【word】 重复序列设计原核细胞差异显示RT-PCR引物研究进展

【word】 重复序列设计原核细胞差异显示RT-PCR引物研究进展 重复序列设计原核细胞差异显示RT-PCR 引物研究进展 农业生物技术JournalofAgficulturalBiotechnology2007,l5(2):337-340 重复序列设计原核细胞差异显示RT—PCR引物研究进展水 李影,钱爱东料 (吉林农业大学动物科学技术学院动物生物技术重点实验室,长春130118) ? 综述? 摘要:由于原核细胞mRNA3端不存在ploy(A)结构,因而原核细胞DDRT.PCR引物设计不同于真核细胞.尽管不能根 据oligo(dT)~计引物,但利用全基因中高度分散重复的短序列或回文序列却能有效地克服mRNA分子结构影响,最大限度地 扩增全长eDNA.并且这两种引物设计方法还可以提高RNA指纹图谱的重复性,降低反应的假阳性,为原核细胞DDRT.PCR 引物设计提供新的思路. 关键词:原核细胞;mRNA差异显示技术;引物设计 中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006.1304(2007)02.0337.04 ProgressofPrimerDesignforProkaryoticDifferentialDisplayRT?PCR LIYing.QIANAi—dong (KeyLaboratoryofAn/malBiotechnology,AnimalScienceandTechnologyCollege,JilinAgricultureUniversRy, Changchun13011~China) Ab明I哦 DuetothelackofpolyadenylationinprokaryoticmRNA.theprimerdesignofprokaryoticDDRT-PCRisdifferentfrom eukaryocyte.Oligo(dT)prime~areeffectivelyreplacedwithprime~designedaccordingtohighlyiteratedpalindromeincomplete genome.TheprimerdesignmethodcannotonlyovercomeshortcominginprokaryoticmRNAtomaximatilyamplifywholeeDNA, butalsoenhancetheRNAfinger-printingreproducibilityandweakenfalsepositive.Itsupplesnovelthoughtforprokaryoticdifferential displayRT—PCR. K:prokaryocyte;differentialdisplayRT—PCR;primerdesign mRNA差异显示技术(differentialdisplayre. versetranscriptionpolymerasechainreaction, DDRT.PCR)是一种在转录水平上对基因表达进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的方法,主要通过mRNA3’端与5’端引物的合 理设计和组合,将细胞(或组织)中表达的基因片段 直接显示在聚丙烯酰胺凝胶(或高分辨率琼脂糖凝 胶)上,形成指纹图谱,从中找出在细胞(或组织)中 表达的差异cDNA片段.然后将差异片段克隆,测 序,并与基因序列数据库(GenBank,EMBL等)进行 对比分析,尽而确定该差异片段的功能(李文雍和陈 清轩,2004;杨新艳等,2004;赵锦荣等,2000).在这项 技术中,设计出能最大限度扩增出全长cDNA,并能 有效克服,排除细胞内其它RNA干扰的引物是其 关键所在.对于真核细胞而言,由于其mRNA3’端存 在ploy(A)结构,那些利用oligo(dT)进行引物设计的 方法及多种改良方法均能最大限度地扩增出cDNA 片段,反映出同一类细胞在不同生理状态或在不同 生长发育阶段的基因表达情况(邢少辰和林秀峰, 2004).相比之下,原核细胞mRNA3’端不存在ploy ?结构,引物设计尚存在一定难度,这也是该项技 术在原核细胞中应用较少的主要原因(Brzostowicz efa1.,2003;Hilleta1.,2003;Craigeta1.,2002).目前关 于原核细胞mRNA差异显示技术的引物设计尚无 系统而具体的实施方法.因此,根据国内外研究状 况,本文综述了原核细胞mRNADDRT.PCR引物 设计. 1影响原核细胞DDRT—PCR引物设计的主 要因素 1.1mRNA3.端无ploy(A)结构 在真核细胞中,成熟的mRNA3’端均有多聚腺 苷酸即ploy(A).因而,引物可以根据oligo(dT)与 ?基金项目:国家自然科学基金项N(No.30471286)和吉林省科技发展计划资助项目(No.20060556)资助. “通讯作者.Authorforcorrespondence.教授,主要从事动物微生物学与免疫学研究.E-mail:<qianaidong0115@163.corn> 收稿日期:2006.08.01接受Et期:2006-09.28 338农业生物技.术2007年 ploy(A)互补配对进行设计.为了尽可能覆盖所有的 mRNA序列,oligo(dT)要另外加有两个固定碱基,即 oligo(dT)12MN,其中N,M分别代表A,c,T和G4 种碱基中的一种,但M不能为T,这样形成的12组 引物被称为锚定引物即RT引物.理论上这些引物 可以锚定总mRNA中特定的1/12,用于合成cDNA 第1链.同时,5’端设计一组长约10个碱基的引物 被称为随机引物即PCR引物,主要用于cDNA第2 链扩增(赵锦荣等,2000).与此相比,原核细胞 mRNA3’端不存在ploy(A)结构,锚定引物设计难度 增加.即便针对mRNA3’端6个碱基计设引物,引物 数量也将达256种之多,况且6碱基引物的特异性 也极低.因此,原核细胞DDRT—PCR引物设计尚需 另辟溪径. 1.2细胞中mRNA丰度低 这一点同样也影响着真核细胞DDRT—PCR引 物的特异性及技术的敏感性.在真核细胞中,95%4 99%的RNA为高丰度的核糖体RNA(rRNA),转运 ()及小RNA,仅有1%--5%为mRNA.而 在mRNA中,低丰度的又占90%以上.这些mR- NA,无论大小还是序列都是相异的,其长度也从几 百碱基到几千碱基不等(SambrookandRussell 2001o不管采用多少引物组合,标准的DDRT—PCR 技术仍旧对高丰度RNA有明显倾向性,往往实验 过程中出现的假阳性也由此产生(Nagelcta1., 2001o若想克服这一点,一个最为行之有效的方法 是将mRNA从细胞中提取出来.然而在实际操作 中,mRNA的提取与纯化远比减少DDRT—PCR假 阳性操作复杂和繁琐.相比之下,原核细胞mRNA 为多顺反子,其转录与翻译同步进行,并且分子3’端 无ploy(A)结构,这些因素不但会影响到mRNA的 稳定性,而且还很难将mRNA从tRNA和rRNA中 分离纯化(AmaraandVijaya,1997).因此,提高 DDRT—PCR引物的特异性无论对真核细胞还是原 核细胞均较重要. 2原核细胞DDRT.PCR引物设计原则 原核细胞DDRT—PCR技术的引物设计应遵循 以下原则:第一,引物应尽可能扩增出cDNA全长; 第二,引物应为原核细胞在mRNA中高频出现的一 小段核苷酸序列,但该序列应在其它RNA中不存 在,以此降低胞内RNA的干扰;第三,引物GC百分 含量应低于50%;第四,引物5’端最好添加终止序 列;第五,引物长度以10--12碱基为宜,过长则难于 如实反映基因表达情况,而过短则极易”制造”假阳 性;第六,引物内部不形成发夹结构,引物之间不形 成二聚体;第七,便于对PCR产物进行分子克隆实 验操作(邢少辰和林秀峰,2004;:Y宗礼等,2005;Die~ fenbachandDveksler,1995o 3原核细胞DDRT.PCR引物设计 尽管原核细胞mRNA的分子结构,性质决定了 其DDRT—PCR引物设计的难度,但对于某些原核生 物而言,其独特的基因序列却为引物设计提供了新 的思路. 3.1基于基因组内高频出现的短序列设计引物 FislageetaI.(1997年)根据已知E.coliDH5et基 因序列,利用Access等数据库分析软件,统计出了 在编码区内高频出现的多组寡核苷酸序列.再从中 筛选出高CG含量的序列作为随机引物,而低CG 含量的序列则作为锚定引物.这种方法利用E.coli 3’端没有ploy(A)结构,但是却富含AT序列这一特 征,在锚定引物序列调整修改时,加入了包括TAA 或TCA终止密码子序列在内的多聚T序列;而在 随机引物中则加入了ATG起绐密码子序列(Fislage cta1.1997).该方法所设计的引物适用于包括肠炎 沙门氏菌,费氏志贺氏菌,普通变形杆菌,克雷伯杆 菌等多种肠杆菌DDRT—PCR研究.笔者也应用该法 设计的引物比较分析了大肠杆菌正常状态与活的非 可培养状态(??NC)的差异基因.从研究结果可知, RNA指纹图像复杂,重复率较高,经反向Northern 杂交验证,差异条带的假阳性较低.并且实验所用的 引物组合数量较少,极大减轻了工作量.但是将该引 物用于乳酸杆菌和双歧杆菌正常状态与VBNC状 态差异展示研究中时,却得不到理想结果,说明锚定 引物在乳酸杆菌和双歧杆菌基因组中并非是高频出 现的序列,表明了该引物具有明显的特异性.但至少 对于肠杆菌科细菌这种方法设计的引物具有广泛适 用性;而对于其它细菌,引物设计方法需要提供新的 解决途径. 3.2基于高度重复短回文序列设计引物 Bhayacta1.(2000)根据己发表的蓝细菌6803 株全基因序列,找到一段分散于基因组内长为10个 碱基的高度重复短回文序列(lyiteratedpalin- dr0me,HIP):5’一GGCGATCGCC一3’,而该序列在 rRNA和tRNA基因中则无.为减少退火时引物内 部配对或引物间形成二聚体,调整HIP中GC百分 含量,将该序列5’端的G,c用A,T替代,从而在 HIP基础上设计出W1一H(5’-AGAGATCGCC一3’), W2一HIPf5’一WGWGATCGCC一3’),W3一H(5’一GW- CWATCGCC一3’)和W4一HIP(5’一GGWGATCGCC一3’) 等4种改良序列,其中w为A或T(Bhayacta1., 第2期李影等:重复序列设计原核细胞差异显示RT.PCR引物研究进展339 2000).故而,用于蓝细菌DDRT.PCR研究的引物共 计12个,每个引物可单独使用,也可以两两组合使 用,共计32种引物组合.此外,为增加引物的特异 性,降低DDRT.PCR的假阳性,还可以在l2种引物 的3’端添加l,2或3个碱基,使引物长度扩大为 ll,l2和l3个碱基,相应的引物数量可增至48,192 和768个.看似数量庞大的引物,若先从l2个引物 中筛选出满足条件的引物,然后再根据此引物序列 特征,增加碱基种类和数量,就可以大大减少工作 量.该方法最大的优点在于根据目标序列设计,优 化引物,提升了DDRT.PCR的敏感性,降低了工作 强度.但这种方法也存在一些缺点:第一,并不是所 有原核细胞基因组都有HIP,故此方法应用范围小; 第二,HIP引物与mRNA模板易发生错配,增加反 应的假阳性;第三,HIP仍不能使某些基因得到有效 扩增. 4展望 正如标准PCR引物设计所强调的,引物是PCR 成功扩增的关键之一,好的引物不但可能避免背景 参考文献 Anlal-aRRandVijayaS.Specificpolyadenylationandpurifica— tionoftotalmessengerRNAfromEscherichiacoli(J).Nu— cleicAcidsResearch,1997,25(17):3465~3470 BhayaD,VaulotD,AminP,TakahashiAWandGrossmanA R.IsolationofregulatedgenesoftheCyanobacteriumsyne— chocystissp.strainPCC6803bydifferentialdisplay(J).Jour- halofBactedology,2000,182(2o):5692~5699 BrzostowiczPC,WaitersDM,ThomasSMandNagarjanV. mRNAdifferentialdisplayinamicrobialenrichmentculture: Simultaneousidentificationofthreecyclohexanone monooxygenasesfromthreespecies(J).AppliedandEnviron— mentalMicroviology,2003,69(1):334~342 CrmgJE.NobbsAandHighNJ.Theextracytoplasmicsigma factor,finalsigmaE,isrequkedforintmcellularsurvivalof nontypeableHaemophilusinfluenzaeinJ774macrophages (J).Infectionand/mmuninty,2002,70:708~715 DieffenbachCWandDvekslerGS.PCRPrimer:ALaboratory Manual(M).NewYork:ColdspringHarborLaboratory Press,]995.88,105 Fislage1LBereeanuM,HumboldtY,WendtMandOberender H.Primerdesignforaprokaryoticdifferentialdisplay RT-PCR(J).NucleicAcidsResearch,1997,25(9):183O,1835 HillCE.MetcalfDSandMaclnnesJI.Asearchforvirulence 和非特异物的产生,而且也能识别eDNA和基因组 模板.在原核细胞DDRT-PCR中,引物还是提高 RNA指纹图像重复性,降低差异条带假阳性的关键 因素.因此,在原核细胞DDRT.PCR引物设计时,始 终强调引物特异性高与低的平衡,即既要保证全面 覆盖mRNA序列,又要防止与细胞内其它RNA及 DNA的非特异性结合.同时还应尽量避免使用庞大 数量的引物,因为从众多引物用中筛选适宜的引物 将是一份既耗精力,又耗财力的工作.尽管如此,对 于基因组既不存在高频分散出现的重复序列,又没 有高度重复的回文序列,设计任意引物用于原核细 胞DDRT.PCR不识为一种好方法,如现今广泛应用 的RNA任意引物PCR(&AP.PCR)(Jeaneta1.,2001; Jorgeeta1.,2004;Sharmaeta1.,2006;Poretskyeta1., 2005),高密度样本差异分析(HDS.DDRT-PCR) (Waiterseta1..2001;Waiterseta1..2006)以及微阵列 (Kuchoeta1.,2005;李霆等,2005)等.随着分子生物的 飞速发展,多种原核生物的基因组将被分析得越来 越透彻,那么原核细胞DDRT.PCR的引物设计也必 将趋向灵活,多样,简便和实用. genesofHaemophilusparasuisusingdifferentialdisplay RT-PCR(J).VeterinaryMicrobiology,2003,96(2):189,202 JeanC,LiYY,HePTandCaoJY.Identificationofstress-re— sponsivegenesinStrep~coccusmuta/lsbydifferentialdis— playreversetranscription—PCR(J).Infectionand/mmunity, 2001,69(4):2493~2501 JorgeFL,BonheyoGTandFoukeBW.Identificationofdiffer- entialgeneexpressioninbacteriaassociatedwithcoralblack banddiseasebyusingRNA—arbitrarilyprimedPCR(J).Ap— pliedandEnvironmentalMicrobiology,2004,70(6):3687, 3694 KuchoOkamotoTsuchiyaY,NomuraS,NangoM,Kane— hisaMandIshiuraM.Globalanalysisofcircadianexpression inthecyanobacteriumSynechocystissp.strainPCC6803(J). 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