细胞侵袭实验

细胞侵袭实验 Transwell侵袭实验总结 概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1(Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters)，也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports)。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室(Transwell chamber，Transwell insert)，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1,12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)。将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验: (1).共培养体系: 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 (2).趋化性实验 可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ?细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ?趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 (3).肿瘤细胞迁移实验 常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。 (4).肿瘤细胞侵袭实验 常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是， 聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。2(肿瘤细胞侵袭模型 用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种(引自司徒镇强《细胞培养》): 2(1 体内癌细胞侵袭模型 2(1(1 皮下移植侵袭模型 2(1(2 肌肉内移植侵袭模型 2(1(3 腹腔内移植侵袭模型 2(1(4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型 2(1(5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型 2(1(6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型 2(1(7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型 2(1(8 视网内界膜侵袭模型 2(2 体外癌细胞侵袭模型 2(2(1 体外静止器官培养法 2(2(1(1 半固体培养基单细胞器官培养法 2(2(1(2 液体培养基单细胞器官培养法 2(2(2 半体外半体内器官培养法 2(2(3 单层细胞器官培养法 2(2(4 瘤细胞球体器官培养法 2(2(4(1 静止球体器官培养法 2(2(4(2 旋转摇动球体器官培养法 2(2(5 单层细胞侵袭实验模型 2(2(6 Transwell侵袭小室测定法 可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。 第二节 Transwell侵袭实验 我的课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。 ? Transwell小室: 多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的 是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell 和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。 这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们 实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵， 24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不 清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶， 但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。 ? 上层培养液: 上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。 ? 细胞: 值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱 法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就 盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱 少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显， 可先撤血清让细胞饥饿12,24h，再进行实验。 ? 基质胶: 常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和?型胶原，生产厂家 有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的:Matrigel是BD 公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。 同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格:BD公司的matrigel 1500 左右。 如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。 ? 下层培养液: 下层常用含5%,10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞 可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作 为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。 ? 细胞培养板: 常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常 用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应 当与购买的Transwell小室相配套。 ? 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目 的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。很 多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话 可以试试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长(>24h)，细胞还是会掉到下 室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。 另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。 第三节 Transwell的其他应用的实验步骤 1(Transwell肿瘤细胞迁移实验 过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。 实验目的:细胞划痕法检测细胞的迁移能力 实验原理:将细胞培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移情况，来判断细胞的迁移能力 实验仪器:超净工作台、CO 2培养箱、生物倒置显微镜 实验内容与方法: 1(使用marker笔在6孔板背后，均匀得划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过 5条线。 2(在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3(第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。 4(用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。 5(放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。