磁性微球清除的恶性细胞。 Ogniben等人对IMMS在NHL病人自身骨髓移植中的应用也做了研究。 ?用于清除白血病细胞 KorbingLI等人收集了2例复发的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的骨髓，手机时间为二次缓解期的早期。免疫磁性处理过程为姿势呢骨髓与连接在磁性微球上的一组单抗一起培养。移植前治疗
方案
气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载
为全身照射(TBI)(14.4Gy)和环磷酰胺(CY)(50mg/kg，每周2次，共4周)。自身骨髓移植后，在3例病人中都能观测到血相重建。三人在术后的无病存活期分别为26个月、24个月、27个月。其中两人的无病存活期超过了先前的缓解期(20个月和12个月)。
De Rore等人报告了65例急性白血病或NHL患者的ABMT结果。其中11例应用IMMS进行骨髓净化，31例用Maphosphamide进行骨髓净化，14例没有进行骨髓净化。免疫磁性清除过程包括一次与三种单抗(CD10、CD19、CD22)的培养，两次与磁性微球的培养。单核细胞与CFU-GH在免疫磁性净化后的恢复率分别为40%和45%，在Maphosphamide净化后恢复率分别为84%和5%。除过Maphosphamide净化后血小板的恢复率较慢小，白细胞、中性白细胞及血小板在三组病人中的恢复速度均类似。
Gruhn、Trickettti等人对IMMS在急性淋巴细胞性白血病中的应用进行了探讨。 ?在其他肿瘤的骨髓净化中的应用 Ball、Myklebust等人将IMMS应用于小细胞肺癌病人的自身骨髓移植。Shpall、Anderson等人将IMMS应用于乳腺癌病人的自身骨髓移植，对应用IMMS清除乳腺癌的最优条件进行了探讨。
?IMMS与其他骨髓净化方法的联合使用 有多项研究表明，联合应用免疫磁性微球与化学分离法会比单一应用任何一种技术更能有效地从骨髓中清除掉癌细胞，当然，这对骨髓早血细胞的损伤也较大。Anderson等人联合应用免疫磁性微球和化学分离法从正常骨髓中清除CAMA-1乳腺癌细胞。结果表明，免疫磁性分离后运用40μg/M1的4-HC清除残余的癌细胞可获得4.5个对数级的癌细胞清除率。
免疫磁性微球用于骨髓中癌细胞的清除也有一些缺点，主要是在方法学、靶细胞种类、检测方法的灵敏度等方面变异性较大，但仍不失为一种安全、简便、有效的方法。 (2)免疫磁性微球在其他方面的应用 自身骨髓移植时清除其中的癌细胞只是免疫磁性微球的一个应用，它在医药学中的应用非常广泛，如分离其他核细胞、分离细胞器、在微生物
和分子生物学上的应用等等。
?分离其他真核细胞
a(异体骨髓移植清除T细胞 自身骨髓移植为防止移植物抗宿主反应(GVHD)，需要从骨髓中有效地清除T细胞。Vartdal等对直接T细胞清除法做了改进，磁珠首先与羊抗鼠IgG相连，然后再与抗CD2和CD3的单抗体结合。用此方法清除了3个数量级的T细胞。Frame，Gee和Knobloch[42]等人也报告了相似的结果。Champlin等用免疫磁珠在异体骨髓移植前只清除其中的CD8+细胞，结果发现即可以防止GVHD，又保留了移植物抗白血病的能力。应用免疫磁性微球分离T细胞的还有A1eixo等人。
b(阳性分离干细胞 直接移植骨髓干细胞是克服异体骨髓移植时GVHD和ABMT时癌症复发的一种可能的选择，但最大的困难是如何分离出纯的造血干细胞。Cottler-Fox等采用反相分离技术，即用连有二抗的免疫磁珠和抗CD3、CD4、CD14、CD16的单克隆抗体清除掉所有非干细胞。可以获得不到2%的细胞，但其中保留了所有原先存在的造血干细胞。正相分离干细胞的方法也受到重视。如Smeland等采用直接联有抗CD34+细胞的单克隆抗体的免疫磁珠来分离干细胞，分离后用抗Fab段血清将磁性从细胞上洗脱下来，用此方法可以获得40%,70%的CD34+细胞，纯度可达95%以上。应用免疫磁性微球分离造血干细胞的文献非常多，如Law，Silvestri，Nakamura，Bigas等等。
C(组织分型 器官移植中的HLA-1和HLA-2组织分型一般采用数量细胞毒实验，首先要采用密度离心法将细胞从外周血中分离出来，步骤烦琐费时。Vardal等发展了基于免疫磁珠技术的HLA分型方法，结果表明，磁珠不影响后续的微量细胞毒分析。Lie等发现用此方法也可进行血清的BoLA分型，并且明显优于传统方法。Hanen and Hannestad更发展了应用免疫磁珠的直接分型方法。在磁珠上连接抗人多态型HLA决定族，通过评价细胞和磁珠之间形成花环的程度来直接进行分型。
d(分离其他细胞 免疫磁珠在从血液中分离、定量、分型各细胞亚类方面的应用与日聚增。Brinchmann等设计了一种快速、直接从血中定量各个淋巴细胞亚类绝对数目的方法。用免疫磁珠分离CD2+，CD4+，CD8+，CD9+后用血球计数板测定形成花环的比例。Brinchmann同时应用免疫磁珠成功地从自然感染的CD4+细胞中分离出了人类免疫缺陷病毒(HIV)，并发现活化的CD8+细胞对自然感染的CD4+细胞中的HIV复制抑制因子。Egeland等用连有免疫复合物的免疫磁珠从外周血中分离产生类风湿因子的B淋巴细胞。获得了104,106倍富集的特异性B细胞。分离后，B细胞直接用Epstein-Barr病毒转化，大量扩增，随后检测抗体的产生情况。这项技术可以用来生产单克隆抗体。从单一的抗原特异B淋巴细胞群开始可以增加克隆成功的机会并提高杂交后相关杂合体的几率。Ossendorp等用连有Thyroglobulin的免疫磁珠来与B细胞杂交瘤系形成花环，Throglobulin特异细胞浓集了300倍。其他的应用还包括分离滋养层细胞、嗜酸性细胞、郎罕氏细胞、NK细胞、内皮细胞等等。
?分离细胞器 传统上，分离细胞器都是基于细胞器大小和密度的差异，在细胞匀浆后应用密度梯度离心来实现的。但是，许多平滑膜泡没有密度差异，很难用此方法分开。另外，许多新发展起来的细胞和分子生物学技术必须用体外培养的细胞。这些细胞往往不易匀浆。应用免疫磁珠技术则可避免种类缺陷。在海得堡的欧洲分子生物实验室(EMBL)发展了一种应用免疫磁珠分离细胞器的“磁性自由流式系统”(Magnetic Free Flow Systen，MFFS)，在整
个分离和后续洗涤过程中，磁珠始终分散在整个稀释悬浮液中。调节磁场至一个合适的强度，使洗涤液自由流下的同时磁珠及其吸附物维持于瓶中，这种方式可以避免对所要分离的膜泡的损伤，因为它省去了反复浓集和重新悬浮的过程。EMBL用一对简单的抗原/抗体模型对MFFS的条件进行了优化，结果表明，他相对于传统的分离方法具有受率高、非特异吸附少、对结合物损伤小等优点。他们用此方法进行了高尔基体、内质网等的分离。 ?在微生物学上的应用 免疫磁珠在微生物学上也有广泛的用途，通过免疫反应结合于磁珠上的微生物通常可保持活性，提供给适当的营养就可以大量扩增。过程一般是将免疫磁珠与样品混合，培养10,30min，外加磁场提取结合有活微生物的磁珠。在注入合适的培养基前可以进行洗涤，单抗和多抗都可以应用。免疫磁珠技术有很多优点:将靶细菌从环境中分离出来，从很大的体积浓集至适于培养的体积;将样品中的生长抑制因子从细菌中清除去，有利于细菌的生长;当样品中既有病原菌，又有大量非致病性变种时，选择性培养基在分离靶生物时经常无能为力，而免疫磁珠在选择性分离拥有与致病力有关的特异抗原决定族的菌种方面具有很大的潜力。
结合于磁珠上的细菌可以直接在显微镜下进行分析，如对脆弱链泡囊菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌等的检测;也可以与其他检测方法结合起来进行分析。Cudjoe等首先用免疫磁珠分离出培养基和临床样品中的毒素，然后在免疫磁珠上直接用ELISA(LMB-ELISA)进行检测，他建立了用IMB-ELISA检测事物中的沙门氏杆菌的系统，对于热处理后的熟食品，增菌后的培养中仅含微量竞争肠道菌群，浓缩后可直接用IMB-PCR进行检测;对于未经过热加工的生食品，其中含有较多的竞争微生物，要先用免疫磁珠进行分离，然后在方法的全部检测时间，包括制样时间在内不超过26h。最低检测限可达105/ml样品。阳性率高于ISO，IMS-Plating，Salmonella-Tek ELISA 等方法。Bennet等则对用IMB-ELISA分离检测食品中的大肠杆菌O157进行了评价。
而越来越多的人将免疫磁珠技术与PCR结合起来，称为IMB-PCR技术。影响PCR直接应用于临床诊断的一个因素是样品中的细菌浓度。另外，冻存过的样品中可能包含死菌，不适合培养，而应用PCR则可以很好地进行检测。应用IMB-PCR进行检测的微生物包括:牙龈卟啉单孢菌、小肠结肠炎耶尔菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等。Grindede等则将免疫磁珠和转录PCR(RT-PCR)结合起来用以检测环境样品中的A型反转录病毒。最近，Lvdnerbrg等人运用免疫磁珠设计了一种固相分析技术，通过比色来检测DNA，称作固定型放大了一种固定型放大核酸检测(Dectection of Immobilized Amplifiend Nueleic Acid，DIANA)。运用这种技术可以省略去通常为排除背景干扰所要进行的电脉、内切酶谱、杂交等步骤。如果在靶区加入内标乳糖朝操纵子，然后同时扩增，即可进行定量分析。
最近，市场上出现了一种将免疫磁珠和电化学发光传染器(IMB-ECL)结合起来的自动检测系统ORIGEN，首先用免疫磁珠捕获靶物质，再用夹心的方法联上钌的三(二吡啶)螯合物Ru(bpy)2+3标记的rporter抗体，用磁场浓集后用电压激发出电化学发光。Gatto等用它来检测各种生物毒素和细菌芽孢，分析A型肉毒杆菌毒素、霍乱β亚基、蓖麻毒素、葡萄球菌内毒素B等的检测限可达fenmtogran (10-15g)。分析炭疽杆菌芽孢时，可检测到100个芽孢。
?【分子生物学上的应用】 应用于分子生物学上的磁性微球表面不是连接抗体，而是连接亲和素，通过亲和素-生物素反应与靶核酸相连。原理与免疫磁珠相似，只不是过将抗原-抗体反应换为配体-配基反应，可以称作亲和磁珠。亲和素-生物素之间的结合力非常强
(Kd=10-15)，有利于操作。解链、提取、杂交(用碱或升温)等都不会干扰DNA和磁珠之间的连接。为将生物素插入DNA链中，可以来用生物素化的引物或用Klenow聚合酶和生物素化的核苷酸进行末端标记。亲和磁珠在分子生物学上的应用可归纳于下面几个方面[80]。
a.纯化DNA结合蛋白 连接有特异核苷酸序列的亲和磁珠与样品反应，提取出结合蛋白，再加入高盐溶液就可以将纯化蛋白洗脱下来，磁珠可以反复使用。Gabrielsen等用亲和磁珠纯化DNA结合蛋白(酪母转录因子?C)，通过磁性分离，洗涤和洗脱，可以得到高纯蛋白，三次吸附过程仅用1h。
b(纯化PolyA+mRNA 将PolyT直接共价连接于或通过亲和素-生物素连接于磁性微球上即可用于分离PolyA+mRNA，分离后的mRNA可以用洗脱液或加热的方法解离下来。优点是不应用可能发生堵塞的柱子，终体积的终浓度可以控制。
C(DNA序列分析 将亲和磁珠和PCR结合起来可以进行DNA测序。这种方法特别适于自动化，可以很快地制备大量样品，供应给装有加热/冷却系统的工作站进行测序。已经应用于巨细胞病毒、沙眼衣原体、恶性疟原虫、HIVI型病毒，人类基因等。 d(固相克隆 应用亲和磁珠的固相克隆可以克隆任何片断、任何位点，不需限制性内切酶和连接酶，可以得到较高收率的重组片断。用此方法从人染色体克隆人类啊朴脂蛋白E基因片断，可以获得90%以上的正确重组体。
e(体外诱变 体外诱变有很多方法，大部分采用核苷酸介导的诱变，可以使DNA特定部位精确改变。Hultman等描述了一种运用磁性分离技术的体外诱变方法。这种诱变方法的优越性是无论用否PCR均可得到相同的结果，考虑到在克隆PCR产品时，累计聚合酶错误是一个必须注意的问题，这种用非PCR方法获得vector的固相方法非常有吸引力。另外，磁珠还用于单链DNA探针的标记和genomic Walking等。
?用免疫磁珠清除自身免疫型精子 Foresta、Shulmand等应用免疫磁性微球来清除自身免疫不育病患者精液中带有自身抗体的精子，希望有净化的精子进行体外或受精来治疗自身免疫不育症。Vigano发现，这种方法可以清除掉50%的IgL标记的精子，精子运动和完整性实验证明磁珠对精子的性质没有影响。Ohashi等则用免疫磁珠进行了分离顶体反应精子的尝试。
?用IMB-PCR检测循环系统中的癌细胞
血液是癌扩散的一个重要途径，对血液中癌细胞的检测可能成为临床医生预测癌症复发、选择更加合适的辅助治疗方法的重要工具。Hardingham等发展了用IMB-PCR来检测血液中分离出癌细胞，用PCR-RFLP检测细胞k-ras基因的第12密码子的突变情况。可以重复地检测出样品中小于10pg的DNA(〈lcell〉。在随后的临床实验中，用此方法对27例编码突变病人的血液进行了检测。9例发现有癌细胞的病人中，7人因为复发后转移而死亡。其余18例发现有癌细胞的病人中，16人没有复发(中期检查:16个月，范围7,42个月)。Kaplan-Meier分析表明血液中K-ras突变细胞的检测结果与无病存活期显著相关(p=0.0001)。Mass等则用IHB-RT-PCR对人乳腺癌细胞中广谱抗药基因1(MDR1)的信使RNA水平进行了检测。
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细胞培养入门
细胞培养从头学-----___细胞和分子免疫学实验技术_0.pdf
【1】常用设备
1.1准备室的设备:
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品规(放置消毒过的物品)、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平(称量药品)、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。
1.2培养室的设备:
液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80?)、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。必须放在无菌间的设备:离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4?冰箱(放置serum和培养用液)。
无菌操作
1.3无菌室的灭菌:
1、定期打扫无菌室:每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5,过氧乙酸擦拭。
2、CO2孵箱(培养箱)灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75,酒精擦拭或者0.5,过氧乙酸，再用紫外灯照射
3、实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟 4、实验后灭菌:用75,酒精(3‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 实验人员的无菌准备:
1、肥皂洗手。
2、穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3、用75,酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示:
1、凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75,酒精擦拭瓶子的外表面
2、靠近酒精灯火焰操作。
3、器皿使用前必须过火灭菌
4、继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处，使用时仍要过火。
5、各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6、吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消:
一、新的玻璃器皿的洗消:
1、自来水刷洗，除去灰尘。
2、烘干、泡盐酸:烤箱中烘干，然后再浸入5,稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。 3、刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4、泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。 5、烘干、包装:洗干净后先烘干，然后用牛皮纸(油光纸)包装。
6、高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7、高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消:
1、刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2、泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液)，12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗)，再用蒸馏水冲洗3次。
3、烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4、高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当
指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上) 5、烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75,酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压(30分钟)消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料:
橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序:
1、针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2、胶塞烘干后用2,氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟)，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3、胶帽，离心管帽烘干后只能在2,氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(切记时间不能过长)，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4、胶头可用75,酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5、塑料培养瓶，培养板，冻存管:
6、其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70,酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时__这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻(CoC12?6H2o)2g，30,盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项:
1、严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2、安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3、注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。
细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂:
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。 具体步骤:
一、水的制备:
细胞培养用水必须非常纯净【超纯净水】，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
二、PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如:Hanks，D-Hanks液的配制): 1、溶解定容:将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
2、移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒:
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37?时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如:D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1、称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25,，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀，置于4?内过夜。
2、用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20?保存以备使用。
四、青、链霉素溶液的配制于消毒
1、所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。
2、具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
3、使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位,1微克, 五、RPMI1640的制备与消毒:
1、溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
2、安装蔡式滤器:安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3、抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 4、分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4?冰箱内待用。
5、使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4?时两周有效)。 六、血清的灭火:
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56?水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
七、HEPES溶液:
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N?-a-hydroxythylpiperazine-N?- ethanesulfanic
acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4?保存。 注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。 八、谷氨酰胺:
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4?下放置1周可分解50,，故应单独配制，
置于-20?冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4?冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1,4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20?保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
九、肝素溶液的配制:
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为?。使用时，向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。
十、?型胶原酶:
0.1,?型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为?型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20?保存。 十一、【明胶溶液】:
因为明胶难于过滤，所以配制0.1,明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4?保存。
其他培养用液的配制:
20ug/ml内皮生长因子，
注意事项:
1、配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2、安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3、配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
细胞传代培养(消化法)
具体操作:
一、传代前准备:
1、预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37?水浴锅
内预热。
2、用75,酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3、正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4、点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
5、准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6、取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7、从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8、打开瓶口:将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
二、胰蛋白酶消化;
1、加入消化液:小心吸出旧培养液，用PBS清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37?。
2、显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3、吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三、吹打分散细胞:
1、吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2、吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3、平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4、弃上清液，加入新培养液:弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四、分装稀释细胞:
1、分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2、显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
五、继续培养:
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25,时为一个，，占50,为，，，占75,时为，，，。
传代细胞培养注意事项:
1、严格的无菌操作
2、适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附:EDTA(0.02,乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5,酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。 细胞的复苏
细胞复苏的原则,快速融化:必须将冻存在-196?液氮中的细胞快速融化至37?，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作
一、实验前准备:
1、将水浴锅预热至37?
2、用75,酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 二、取出冻存管:
1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
三、迅速解冻:
1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2、约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
四、平衡离心:
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
五、制备细胞悬液:
1、吸弃上清液。
2、向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
六、细胞计数:
细胞浓度以5×105/ml为宜。
七、培养细胞
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37?和5,CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误:
1、水浴锅未预热或者未预热到37?。
2、水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3、离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4、一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 细胞计数
实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作:
一、准备工作:
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。
二、细胞悬液制备:
细胞悬液的制备方法是用0.25,的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液)，吹打制成待测细胞悬液。
三、细胞计数:
1、盖好盖玻片:取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2、制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液(0.4,)或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3、将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4、统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml, ( 四个大格子细胞数/4) ×2×104 说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高),0.1mm3 而 1ml,1000mm3 四、细胞计数要点:
1、进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;
2、要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3、取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确;
4、数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5、操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 五、初学者易犯的错误:
1、计数前未将待测悬液吹打均匀。
2、滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3、滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六、本实验特殊试剂的配制:
4,台盼蓝母液:称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4?保存。
使用液:使用时，用PBS稀释母液至0.4,即可。
细胞的冻存
1、先将冻存管放入4?冰箱，约40min。
2、接着置于-20?冰箱，约30-60min。
3、置于-80超低温冰箱中放置过夜。
4、置于液氮罐中长期保存。
5、同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项:
1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2、不宜将冻存细胞放置在0?,-60?这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
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《精编免疫学实验指南》是国际权威的生命科学实验方法学丛书之《现代免疫学方法》的精华版，共15章。分别介绍了多克隆抗体和单克隆抗体的制备、纯化和鉴定，人和小鼠T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞等及其亚群的分离、鉴定和各种功能分析，T细胞、B细胞克隆和T细胞杂交瘤的构建，细胞因子及其受体和分泌细胞因子细胞的检测，免疫细胞活化的信号分子分析，用分子生物学方法制备Fv、构建噬菌体抗体库和研究TCR等免疫分子等。还介绍了构建自身免疫病、炎症性疾病和感染性疾病等的动物模型的方法。
【内容】涵盖目前免疫学常用实验技术的基本原理、标准方案和最新进展，具有简明规范、
步骤清晰、可行性强等特点。
目录---------------------------
前言
第一章免疫应答导论
单元1.1酶联免疫吸附试验
基本方案间接ELISA法检测特异性抗体
备选方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原
备选方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原
备选方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体
备选方案4夹心ELISA法检测同种型
备选方案5直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原
备选方案6间接细胞ELISA法检测抗细胞表面抗原的特异性抗体
辅助方案十字交叉连续稀释分析法(criss-crossserial-dilutionanalysis)测定试剂最适浓
度
单元1.2多克隆抗血清的制备
基本方案使用弗氏佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法
备选方案使用其他佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法
辅助方案从血液中制备血清
单元1.3单克隆抗体的制备
基本方案1单克隆抗体制备中的免疫接种
基本方案2细胞融合与杂交瘤分选
辅助方案1杂交瘤培养上清的筛选分析
辅助方案2杂交瘤的建系
辅助方案3有限稀释克隆法
辅助方案4克隆和扩增用培养基的制备
单元1.4单克隆抗体培养上清与腹水的制备
基本方案1单克隆细胞培养上清的制备
备选方案1单克隆细胞培养上清的大规模制备
备选方案2杂交瘤或细胞系细胞的大规模制备
基本方案2含有单克隆抗体的腹水制备
单元1.5免疫球蛋白G(IgG)的纯化
基本方案1硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析
基本方案2蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析
备选方案1蛋白G交联琼脂糖凝胶亲和层析
备选方案2抗大鼠κ链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶亲和层析
单元1.6免疫球蛋白G(IgG)片段的水解
基本方案1木瓜蛋白酶水解IgG成Fab片段摸索性试验
基本方案2木瓜蛋白酶水解IgG获取Fab片段的大量制备
基本方案3胃蛋白酶水解IgG成F(ab′)2片段的摸索性试验
基本方案4胃蛋白酶水解IgG获取F(ab′)2片段的大量制备
备选方案用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG制备F(ab)2
单元1.7免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白D(IgD)的纯化
基本方案1用透析和凝胶过滤层析法纯化IgM
备选方案1硫酸铵沉淀法纯化IgM
备选方案2甘露聚糖结合蛋白亲和纯化IgM
备选方案3IgM纯化试剂盒
基本方案2凝集素亲和层析法纯化小鼠IgD
单元1.8抗体可变区(V区)的克隆、表达和修饰
基本方案1通过使用冗余引物克隆和表达免疫球蛋白可变区
辅助方案TA载体的制备
基本方案2用ELISA法鉴定转染细胞分泌的抗体分子
基本方案3转染细胞分泌抗体分子的鉴定
单元1.9核酸免疫
基本方案1小鼠注射接种DNA
基本方案2小鼠基因枪接种DNA
辅助方案1包裹DNA的金粉颗粒的制备
辅助方案2制备包裹有DNA的金粉颗粒的样品管
辅助方案3基因枪接种中氦气压力和颗粒大小的最优化
第二章小鼠淋巴细胞功能的体内体外分析
单元2.1小鼠单个核细胞的分离
基本方案从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液
辅助方案1去除脾脏细胞悬液中的红细胞
辅助方案2一步梯度法去除死细胞
单元2.2磁珠法分离T细胞和B细胞---------------------------力有多大,
基本方案1用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4+细胞或CD8+T细胞的自动分离
基本方案2使用AUTOMACS系统进行B细胞的自动分选
基本方案3使用AUTOMACS系统进行辅助细胞的自动分选
备选方案1用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞
基本方案4用AUTOMACS系统自动分选CD4+CD25+抑制性细胞
备选方案2用磁性分选柱手工操作分离CD4+CD25+抑制性细胞----------------------------力
有多大,
单元2.3树突细胞的分离
基本方案1塑料黏附和EA玫瑰花结富集DC
辅助方案胶原酶消化制备脾脏细胞悬液
基本方案2用小鼠骨髓前体细胞培养树突细胞(DC)
单元2.4从小鼠脾脏分离小鼠天然杀伤细胞
基本方案
单元2.5B细胞功能的检测
基本方案1抗原特异性的抗体产生
基本方案2Jerne-NordinPFC测定法
基本方案3Cunningham-SzenbergPFC测定法
备选方案1改良Jerne-NordinPFC测定法用于型特异性反应
备选方案2改良Jerne-NordinPFC测定法用于测定多克隆抗体反应
辅助方案1制备琼脂糖包被的玻片
辅助方案2制备Cunningham-Szenberg小室
辅助方案3三硝基苯半抗原(TNP)偶联SRBC
辅助方案4蛋白质A偶联SRBC
辅助方案5制备TNP-卵白蛋白
辅助方案6用Percoll梯度离心纯化静息B细胞
单元2.6B淋巴细胞活化的早期事件
基本方案1BCR诱导的B细胞内钙变化
基本方案2蛋白质酪氨酸磷酸化的分析
基本方案3细胞大小与B细胞活化分子表达的分析
单元2.7B细胞功能的增殖检测方法
基本方案抗IgM与LPS刺激的B细胞增殖
备选方案1用8-巯基喹啉(8-MG)刺激B细胞多克隆活化
备选方案2用蛋白激酶C激活剂及钙离子载体刺激B细胞多克隆活化
备选方案3硫酸葡聚糖与poly(I?C)刺激B细胞多克隆活化
备选方案4细胞数量增加的定量
单元2.8BrdU检测T细胞和B细胞增殖
基本方案
单元2.9采用细胞内荧光染料CFSE检测淋巴细胞的迁移和增殖
基本方案淋巴细胞的CFSE标记
辅助方案流式细胞仪分析CFSE标记的细胞
单元2.10细胞毒性T淋巴细胞的诱导及检测
基本方案1从CTL前体中诱导细胞毒性
基本方案2铬释放法分析CTL活性
辅助方案1次要组织相容性抗原的小鼠体内应答
辅助方案2病毒抗原体内免疫小鼠
辅助方案3TNP修饰靶,刺激细胞
辅助方案4病毒感染靶,刺激细胞
备选方案1多克隆CTL活性的诱导
备选方案2CTL再定向杀伤活性的检测
单元2.11T淋巴细胞增殖实验
基本方案1未致敏T淋巴细胞的活化
备选方案1用抗体激活未致敏的T细胞
备选方案2混合淋巴细胞增殖实验
辅助方案1从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T淋巴细胞
辅助方案2辅助,刺激细胞的灭活
基本方案2致敏T细胞的活化
基本方案3CD4+CD25+T细胞的活化和抑制功能的检测
备选方案3CD4+CD25+T细胞抑制功能的两步法检测:短期活化和扩增CD4+CD25+T
细胞并分析其抑制功能
单元2.12T细胞克隆的建立
基本方案1产生和维持同种反应性Th和CTL克隆
基本方案2用可溶性蛋白抗原诱导Th克隆
辅助方案1制备刀豆蛋白A活化的上清(ConA上清)
辅助方案2制备混合淋巴细胞培养上清(MLC上清)
辅助方案3制备PMA激活的EL-4淋巴瘤细胞上清(EL-4上清)
辅助方案4用显微操作的方法克隆
单元2.13制备小鼠T细胞杂交瘤
基本方案细胞融合和T细胞杂交瘤的选择
辅助方案1筛选表达CD3-TCR原始杂交瘤
辅助方案2筛选抗原特异性的杂交瘤
单元2.14检测凋亡和其他形式的细胞死亡
基本方案1用活细胞或荧光染料定量细胞活性
基本方案2DNA裂解片段的定量
备选方案计数放射性标记的DNA定量细胞中DNA片段
辅助方案1用125IUdR和51Cr放射性标记细胞核
辅助方案2用3HTdR放射性标记细胞核
第三章细胞活化的生物化学
单元3.1淋巴细胞活化过程中肌醇磷脂周转的分析
基本方案1通过道威克斯(DOWEX)离子交换层析分析,3H,肌醇磷酸
备选方案通过HPLC方法分析,3H,肌醇磷酸
基本方案2通过薄层层析方法分析肌醇磷脂
单元3.2抗磷酸化酪氨酸的印迹检测
基本方案抗磷酸化酪氨酸印迹检测的准备及分析
备选方案使用125I标记蛋白A进行检测
单元3.3免疫复合物方法检测酪氨酸蛋白激酶
基本方案酪氨酸蛋白激酶的免疫沉淀和自身磷酸化检测
备选方案1蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测
备选方案2蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测
单元3.4识别特异性酪氨酸磷酸化多肽抗体的制备
基本方案1多克隆抗磷酸肽抗体的制备
基本方案2制备抗磷酸肽的单克隆抗体
辅助方案1肽的合成
辅助方案2肽段偶联到Affi-Gel10亲和性基质
辅助方案3磷酸酪氨酸偶联到Affi-Gel10亲和基质
单元3.5T细胞中丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)活性分析
基本方案1免疫复合物蛋白激酶测定
基本方案2固相蛋白激酶法检测JNK活性
基本方案3SDS-PAGE后原位检测JNK蛋白激酶活性,“胶内”(IN-GEL)激酶测定,
基本方案4利用磷酸化位点特异性抗体检测MAPK的活化
辅助方案制备GST-MAPK底物融合蛋白
单元3.6脂筏的分离和应用
基本方案通过蔗糖梯度浮选法制备去污剂抗性的膜并通过免疫印迹对蛋白质进行分析
备选方案用离心法制备去污剂抗性的膜
辅助方案1脉冲追踪方法分析去污剂抗性的膜蛋白
辅助方案2通过放射性标记检测去污剂抗性的膜蛋白的全部组分
辅助方案3定量高效薄层色谱法(HP-TLC)进行DRM脂质分析
辅助方案4DEAE葡聚糖凝胶的制备
辅助方案5C18反相色谱柱的制备
辅助方案6用甲基-β-环式糊精去除胆固醇来破坏脂筏
辅助方案7甲基-β-环式糊精(MBCD)处理去除胆固醇的动力学测定
辅助方案8使用MBCD-胆固醇复合物进行细胞胆固醇去除
第四章免疫荧光和细胞分离
单元4.1细胞制备和试剂
基本方案1单细胞表面抗原的免疫荧光标记
基本方案2固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记
辅助方案1用异硫氰酸荧光黄(FITC)偶联抗体
辅助方案2长臂生物素偶联抗体
备选方案1未固定细胞胞内抗原的免疫荧光检测
备选方案2用7-氨基放线菌素D(7-AAD)标记死细胞
单元4.2流式细胞仪分析技术-BD公司出品的流式细胞仪
基本方案FITC偶联抗体的单色分析
辅助方案1用校准微球和FACSComp软件进行仪器检测
辅助方案2单色分析区分活细胞和死细胞
备选方案1FITC和PE偶联抗体的双色分析
辅助方案3双色分析区分活细胞和死细胞
备选方案2三色分析
备选方案3四色分析
第五章细胞因子及其受体
单元5.1IL-2和IL-4的检测
基本方案采用CTLL-2细胞检测小鼠IL-2和IL-4
备选方案1采用CTLL-2细胞检测人IL-2
备选方案2采用CT.4S细胞检测小鼠IL-4
备选方案3采用CT.h4S细胞检测人IL-4
辅助方案1白细胞介素或T细胞生长因子(TCGF)单位的计算
辅助方案2小鼠CTLL-2细胞的维持
辅助方案3小鼠CT.4S细胞的维持
辅助方案4小鼠CT.h4S细胞的维持
单元5.2IL-10的检测
基本方案
单元5.3IL-12的检测
基本方案人和小鼠IL-12p75异二聚体的ELISA检测方法
备选方案人和小鼠IL-12p40亚基的ELISA检测
单元5.4IL-13的检测
基本方案
单元5.5IL-15的检测
基本方案
单元5.6IL-18的检测
基本方案
单元5.7γ干扰素的检测
基本方案
单元5.8流式细胞仪检测细胞内因子
基本方案细胞内因子的荧光标记
辅助方案1PMA和ionomycin激活T细胞
辅助方案2抗原活化T细胞
辅助方案3固定和冻存PBMC
辅助方案4PBMC的细胞表面标记
辅助方案5用荧光标记的抗细胞因子抗体标记活化细胞内的细胞因子
单元5.9流式细胞仪检测细胞因子受体
基本方案用抗受体单克隆抗体检测人和小鼠的细胞因子受体
备选方案1用标记的细胞因子检测细胞因子受体
备选方案2多参数分析检测淋巴细胞亚群细胞因子受体的表达
辅助方案1单克隆抗体和细胞因子的滴定
辅助方案2评价检测试剂
单元5.10用流式细胞仪检测细胞因子的分泌和分离分泌细胞因子的细胞
基本方案细胞因子分泌实验
备选方案1PBMC分泌细胞因子的快速检测
备选方案2全血细胞分泌细胞因子的快速检测
单元5.11ELISPOT方法检测分泌细胞因子的细胞
基本方案
单元5.12α-、β-和γ-干扰素诱导的抗病毒活性的检测
基本方案小鼠干扰素诱导的抗病毒活性的检测
辅助方案1病毒培养体系的建立
辅助方案2抗体中和实验
备选方案人干扰素诱导的抗病毒活性的检测
单元5.13趋化因子超家族的生物学反应
基本方案1微型趋化实验检测趋化因子对粒细胞的趋化
备选方案1微型趋化实验检测趋化因子对单核细胞的趋化
备选方案2微型趋化实验检测趋化因子对淋巴细胞的趋化
辅助方案细胞外基质蛋白包被聚碳酸酯膜
基本方案2趋化因子诱导的淋巴细胞内游离钙离子的检测
第六章天然免疫
单元6.1小鼠巨噬细胞的分离
基本方案1小鼠腹腔巨噬细胞的分离
基本方案2小鼠骨髓巨噬细胞的分离和培养
单元6.2小鼠巨噬细胞的表型检测
基本方案直标法检测小鼠巨噬细胞的表型
备选方案间标法检测小鼠巨噬细胞的表型
单元6.3人单核,巨噬细胞的表型检测
基本方案
单元6.4小鼠巨噬细胞的活化
基本方案小鼠巨噬细胞的活化
辅助方案炎性小鼠巨噬细胞的活化
单元6.5巨噬细胞一氧化氮的检测
基本方案
单元6.6巨噬细胞吞噬功能和杀伤功能的检测
基本方案1巨噬细胞吞噬功能的检测
辅助方案利用FITC区分胞外黏附和胞内吞噬的细菌
基本方案2巨噬细胞杀伤功能的检测
辅助方案单核细胞增多性利斯特氏菌的制备
单元6.7巨噬细胞抗肿瘤活性的检测
基本方案,111In,释放法检测巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
辅助方案,111In,标记肿瘤靶细胞
单元6.8Fcγ受体介导的黏附作用和吞噬作用的检测
基本方案Fcγ受体介导的吞噬作用
辅助方案FcγR介导的黏附作用
单元6.9干扰素介导的抗肿瘤作用
基本方案
单元6.10人NKT细胞的分离和扩增
基本方案1NKT细胞的鉴定
基本方案2免疫磁珠法分离NKT细胞及后续扩增-----------------磁珠和细胞结合强度是多
少,
备选方案1NKT细胞的流式分选及扩增
备选方案2NKT细胞的克隆
辅助方案NKT细胞的二次刺激和克隆
第七章抗原加工处理和呈递
单元7.1抗原呈递细胞的选择和制备
基本方案通过利斯特氏菌刺激制备腹腔巨噬细胞
备选方案1连续注射利斯特氏菌和蛋白胨后制备腹腔巨噬细胞
辅助方案1小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制备
备选方案2ConA刺激的腹腔巨噬细胞的制备
备选方案3骨髓来源的巨噬细胞的制备
辅助方案2制备L929条件培养基
备选方案4制备LPS刺激的B细胞
单元7.2外源性抗原向T细胞的呈递
基本方案一种抗原加工处理和呈递的检测体系
备选方案1用固定后的贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽
备选方案2用固定后的非贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽
备选方案3蛋白抗原致敏的细胞固定后检测抗原加工和处理
第八章人类免疫学研究
单元8.1外周血和脐带血中分离单个核细胞
基本方案Ficoll-Hypaque梯度离心法分离单个核细胞
辅助方案贴壁法去除单个核细胞中的单核细胞和巨噬细胞
单元8.2T细胞亚群的分离纯化
基本方案间接淘洗法分离T细胞亚群
备选方案抗体依赖补体介导的细胞毒作用分离T细胞亚群
辅助方案1应用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞
辅助方案2应用AET处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞
单元8.3免疫磁珠法纯化T细胞
基本方案
单元8.4免疫磁珠法分离B细胞亚群
基本方案
单元8.5单核细胞,巨噬细胞的分离
基本方案1贴壁法分离单核细胞
基本方案2根据大小沉降作用分离单核细胞
基本方案3对流离心洗淘法分离单核细胞
单元8.6人自然杀伤细胞的分离
基本方案从PBMC分离人NK细胞
辅助方案阴性选择分离NK细胞的单克隆抗体的滴定
单元8.7流式细胞仪检测全血的人淋巴细胞
基本方案
单元8.8淋巴细胞增殖实验
基本方案丝裂原诱导的外周血单个核细胞增殖实验
备选方案1单向混合淋巴细胞反应
备选方案2抗原诱导的T细胞增殖实验
辅助方案3HTdR掺入和细胞收集
单元8.9B细胞分泌抗体的检测
基本方案
单元8.10ELISA检测抗体的含量
基本方案
单元8.11ELISPOT检测抗体的含量
基本方案ELISPOT检测分泌抗体的细胞
备选方案用ELISPOT检测仪检测分泌抗体的细胞
单元8.12抗体的体内诱导和检测
基本方案1蛋白质或多糖抗原体内法诱导抗体的产生
基本方案2ELISA法检测体内抗体的产生
辅助方案肺炎球菌多糖与蛋白质的偶联
单元8.13T细胞杀伤功能的检测
基本方案1抗CD3诱导的T细胞杀伤实验
基本方案2抗原诱导的特异性T细胞杀伤功能的检测
单元8.14NK,LAK细胞杀伤活性的检测
基本方案51Cr释放法检测NK,LAK细胞杀伤活性
辅助方案肿瘤靶细胞的制备和标记
单元8.15人T细胞的克隆和扩增
基本方案1抗原特异性T细胞的诱导
基本方案2Th1或Th2细胞的诱导
辅助方案1T细胞的克隆
辅助方案2克隆后T细胞的扩增
辅助方案3T细胞克隆的冻存
单元8.16制备EBV转化的B细胞
基本方案
单元8.17分离人肠黏膜单个核细胞
基本方案分离人肠黏膜单个核细胞
辅助方案用尼龙毛过滤器去除死细胞
单元8.18人树突细胞分离和培养
基本方案1从外周单个核细胞中分离人树突细胞
备选方案免疫磁珠法分离树突细胞
基本方案2用单核细胞诱导人树突细胞
单元8.19分离和鉴定人自然杀伤细胞亚群
基本方案从PBMC中分离人NK细胞
辅助方案人NK细胞亚群的表型和功能分析
第九章HIV的检测与分析
单元9.1外周血中HIV的分离和定量检测
基本方案1外周血中HIV的培养以及通过TCID定量来测定其滴度
基本方案2感染同种异型T淋巴母细胞:原代分离PBMC中的HIV
辅助方案评估HIV对CD4+靶细胞的致细胞病变效应:HIV介导的细胞死亡
单元9.2感染CD4+原代细胞系及HIV的诱导
基本方案1用HIV体外急性感染CD4+原代细胞及细胞系
基本方案2建立HIV慢性感染细胞系
基本方案3慢性感染细胞系中HIV的诱导
单元9.3在单核细胞和巨噬细胞中培养HIV
基本方案单核细胞来源的巨噬细胞培养和HIV感染
备选方案用HIV悬液感染单核细胞来源的巨噬细胞
辅助方案1扩增实验室保存的亲巨噬细胞的HIV-1病毒株
辅助方案2扩增原代分离的亲巨噬细胞的HIV-1病毒株
单元9.4HIV蛋白的检测
基本方案1免疫印迹法检测HIV蛋白
基本方案2免疫荧光法检测HIV蛋白
备选方案流式细胞仪分析细胞内HIV蛋白
基本方案3HIV反转录酶活性检测
单元9.5用PCR检测HIV的DNA及RNA
基本方案1用PCR扩增及检测HIV的DNA
基本方案2用RT-PCR检测HIV的RNA
单元9.6体外评价各种制剂的抗HIV活性
基本方案1保护靶T细胞免受HIV致细胞病变效应
基本方案2表达CD4的HeLa细胞合胞体斑形成抑制试验
基本方案3ELISA检测抗病毒剂对PBMC中HIVp24抗原产生的抑制作用
辅助方案50%抑制浓度(IC50)的计算
单元9.7基于痘苗病毒报道基因细胞融合检测法定量功能性测定HIV包膜糖蛋白与受体
的相互作用
基本方案用质粒表达包膜蛋白及受体进行融合检测
备选方案1用重组病毒对各种成分的融合试验
备选方案2活化的可溶性CD4融合检测
辅助方案1比色法测定融合依赖的报道基因活性
辅助方案2原位染色测定报道基因活性
第十章自身免疫性及炎症性疾病动物模型
单元10.1小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
基本方案应用PLP和MBP蛋白或多肽主动诱导EAE
备选方案MBP或PLP特异性淋巴细胞被动转移性诱导EAE
辅助方案1PLP蛋白的纯化
辅助方案2MBP蛋白的纯化
单元10.2大鼠佐剂性关节炎
基本方案佐剂性关节炎的诱导
辅助方案分枝杆菌悬液的制备
单元10.3胶原诱导性关节炎
基本方案诱导小鼠胶原性关节炎
辅助方案1II型胶原(CII)的纯化
辅助方案2胶原(II)α1链的纯化
辅助方案3胶原(II)α1链内溴化氰裂解片段的纯化
辅助方案4小鼠关节炎的评定
辅助方案5检测CIA小鼠T细胞对CII的增殖应答
单元10.4小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎
基本方案1实验性自身免疫性甲状腺炎的诱导和评定
辅助方案小鼠甲状腺球蛋白的制备
基本方案2诱导EAT耐受
单元10.5小鼠实验性自身免疫性重症肌无力
基本方案EAMG的诱导和评定
辅助方案1AChR的抽提与亲和纯化
辅助方案2神经毒素3-琼脂糖的制备
辅助方案3应用肌电图评定EAMG
辅助方案4通过检测抗AChR抗体来评定EAMG
辅助方案5小鼠肌肉AChR的制备
单元10.6NOD小鼠:一种胰岛素依赖性糖尿病模型
基本方案1无特殊病原菌(SPF)级NOD小鼠的饲养
基本方案2胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的诊断
备选方案半定量胰岛炎以作为进展为IDDM的亚临床表现
辅助方案胰腺中胰岛细胞的分离
单元10.7通过耗竭调节性T细胞诱导自身免疫性疾病
基本方案通过胸腺切除术诱导年轻的成年大鼠糖尿病
备选方案应用胸腺切除术诱导3周龄大鼠糖尿病
单元10.8通过耗竭调节性T细胞诱导免疫缺陷小鼠炎症性肠道疾病
基本方案转输CD45RBhighCD4+T细胞诱导SCID小鼠IBD
辅助方案监测IBD进展
单元10.9气道高反应性动物模型
基本方案应用OVA全身致敏及气道激发诱导气道超敏反应
辅助方案1使用全身体积气压描记器非侵入性检测气道反应性
备选方案OVA致敏气道诱导气道超敏反应
辅助方案2体外检测气道对电场刺激的反应性
辅助方案3T细胞功能和气道炎症的评定
单元10.10诱导小鼠TNBS结肠炎
基本方案小鼠TNBS结肠炎的诱导和评定
辅助方案1分离小鼠肠系膜淋巴结细胞
辅助方案2分离结肠炎小鼠的黏膜固有层细胞
单元10.11系统性红斑狼疮动物模型
基本方案1ELISA检测小鼠血清中抗染色质抗体
基本方案2单链和双链DNA抗体的检测
基本方案3ELISA检测类风湿因子
基本方案4ELISA检测同种异型特异性抗体时标准曲线的制作
备选方案ELISPOT检测抗染色质抗体形成细胞
辅助方案1低渗裂解鸡红细胞核制备鸡染色质
辅助方案2dsDNA的制备
辅助方案3基于PCR技术的faslpr突变体和fasLgld突变体的基因分型
第十一章传染性疾病动物模型
单元11.1利什曼原虫感染的小鼠模型
基本方案皮肤利什曼原虫病小鼠模型
辅助方案1使用花生凝集素制备后发育期前鞭毛体
辅助方案2从足垫组织中纯化无鞭毛体
辅助方案3前鞭毛体和无鞭毛体的冷藏和复苏
辅助方案4血琼脂培养板的制备
单元11.2弓形虫感染动物模型
基本方案1诱导小鼠急性弓形虫T.gondii感染
基本方案2小鼠慢性弓形虫脑炎模型
基本方案3感染T.gondii的重症联合免疫缺陷小鼠
基本方案4温度敏感的TS-4T.gondii菌株的感染模型
辅助方案1对T.gondii感染进展和免疫应答的评估
辅助方案2ME49T.gondii包囊种子库的维持和保存
辅助方案3用人类包皮成纤维细胞保存T.gondii速殖子
辅助方案4小鼠体内保存T.gondii速殖子
辅助方案5T.gondii裂解物抗原的准备
单元11.3巨细胞病毒感染小鼠模型的建立
基本方案巨细胞病毒感染小鼠模型
辅助方案1巨细胞病毒的准备
辅助方案2唾液腺病毒的制备
辅助方案3用空斑形成细胞试验测定巨细胞病毒滴度
辅助方案4原代小鼠胚胎成纤维细胞的制备
单元11.4单核细胞增生性利斯特氏菌感染动物模型
基本方案用单核细胞增生性利斯特氏菌株感染小鼠
辅助方案1小鼠感染利斯特氏菌后的特异性和固有免疫反应评估
辅助方案2利斯特氏菌特异性T细胞的制备
单元11.5淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染动物模型
基本方案1全身性感染LCMV小鼠模型
基本方案2LCMV病毒持续感染小鼠模型
基本方案3T细胞对LCMV免疫反应的测定
基本方案4LCMV疫苗效果的体内检测
辅助方案1LCMV病毒储存液的制备
辅助方案2噬菌斑试验测定LCMV病毒滴度
辅助方案3ELISA检测LCMV抗体
单元11.6流感病毒
基本方案1流感病毒鼻腔内感染麻醉的小鼠
备选方案流感病毒鼻腔内感染未麻醉小鼠
辅助方案1流感病毒在鸡胚中扩增
辅助方案2鸡胚尿囊液内流感病毒滴度的测定
辅助方案3MDCK细胞的长期培养
辅助方案4培养组织流感病毒感染剂量(TCID50)的测定
辅助方案5小鼠50%致死剂量(MLD50)和小鼠50%感染剂量(MID50)
辅助方案6检测流感病毒滴度的小鼠肺脏制备
辅助方案7流感病毒储存液中血凝单位的测定
辅助方案8小鼠血清的血凝抑制试验(HAI)
辅助方案9流感病毒储存液(原液)的系列稀释
基本方案2从脾脏前体细胞获得流感病毒特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTL)
基本方案3收集含抗流感病毒CTL的肺脏细胞
辅助方案10流感病毒中和试验
第十二章蛋白质分离和分析
单元12.1免疫亲和层析
基本方案可溶性或膜结合抗原的分离
备选方案1抗原低pH洗脱
备选方案2用辛烷基β-D-葡糖苷洗脱抗原
单元12.2免疫沉淀
基本方案1用非变性去垢剂裂解细胞制成的悬液进行免疫沉淀
备选方案1用含非变性去垢剂溶液裂解的贴壁细胞进行免疫沉淀
备选方案2用含变性去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀
备选方案3用无去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀
备选方案4用抗体-Sepharose进行免疫沉淀
辅助方案抗体Sepharose的制备
备选方案5用与ANTI-Ig结合的放射性标记的抗原进行免疫沉淀
基本方案2再次捕获免疫沉淀
单元12.3单向蛋白质凝胶电泳
基本方案
单元12.4凝胶蛋白质染色
基本方案1考马斯亮蓝染色
基本方案2银染
基本方案3SYPROOrange或SYPRORed荧光染色
基本方案4SYPRORuby荧光染色
备选方案1聚丙烯酰胺凝胶上磷蛋白的特异性荧光染色
辅助方案磷酸酪氨酸残基的特异性检测
备选方案2同一块凝胶上的糖基化蛋白和非糖基化蛋白的差异性荧光染色
单元12.5免疫印迹和免疫检测
基本方案1液体容器中的蛋白质印迹
备选方案1半干胶系统蛋白质印迹
辅助方案1转移蛋白的可逆染色
基本方案2采用二抗检测的免疫探针法
备选方案2亲和素生物素化二抗的免疫探针法
基本方案3生色底物显色
备选方案3生色底物显色
辅助方案2膜蛋白解离与再生
第十三章肽
单元13.1合成肽用以制备识别完整蛋白质的抗体
基本方案1通过计算机辅助方法选择合适的抗原肽序列
备选方案1通过人工筛查挑选合适的肽序列
基本方案2设计一条肽链与载体蛋白相偶联
备选方案2设计合成一条多价抗原肽
基本方案3使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白
备选方案3使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白
辅助方案计算肽连接到载体蛋白上的摩尔率
单元13.2抗多肽血清的制备
基本方案1在兔体内制备抗多肽血清的免疫接种流程
基本方案2用间接ELISA法检测抗多肽抗体滴度
基本方案3使用酸性、碱性或离液洗脱液的亲和层析柱
辅助方案1预先溶胀的NHS或CNBr活化树脂的肽免疫亲和层析柱的制备
辅助方案2巯基化树脂填充的肽亲和层析柱的制备
单元13.3采用合成肽组合库鉴定B细胞和T细胞的表位
基本方案1采用PS-SCL筛选抗体抑制剂
基本方案2筛查PS-SCL鉴定CD4+或CD8+T细胞的配体
辅助方案优化用于筛查的抗原和抗体浓度
第十四章分子生物学
单元14.1293T细胞包装和扩增反转录病毒
基本方案1磷酸钙,DNA沉淀瞬时转染Phoenix反转录包装细胞
备选方案1水疱性口炎病毒G蛋白的假型反转录病毒
辅助方案1水疱性口炎病毒G蛋白假型反转录病毒的浓缩和低温储存
辅助方案2Phoenix细胞的培养
基本方案2感染贴壁细胞
备选方案2贴壁细胞快速(spin)感染(见基本方案2)
备选方案3悬浮细胞的快速(spin)感染
单元14.2免疫球蛋白融合蛋白的构建
基本方案1免疫球蛋白融合蛋白的构建
基本方案2免疫球蛋白融合基因分析
单元14.3单链抗体的噬菌体展示技术
基本方案1全套单链抗体噬菌体载体的构建
基本方案2scFv展示噬菌体在抗原包被板上的亲和筛选
备选方案链霉亲和素包被的磁珠富集筛选生物素化抗原结合的scFv展示噬菌体
基本方案3ELISA鉴定抗原结合的scFv展示噬菌体
辅助方案1辅助噬菌体冻存液的配制
辅助方案2指纹图谱和PCR检测克隆的正确性和多样性
辅助方案3蛋白质的生物素化(NHS-SS-生物素)
辅助方案4利用生物素蛋白连接酶使蛋白生物素化
单元14.4整体培养中同型转换重排的PCR检测
基本方案1通过转换接头的直接PCR
辅助方案通过PCR和随机引物标记法制备5′Sμ探针
基本方案2消化环化PCR
单元14.5PCR检测细胞因子mRNA的表达
基本方案定量IL-2mRNA表达水平
单元14.6PCR检测人T细胞受体基因的表达
基本方案PCR检测人T细胞受体基因的表达
备选方案PCR定量检测TCR可变序列转录产物
辅助方案1重排V-D-J区测序
辅助方案2cDNA合成
单元14.7PCR检测小鼠T细胞受体表达
基本方案1PCR分析小鼠TCR基因表达
基本方案2PCR检测小鼠TCR可变区的频率
基本方案3对小鼠可变区转录物进行PCR定量
基本方案4序列分析V(D)J区的接头多样性
辅助方案cDNA合成用于小鼠TCR基因表达的PCR分析
单元14.8TCR库的抗原谱,免疫扫描技术分析
基本方案1人和小鼠TCR受体库多样性的免疫扫描技术分析
备选方案利用,32P,dCTP进行免疫扫描分析
基本方案2链接区引物进行高特异的分光光度分析
基本方案3TCR基因扩增产物的快速高通量测序
单元14.9多探针核糖核酸酶保护试验同时测定mRNA表达
基本方案多探针核糖核酸酶保护试验
辅助方案1构建一个核糖探针模板
辅助方案2凝胶电泳和结果的可视化
单元14.10端粒长度和端粒酶活性的分析
基本方案1Southern杂交检测传统凝胶电泳中末端端粒DNA限制性片段(TRF)的端粒
长度
备选方案1尼龙膜上的Southern杂交
辅助方案1端粒或其他寡聚核苷酸末端标记
基本方案2用脉冲电场凝胶电泳法测量端粒
基本方案3荧光原位杂交
基本方案4QFISH
辅助方案2从分裂的淋巴细胞中制备分裂中期染色体
基本方案5端粒酶活性的测定
备选方案2非放射性的TRAP分析方法1:荧光染料(SYBRI)标记
备选方案3非放射性的TRAP分析方法2:荧光染料(TAMRA-TS)标记
第十五章免疫分子与受体工程学
单元15.1用MHC-Ig二聚体检测抗原特异性T细胞
基本方案构建MHCI-Ig二聚体
辅助方案1测定MHC-Ig融合蛋白浓度
辅助方案2J558L转染细胞大规模培养及上清的浓缩
辅助方案3用5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶层析法纯化MHC-Ig二聚体
辅助方案4制备5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶
辅助方案5通过被动交换法为MHC-Ig嵌合蛋白负载多肽
辅助方案6碱洗脱法负载多肽
辅助方案7温和酸性条件下负载多肽
辅助方案8流式细胞分析抗原特异性T细胞
单元15.2用MHC肽四聚体显现抗原特异性T细胞
基本方案1制备带BirA底物标签的MHCI类分子亚单位的包含体
基本方案2MHCI类分子肽复合物的重新折叠
辅助方案1用ELISA测定MHC
辅助方案2用分子大小排阻层析法进行超滤和纯化以浓缩折叠蛋白
基本方案3用酶进行生物素化、纯化及生物素化效率的分析
基本方案4用链亲和素使生物素化的单体形成多聚体
基本方案5用标记的MHCI类分子四聚体通过流式细胞分析含特异性T细胞受体的细胞
附录1试剂与溶液
附录2实验用小鼠、大鼠和仓鼠
附录2A常用小鼠和大鼠品系
附录2B饲养
附录2C处理和捕捉
基本方案1小鼠的处理和捕捉
基本方案2大鼠的处理和捕捉
基本方案3仓鼠的处理和捕捉
备选方案啮齿类动物捕捉器
附录2D麻醉
基本方案1小鼠、大鼠和仓鼠的注射麻醉
基本方案2用甲氧氟烷吸入法麻醉小鼠、大鼠和仓鼠
附录2E腹腔注射
基本方案1小鼠、大鼠和仓鼠的肌肉注射
基本方案2小鼠、大鼠和仓鼠的皮内注射
基本方案3小鼠、大鼠和仓鼠的皮下注射
基本方案4小鼠的静脉注射
基本方案5小鼠、大鼠和仓鼠的腹膜内注射
基本方案6小鼠足垫注射
基本方案7小鼠胸腺内注射
附录2F血液收集
基本方案1小鼠和大鼠的眼眶或眼血管丛取血
基本方案2小鼠和大鼠的尾静脉微量采血管取血
备选方案从小鼠和大鼠的尾静脉以离心管取血
基本方案3小鼠腋窝丛取血
附录2G安乐死
基本方案1二氧化碳窒息
基本方案2过量戊巴比妥注射
备选方案1麻醉下放血
备选方案2小鼠颈椎脱臼
附录2H淋巴器官和胸腺的摘除
基本方案1小鼠淋巴器官的摘除
基本方案2脾切除术
备选方案脾半切除术
基本方案3新生鼠胸腺摘除
基本方案4成年鼠的胸腺摘除术
辅助方案胸腺吸入套管的制备
附录3免疫学常用细胞实验技术
附录3A细胞生长的检测
基本方案1血细胞计数板计数细胞
基本方案2库尔特粒度仪计数细胞
附录3B细胞冻存
基本方案1细胞株或杂交瘤的冻存
基本方案2细胞株或杂交瘤细胞的复苏
附录3C台盼蓝拒染试验检测细胞活力
基本方案
附录3D瑞氏吉姆萨和非特异性酯酶染色
基本方案1瑞氏吉姆萨染色通常用于淋巴细胞形态的研究
基本方案2非特异性酯酶染色
附录3E3HTdR的掺入
基本方案
附录3F判断并处理细胞培养中的支原体污染
基本方案1检测可能存在的支原体污染
基本方案2用BM-cyclin处理污染的细胞
备选方案用环丙沙星处理支原体污染的细胞
附录3G人外周血单个核细胞的分离
基本方案静脉穿刺采集外周血
备选方案淋巴细胞去除法取血
附录4试剂和设备的供应商
参考文献
索引
问题回答:磁珠和细胞结合力是多少,dynal公司的MACS(磁珠分选)技术相关产品: Dynabeads
1.1 Streptavidin是一种【均一、超顺磁的微球体】，它表面共价结合有纯化的链亲和素。【链亲和素】是一种由四个相同的亚基组成的蛋白质，每个亚基均有一个与生物素有高亲和力的结合位点。这种链亲和素与生物素的【高亲和力】(Kd=10^-5 Newton)可以快速、高效地分离生物素标记的靶分子，而不会出现像抗生物素蛋白那样的非特异性结合。生物素,链亲和素的相互作用的【稳定性】和【结合力】可以对DNA分子进行诸如解链、洗脱、杂交等操作，而不影响DNA在Dynabeads磁珠表面的稳定性。
1.2 Dynabeads kilobaseBINDERTM kit是为增强生物素标记的大片段DNA与Dynabeads Streptavidin之间的结合能力而设计的。本试剂盒包括Dynabeads Streptavidin和一种独特的结合缓冲液，这些试剂有助于增强生物素标记的大片段DNA与Dynabeads Streptavidin之间的结合。在使用结合缓冲液的情况下，1mg Dynabeads Streptavidin可以固定约70pmol 4Kb的DNA片段和约80pmol 10Kb的DNA片段。
1.3 通过对结合在Dynabeads上32P标记的PCR产物的定量分析，结果证明PCR产物的长度会影响其与Dynabeads的结合。两个500bp DNA片段与Dynabeads Streptavidin的结合能力和1Kb DNA片段与Dynabeads Streptavidin的结合能力是一样的。如果大片段DNA与Dynabeads Streptavidin的结合能力下降，那可能是位阻引起的。如果DNA片段大于2Kb时，推荐使用Dynabeads kilobaseBINDERTM kit。因为该试剂盒提供的结合缓冲液可以提高Dynabeads对大片段DNA的结合能力。
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11月21日
扑克牌的各种玩法-21点和24点
2008-03-16 11:08
21点(摸大点)
第一种玩法:52张牌，去掉大小王，J、Q、K、10为10点，A为1或11点，其他2、3、4、5、6、7、8、9为实际点数。庄家首先摸牌，相加等于21或者接近21为赢，超过为输。抓牌 不让对方看见，对方开始抓牌，相加超过庄家为赢，低于庄家或相等为输。
第二种玩法:54张牌，大小王，J、Q、K、为1点，A为1或11点，其他2、3、4、5、6、7、 8、9、10为实际点数.庄家首先摸牌，相加等于21或者接近21为赢，超过为输。抓牌不让 对方看见，对方开始抓牌，相加超过庄家为赢，低于庄家或相等为输。
24点
一副扑克去王，A-10分别为1-10，J为11、Q为12、K为13。抽出4张牌，四张牌分别用加减乘除计算，如等于24，先算出者为赢。如不能等于24，在继续抽牌，全部牌抽完，算出多者为胜。
1 5 5 5 ==> 5*(5 - 1/5)
4 4 10 10 ==> 4/(10-4/10)
3 3 7 7 ==> 7*(3 + 3/7)
3 3 8 8 ==> 8/(3,8/3)
[1]基本
3 4 6 10 ==> (10-6+4)*3, 138种
2,10,5,6 ==> 2*6*(10/5)
[2]提高
4 4 10 10 ==> (10*10,4)/4,24
[3]再提高
1 5 5 5 ==> 5*(5 - 1/5)
3 3 7 7 ==> 7*(3 + 3/7)
3 3 8 8 ==> 8/(3,8/3)
17:44 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日志 |
11月10日
常用生化技术原理
第二篇 常用生化技术原理
第1军 电泳技术
11 电泳基本原理?
12 影响泳动度的主要因素
13 常用的电泳方法
第2章 层析技术
21 恢述
22 层析原理
23 住层祈法
24 凝胶过滤层析法
25 气相色谱和高效液相色谱 第3章 分光光度技术
31 光学原理
32 L帅bcrLBeB定律? ”
33 分光光度计的基本构造
34 紫外可见光分光光度计
35 荧光分光光度计。
36 酶标仪
第4章 离心分析法
41 离心机基本原理
42 离心机的分类
43 离心机的结构
44 离心方法
第5章 透析
51 透析膜(袋)
52 溶剂
53 物理条件
第2章 实验室基本操作
2(1 玻璃仪器的洗涤
将新购买的玻璃仪器用自来水冲洗其表面的污物，然后浸泡在1,一2,盐酸溶液小过
夜。待用自来水冲净后冉进一步洗涤。
使用过的玻璃仪器先用自来水冲洗，然后将所有待洗的玻璃仪器放在含有洗衣粉的温水
中细心刷沉。待用自来水充分冲洗后用少量蒸馏水刷洗数次。凡洗净的玻璃仪器其内外壁J:
都不应带有水珠(否则表示未洗干净。仪器上的洗衣粉必须冲净，因为洗衣粉可能干扰某些
实验。
比较脏的器皿或不便刷洗的仪器(如吸管)先用软纸摈去可能存在的凡士林或其他油污，
用有机溶剂(如苯、煤油等)棕净后，用自来水洗后控干，再放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出
后用自来水反复冲洗至除去痕量的洗液。最后用蒸馏水刷洗数次。
普通玻璃仪器可在烘箱内烘干。但定量的玻璃仪器不能加热，一般采取控干或依次用少量酒精、乙醚油洗后用温热的气流吹干。
铬酸洗液的配制方法有多种，现介绍常用的一种方法:
小心加100ml工业用浓硫酸，同时缓慢加入5e工业用重铬酸钾粉末。搅拌，待全部重铬酸钾溶解后，冷却备用。洗液应贮入带塞的玻璃器皿中(玻璃器皿底部最好垫有玻璃纤维以减少仪器破损。此洗液可重复使用多次，如洗液变为绿色或过于稀则失效。
病毒、传染病思者的血清等珐污过的容器，应先进行消毒后再进行清洗。盛过各种毒品，特别是剧毒药品和放射性同位索物质的容器必须经过专门处理，确知没有残余毒物存在时方可进行清洗。
2(2搅拌和振荡
配制溶液时，必须充分搅拌或振荡混匀。常用的溶液混匀方法有以下3种: 1)搅拌式适用于烧杯内溶液的洞匀
(1)搅拌使用的玻璃棒必须两头都烧圆滑。
(2)搅棒的粗细长短，必须与容器的大小和所配制约溶液的多少呈适当比例关系. (3)搅拌时，尽量使搅棒沿着器壁运动，不搅入空气，不便溶液飞溅.
(4)倾入液体时，必须沿器壁慢慢倾入，以免有大量空气混入。倾倒表面张力低的液体[如蛋白质溶液)时，更需缓慢仔细G
(5)研磨配制胶体溶液uf，要使搅棒沿着研钵的—个方向进行，:个要来问研磨。
2)旋转式适用于锥形瓶、大试管内溶液的混匀
振荡溶液R、r(手握住容器后以手腕、肘或肩作轴旋转容器，不应上下振荡。
3)弹汀犬运用产离心管、小试管内溶液的混匀
可出 手持管的上端，用另 手的手指弹动离心管。也可以用同一手的大拇指和食指持管的上端，用其余3个手指弹功离心管。手指持管的松紧要随着振动的幅度变化。还RJ以把双手华心相对合拢，夹住离心管来回搓动。
在容量瓶中混合液体时(应例持容量瓶摇动，用食指或手心顶住瓶塞，并不时翻转容员瓶。
在分液漏斗少振荡液体时，应用一手在适当斜度下倒待漏斗，用食指或手心顶住瓶塞，并用另?手控制漏斗的活塞，一边振荡，一边开动活塞，使气体可以随时由漏斗泄出。 2(3 容量玻璃仪器的使用方法
容量仪器有装量和卸量两种。量瓶和单刻度吸管为装量仪器。滴定管、?一般吸管和量筒等均为卸量仪器。近年来，自动取样器已广泛应用于生物化学教学和科学研究中，是一种取液量连续可调的精密仪器，使用极为方便。
1)吸管
吸管是生物化学实验中最常用的卸量容器。移取溶液时，如吸管不干燥(应预先用所吸取的溶液将吸管冲洗2—3次，以确保所吸取的操作溶液浓度不变。吸取溶液时，一般用有手的大拇指和中指拿住管颈刽度线上方，把管尖插入溶液中。左手拿吸耳球，先把球内空气压出，然后把吸耳球的尖端接在吸管口，慢慢松开左手指，使溶液吸入管内。当液面升高至到度以上时，移开吸耳球，立即用右手的食指按住管口，大拇指和中指拿住吸管制度线上方，再使吸管离开液面，此时管的末端仍靠在盛溶液器皿的内壁上。略微放松食指，使液面平稳
下降，直到溶液的弯月面与刻度标线相切时，立即用食指压紧管口，取出吸管，插入接受器中，管尖仍靠在接受器内壁，此时吸管应垂直，并与接受器约呈15。夹角。松开食指让管内溶液自然地沿器壁流下。遗留在吸管尖端的溶液及停留的时间要根据吸管的种类进行不同处理。
使用注意事项:
(1)应根据不同的需要选用大小合适的吸管，如欲量取l.5ml，用2mL吸管要比选用1ML或5mL吸管误差小。
(2)吸取溶液时要把吸管插入溶液深处，避免吸入空气而将溶液从亡端溢出。
(3)吸管从液体中移出后必须用滤纸将管的外壁擦干，再行放液。
2)虽商
量简厂是吸管或滴定管的代用品。在准确度要求不高的情况下，用来量取相对大量的液体。不需加热促进溶解的定性试剂可直接在只有玻璃塞的星简中配制。
3)容坦瓶
容量瓶具有狭窄的领部和环形的刻度，是在一定温度r—(通常为20?)确定准确体积的容器。使用前应检查容量瓶的瓶塞是否漏水;合格的瓶寒应系在瓶颈上，不得任意更换。容量瓶刻度以J:的内壁挂有水珠会影响准确度(所以应该洗得很干净。所称量的任何固体物质必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后才能转移到容虽瓶中。容量瓶绝不应加热或烘干。
751G型分光光度计的操作方法如下:
(1)检查电源电压是否与仪器所要求的电压相符(然后再插上电源插头。
(2)根据测定所要求的波沃选择光源灯。在波长320一1000 nm范围内用钨灯。在波长200一320 nm范围内，用氢弧灯作为光源。拨动光源选择杆使所需要的光源灯进入光路。根据需要可以把滤光片推入光路，以减少杂散光，但通常情况下没有这种必要。把波长刻度旋到所要的波长上。
(3)检查仪器的各种开关和旋钮使处丁关闭位置。然后再打开电源开关，使仪器预热20m5n。
(4)选择适当波长的光电管。如涵定的波长在200一625nm范围内，用紫敏光电管，此时应将手柄推入。如测定的波长在625—1000 nm范围，用红敏光电管，应将手柄拉出。
(5)根据波长选择比色皿。测定的波长在350nM以上时，用玻璃比色皿。测定波长在350 nm以下时，则需用石英比色皿。在比色皿中装好溶液，放在暗箱内的托架上，然后把暗箱益好。
(6)把选择开关拨到“校正”位置上。调节暗电流使电表指针指到“o”。为了得到较高的准确度，每测量一次都应校止一次暗电流。
(7)在一般情况下，旋转灵敏度旋钮从左边停止位置顺时针转动三圈左右。
(8)旋转读数钮，使刻度盘位于透光串100,位置亡。把选择开关拨到“x1”处，然后拉什暗电流闸门，使单色光进入光电管。
(9)调节狭缝，使电表指纠接近零位。然后再用灵敏度旋纽细致调节，使电表指针正确地指在“01，上。
(10)把比色皿定位装置的拉杆轻轻地拉出一格(注意应使滑板处在定位槽个)(使试样溶液进入光路(这时电表指针偏离零依。转动读数电位器旋纽，重新使电表指针移到“o”位上(此时刻度盘上的读数即为试样的透光串和相应的光吸收值。取得读数后，应及时将暗电流间门重新关上，以保护光电管，防止受光时间过长而疲劳。在读取透光率和相应消光值的数值时，若选择开关在“ x1”处，透光率范围为0~100,。当透光率小于10,时，则可把选择开关拨到
“x o(1tP位置，此时所读取的透光串数值，应以10除之，而所读出的消光值应加上1(o。测定完后，应把各个旋钮和开关复原、关闭，拔厂插销。
2(5 干燥箱和恒温箱
干燥箱用于物品的干燥和干热灭苗，恒温箱用于微生物和生物的培养。这两种仪器的结构和使用方法相似，干燥箱的使用温度为50—250?，常用鼓风式电热以加速升温;恒温箱的最高温度为60?。
1(使用方法
(1)将温度计插入座内(在箱顶放气调节器中部)。
(2)把电源插头插入电源插座。
(3)将电热丝分组开关转到l或2位置上(视所需温度而定)，可开启鼓风机促使热空气对流。电热丝分组开关开启后，红色指不灯亮。
(4)注意观察温度计。当温度计温度将要达到所需温度时，调节自动控温旋钮，使绿色指示灯正好发亮，10 min后再观察温度计和指示灯，如果温度计上所指温度超过需要，而红色指示灯仍亮，则将自动控温旋钮略向反时针方向旋转，直到温度恒定在要求的温度上，指示灯轮番显示红色和绿色为止。自动恒温器旋纽在箱体正面左上方，它的刻度板不能作为温度标准指示，只能作为调节用的标记。
(5)在恒温过程中，如不需要三组电热丝同时发热时，可仅开启—启组数越多，温度上升越快。
(6)工作一定时间后，可开启项部中央的放气调节器将潮气排出风机。 、
(7)使用完毕后将电热丝分组开关全部关闭，井将自动恒温箱的旋钮沿反时针方向旋至零位。将电源插头拔下。
2(注意事项
(1)使用前检查电源，要有良好地线。
(2)干燥箱无防爆设备，切勿将易燃物品及挥发性物品放入箱内加热。箱体附近不可放置易燃物品。
(3)箱内应保持清洁，放物网不得有锈，否则影响玻璃器皿洁度。
(4)使用时应定时监看，以免温度升降影响使用效果或发生事故。
(5)鼓风机的电动机轴承应每半年加油一次。
(6)切勿拧功箱内感温器，放物品时也要避免碰撞感温器，否则温度不稳定。
(7)检修时应切断电源。
2(6电热恒温水浴
电热恒温水浴用于恒温加热和蒸发，最高工作温度为
100?，此仪器利用控温
器控制温度，所以工作原理和使用方法与干燥箱相似。但应
注意使用前在水浴槽内
加足量的水以避免电热管烧坏。如较长时间不使用，必须放
尽水槽内的全部水。
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751G型分光光度计的操作方法
751G型分光光度计的操作方法如下:
(1)检查电源电压是否与仪器所要求的电压相符(然后 再插上电源插头。
(2)根据测定所要求的波沃选择光源灯。在波长320一 1000 nm范围内用钨灯。在波长200一320 nm范围内，用氢弧灯作为光源。拨动光源 选择杆使所需要的光源 灯进入光路。根据需要可以把滤光片推入光路，以减少杂散 光，但通常情况下没有这种必要。把波长刻度旋到所要的波长上。
(3)检查仪器的各种开关和旋钮使处丁关闭位置。然后 再打开电源开关，使仪器预热20m5n。
(4)选择适当波长的光电管。如涵定的波长在200一 625nm范围内，用紫敏光电管，此时应将手柄推入。如测定的波长在625—1000 nm范 围，用红敏光电管，应将手柄拉出。
(5)根据波长选择比色皿。测定的波长在350nM以上时， 用玻璃比色皿。测定波长在350 nm以下时，则需用石英比色皿。在比色皿中装好 溶液，放在暗箱内的托架上，然后把暗箱益好。
(6)把选择开关拨到“校正”位置上。调节暗电流使电 表指针指到“o”。为了得到较高的准确度，每测量一次都应校止一次暗电流。
(7)在一般情况下，旋转灵敏度旋钮从左边停止位置顺 时针转动三圈左右。
(8)旋转读数钮，使刻度盘位于透光串100,位置亡。把选择开关拨到“x1”处，然后拉什暗电流闸门，使单色光进入光电管。
(9)调节狭缝，使电表指纠接近零位。然后再用灵敏度 旋纽细致调节，使电表指针正确地指在“01，上。
(10)把比色皿定位装置的拉杆轻轻地拉出一格(注意应 使滑板处在定位槽个)(使试样溶液进入光路(这时电表指针偏离零依。转动读数电 位器旋纽，重新使电表指针移到“o”位上(此时刻度盘上的读数即为试样的透光 串和相应的光吸收值。取得读数后，应及时将暗电流间门重新关上，以保护光电管， 防止受光时间过长而疲
劳。在读取透光率和相应消光值的数值时，若选择开关在“ x1”处，透光率范围为0~100,。当透光率小于10,时，则可把选择开关拨到“x o (1tP位置，此时所读取 的透光串数值，应以10除之，而所读出的消光值应加上1(o 。测定完后，应把各个旋钮和开关复原、关闭，拔厂插销。
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骨髓检查与分析
第一节 骨髓检查的指征和禁忌证
一、骨髓检查的指证
二、骨髓穿刺禁忌证
第二节 取材
一、骨髓穿刺技术
二、注意事项
第三节 骨髓检查的步骤
一、骨髓液外观
二、制片
三、染色
四、显微镜检查
五、填写检验报告单
六、标本保存
第四节 骨髓象分析
一、正常骨髓象
二、骨髓有核细胞增生程度估计的标准及意义
三、粒细胞与有核细胞比例
四、粒系细胞改变
五、红系细胞改变
六、巨核系细胞改变
七、淋巴系细胞改变
八、单核系细胞改变
九、其他血细胞改变
十、骨髓象与血象综合分析的重要性
十一、骨髓象检验的注意事项
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人骨髓CFU—GM的培养
组织培养技术的优点有:?理化环境是可控制的，培养液可根据实验目的要求而补 充已知成分;?经多次传代再培养形成的细胞系，细胞呈均质或足均匀的，特征基本相 同，经克隆化后筛选得的细胞株，细胞类型单一，对外界影响的反映更加一致i?培养 物可直接暴露在预测的试剂中，预测样品用量少，并可直接观测反应:?通过大量繁 殖，可提供大量均匀的细胞，以比较分析不同因素或同一因素的不同剂量对同一细胞株 的作用;?可人工筛选具有一定特征变异的突变株或细胞融合体，有利于进行基因功能 的研究;6)组织培养结合缩时摄影技术，可直接观察活细胞的活动和对外界作用的反 动物细胞培养的应用:
离体培养的动物细胞，具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广 泛应用于今物学领域的基础研究中。在细胞生物学上，动物细胞培养可用于研究动物的 正常或病理细胞的形态、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。如神经细胞 的增殖、突起生长、相互识别、刺激传递等机理就是通过进行各种神经细胞的培养才弄 涓楚的;在遗传学研究中，除可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融 合技术建立细胞遗传学，进行遗传分析和杂交育种:在胚胎工程中，体外培养卵母细 胞、体外受精、胚胎分割和移植已发展成了一种较成熟的技术而应用于家畜的繁殖生产 中。另外，分离和培养具有多潜能的胚胎干细胞，可用于动物克隆、细胞诱导分化、动 迪至种的研究，并可作为基因转移的高效表达载体c在病毒学研究中，用培养的动物细 胞代替试验动物做斑点分析，不仅方法简便、准确，而且重复件好。
组成人体的细胞具有极其复杂的结构和功能。在个体发生过程中(细胞通过不断的 生长和繁殖，数量增多，并发生着分化。所谓分化，即细胞在形态和功能，i:由—„般发展 到特殊的过程。由于分化的结果，形成了各种组织和器官.
首先，动物细肋培养技术可用于遗传疾病和先天畸形的产的诊断。目前，人们已经 能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水小的胎儿细胞，经培养后进行染色体分析或蛋白检 测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸形。其次，现在的一些科学研究已能通 过染包体对比分析检测出易患癌症的病人(以便进行及早的预防和治疗。再次，细胞培 养还可用于临床泊斤，目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植人造血障碍症患者体内 进行治疗的报道。另外，动物细胞培养生产的生物大分子制品也可用于治疗某些代谢缺 陷疾病，如利用动物细胞培养生产的重组人促红细胞生成素(rHuEPO)在临床上可用 于治竹肾衰件贫血、癌症患者化疗后贫血，以及择期手术者的自身输血。
目前，由于细胞培养技术、细胞融合技术、细胞杂交技术以及转基因技术的创建与 相互结合，使得人们能够在细胞水平操作并改变动物的基因，进行遗传物质的重组。这 样就可以按照人类的需要，大幅度地改变生物的遗传组成，从而伎新品种的培育在实验 室巾即可完成，可大大缩短育种进程，且伎育种工作更加经济有效。胚胎于细胞的研究 成果和克隆羊多莉的问世可以说已为动物遗传育种开辟了一条新途径。
利用动物细胞大规模培养技术生产大分子生物制品始于20世纪60年代，当时是为 了满足生产疫苗的需要。后来随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应 用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白比原核细胞表达系统 更有优越性。因为重组DNA技术修饰过的动物细胞能够正常地加工、折叠、糖基化、 转运、组装和分泌由插入的外源基因所编码的蛋白质，而细菌系统的表达产物则常以没 有活件的包涵体形式存在、随着大量永久性细胞株的创建，用动物细胞可生产的生物制 品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等n随着动物 细胞培养技术的发展，以后还会有更多的生物制品被开发，并用于造福人类。
组成人体的细胞具有极其复杂的结构和功能。在个体发生过程中(细胞通过不断的 生长和繁殖，数量增多，并发生着分化。所谓分化，即细胞在形态和功能上由—般发展 到特殊的过程。由于分化的结果，形成了各种组织和器官。
当前模拟体内环境的技术已经很高，细胞在人工培养条件下石仅能很好地生存、生 平衡的相对稳定环境巾，日久天长，即易发生如下变化:分化现象减弱或不显，形态和 功能趋于单一化;或生存一定时问后衰退死亡，或发生转化，获不死性(变成有无限生 长能力的连续细胞系或忍性细胞系。
任何细胞置于体外培养后，对新的生存环境都有一个适应过程，表现在细胞形态和 功能发生——定的改变，如腺细胞分泌机能丧失、肌细胞纤维细胞化等。因此，nJ把组织 培养条件下的细胞看做一种生长在特定条件下的细胞群体，它们既保持着体内细胞相同 的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状，实际卜，细胞或组织一旦被置于 体外培养后，这种差异就开始发生了。
据上所述、体外培养似难反映体内细胞的情况，从而是否可以得出结论:认为利用 组织培养细胞所进行的研究失去了意义。对此，人们持有两种不全面的看法，一种是对 存在的差异忽略不计;另一种则是过分强调这些差异，认为利用培养细胞无助于解决体
内问题。培养细胞和体内细胞的差异是客观存在的，问题在于如何理解和解释。只有从 细胞遗传学角度考虑，才可得到恰当的答案。
如前所述，细胞被置于体外培养后，其原有功能可能迅速改变或消失，特别是连续 细胞系出现后，很多人怀疑组织培养细胞是否还保留分化能力和分化的表现。
事实上，体外培养细胞分化能力并未完全丧失，只是因环境的改变，细胞分化的表 现与在体内不同。如二倍体成纤维细胞，可传30—50代，相当于150—300个细胞周 期，最后衰老死亡，呈现着生命发展分化过程。如培养的是胚胎细胞，上述过程将更加 明显;若从成体或老年个体取材，则细胞在体外生存的时间也随之缩短，呈现着与体内 组织明显的相关性，即衰老分化过程。另外，细胞在一代的生存过程中，即从接种到长 满底表面的一段时间中(也存在着分化现象。如细胞由于繁殖，数星增多相互接触时， 即发生所谓接触抑制而导致细胞运动停止;又如细胞达到一定密度后即出现密度抑制 等。这些现象都是细胞之间借相互传递信息而实现的。因此，培养细胞和体内组织一 样，仍然是个整体，存在着相互依存关系，调控着细胞的分化过程。随环境的改变(体 内外细胞分化的具体表现常大不相同，如胶原在体内主要为成纤维细胞和骨细胞的产 物，但在体外，不仅成纤维细胞能产生胶原，在一定条件下，上皮细胞、神经细胞甚至 某些肿瘤细胞也能合成胶原。分化的关键在于存在能使细胞发生分化的条件，如FriMd 细胞(小鼠白血病细胞)在一定因素作用下可以合成血红蛋白;血管内皮细胞培养在类 似基膜物质底物上时，能长成血管状结构;杂交瘤细胞能产生持异的单克隆抗体(这些 均属细胞分化行为。
以上说明，现在的问题已不是体外培养细胞存在不存在分化，而是如何揭示出细胞 分化的条件(阐明分化调控基因机制。每种细胞分化条件不同，必须做具体分析(不能 按照体内模式去理解，只打这样，才能真止认识体外细胞分化现象。
二、动物细胞的特点
动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比较，其进化程度更高，结构和成分更 复杂，功能也更个面。出真核细胞组成的动物分为单细胞动物和多细胞动物两类。前者 主要指原生动物如鞭毛虫、阿米巴虫等!普通光学显微镜F观察到的真核动物细胞由三 个部分组成(即细胞膜、细胞质(包括各种细胞器)、细胞核c而在亚显微水平(分辨 率小于0(21mu m以下)又可将真核细胞分为三类基本结构:
膜樊结构——细胞质膜、细胞核膜、内膜系统等。
纤维结构——染色质、细胞骨架系统等。
颗粒结构——核糖体筹。
第三节 动物细胞培养液
早期组织培养工作，大多采用完全天然成分，如血清、血浆、胚胎浸出液等作为培 养液。其组成虽然接近体内状态，但是由于组成复杂，未知因素比较多，所以实验结果 难以分析。人们力图提供一些成分明确的培养波——人工培养液。
使动物细胞有可能在体外培养的基本条件之一，是提供尽可能与体内生活条件相接
近的培养环境。这个培养环境包括10个因素:?温度;?渗透压;?氢离子浓度;? 其他有机离子;?主要的代谢物;?补充的代谢物;?激素;?影响细胞代谢的其他因 子，?细胞生长的基质(M盯ix);?各因素间的相互作用。对于大多数哺乳类细胞的 生长，员适pH范围是7(2—7(4，多数细胞不能超过pH 6(8—7(60最适温度是372 0(5?。其他因素则因细胞株(系)的特性和要求而有所不同。
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小鼠骨髓CFU—GM的培养
第三节 小鼠骨髓CFU—GM的培养
一、器材
1 剪刀，镊子、穿骨针、穿骨针
2 30ml体系甁，直径30mm培养皿，注射器、吸管。
3 血球计数台，吸管。
4 恒温水浴箱，电热套，co2温箱或普通温箱、蜡烛。
二、试剂
1.培养液1640;McCoy's 5A;或费歇氏液等均可使用
2(马血清。
3(小鼠肌浸液。
4(5,琼脂。
三、操作步骤
1.采取颈椎脱日法处死小鼠。
2.将死小鼠放75,酒滑个浸泡片到消毒。
3.取下小鼠股骨，连着大转子一起取下。
4.将小鼠膝关节向相反方向解开，向后方拉使大部分肌内脱下，然后把剩余肌肉剪干净。 5(用消毒针头在膝关节上穿一小孔。
6(剪掉大转子，用7号针头冲出骨髓，过4号半针头制成【单细胞悬液】。 7(计数有核细胞数并算出接神细胞悬液量，按接种有核细胞1×10$^L$,nl体系计算。 8 配粒系培养体系
用恒温水浴法在37c条件下预热10分钟后加入5,煮沸琼脂0.4ml立即混匀，用5ml注射器或吸管边加边摇快速混匀。每皿滴入上述体系1ml。
9(放一塑料盒中并放几个加水的平皿后，放co2温箱中进行培养喊放入干燥器点蜡。 10培养条件为:37c Co2气饱和湿度下培养6天观察计数，多于50个细胞为—个集落。 16:49 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日志 | Cell
11月9日
生物力学与骨科学
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