人脐带间充质干细胞的体外分离_培养及诱导分化

　 中华耳鼻喉科杂志 , 2002, 37 (6) : 454 [ 12 ]Wong CM , Yam JW , Ching YP, et al. RhoGTPase2activa2 ting p rotein deleted in liver cancer supp resses cell p rolifer2 ation and invasion in hepatocellular carcinoma[ J ]. Cancer Res, 2005, 65 (19) : 8 861 [ 13 ] Goodison S, Yuan J, Sloan D, et al. The RhoGAP p rotein DLC21 functions as a metastasis supp ressor in breast cancer cells[ J ]. Cancer Res, 2005, 65 (14) : 6 042 (2009212216收稿 　责任编辑徐春燕 ) 人脐带间充质干细胞的体外分离、培养及诱导分化 3 肖宏涛 1) ,牛希华 1) ,刘 　毅 2) # 1)郑州市第一人民医院河南省烧伤诊治网络中心 郑州 450004　2)兰州军区兰州总医院烧伤整形科 兰州 730050 #通讯作者 ,男 , 1964年生 ,博士 ,教授 ,主任医师 ,研究方向 :脂肪组织 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 , E2mail: L iuzhih20002003@ yahoo. com. cn 　　关键词 　脐带间充质干细胞 ;分离 ;培养 ;诱导分化 ;体外 　　中图分类号 　Q813. 1 　　摘要 　目的 :体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞 (MSCs) ,并观察其生物学特性。方法 :将剔除动静脉 的新鲜人脐带组织切成小块培养 ,得到贴壁细胞 ,倒置显微镜观察细胞形态 ,绘制第 1、5及 10代细胞生长曲线 ;流 式细胞仪测定细胞表面标记 (CD13、CD44、CD14、CD34与 HLA2DR) ;化学染色 (油红 O、茜素红染色 )及 RT2PCR检 测其体外诱导成脂和成骨分化的能力 ; RT2PCR检测胚胎干细胞特异性标志基因 OCT24。结果 :体外培养 4～6 d 后 ,有细胞从组织块中游出 ;细胞传代培养达 10代后无明显的形态和增殖能力改变。培养细胞表达 CD13与 CD44, 但 CD14、CD34及 HLA2DR呈阴性表达。体外诱导实验证实 ,该细胞具有成脂和成骨分化的能力。RT2PCR 显示其表达 OCT24基因。结论 :人脐带 MSCs能在体外培养、扩增并且具有和骨髓 MSCs类似的生物学特性 ,可作 为组织工程种子细胞来源。 Isolation, culturation, and induced differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells in vitro X IAO Hongtao1) , N IU X ihua1) , L IU Yi2) 1) B u rn D iagnosis and Trea tm en t N etw ork Cen ter in Henan P rovince, the F irst People’s Hospita l of Zheng2 zhou, Zhengzhou 450004　2) D epartm en t of B urn and Plastic S urgery, L anzhou Genera l Hospita l, L anzhou Comm and of PLA, L anzhou 730050 　　Key words　umbilical cord mesenchymal stem cell; isolation; culturation; induced differentiation; in vitro 　　Abstract　A im : To exp lore the conditions of isolation, purification, and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro, and study their biological characteristics. M e tho d s: After stripp ing off arteries and veins, the re2 maining parts of umbilical cord were cut into small sections and cultured. Adhere cellswere obtained, and the morphology of the cellswas observed under inverted phase contrast m icroscope. The growth curves of them were drawn and the surface an2 tigens of human umbilical cord MSCs (CD13, CD44, CD14, CD34, and HLA2DR) were detected by flow cytometry. The po2 tentiality of their osteogenic and adipogenic differentiation was detected by chem istry staining and RT2PCR, and the stem cell marker gene OCT24 was detected by RT2PCR. R e su lts: Four to six days after p rimary culture, adhere cells came out of fragments and could be maintained for 10 passageswithout obvious changes in morphology or growth pattern. Flow cytometry analysis revealed that CD13 and CD44 were exp ressed on these cells’surface,while CD14, CD34, and HLA2DR were negative3 国家自然科学基金资助项目　30872689;全军“十一五”医学科学技术研究面上基金资助项目　06MA079 ·312·Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) 　Mar. 　2010　Vol. 45　No. 2 exp ressed. The cells exhibited multi2potential of differentiating into osteogenic and adipogenic cells. RT2PCR results showed that these cells exp ressed OCT24. Co nc lu s io n: Human umbilical cord MSCs could be cultured and p roliferated in vitro and have the sim ilar biological morphology with bone marrow MSCs, and could be used for tissue engineering. 　　间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 是一类具有多向分化潜能的组织干细胞 ,可从骨髓、 外周血、脂肪及皮肤等多种组织获得 ,是一群多潜能 细胞 ,可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、脂肪及基质 细胞增殖分化 [ 1 ]。目前 MSCs的主要来源为成人骨 髓 ,但成人骨髓源 MSCs细胞数量及增殖分化潜能 随供体年龄的增加而下降 ,病毒感染率较高 ,且 MSCs的采集须行骨髓穿刺术 ,使其来源受限 [ 2 ]。 作者从人脐带分离出 MSCs,并研究其形态学、生长 特性、免疫表型及成骨与成脂分化能力 ,探讨其作为 组织工程种子细胞的可行性。 1　材料与方法 1. 1　材料、主要试剂与仪器 　脐带取自兰州军区兰 州总医院妇产科足月剖宫产健康产妇 ,均知情同意 , 采集后 4～6 h处理。低糖 (LG) 2DMEM培养基 (美 国 Gibco公司 ) ,胎牛血清 ( FBS,北京鼎国生物科技 有限公司 ) ,培养皿、6孔板及冻存管 (美国 Corning 公司 ) ,胰蛋白酶、二甲基亚砜 (DMSO )、维生素 C、 β2甘油磷酸钠、12甲基 232异丁基 2黄嘌呤 ( IBMX)、地 塞米松、吲哚美辛、胰岛素及油红 O ( Sigma公司 ) , 抗人抗体 CD132F ITC、CD142PE、CD342PE、CD442PE 及 HLA2DR2F ITC (美国 Caltag公司 ) , Trizol、逆转录 聚合酶链反应 ( RT2PCR )试剂盒 (日本 TaKaRa公 司 ) , CO2 恒温培养箱 (德国 Heracell公司 ) ,倒置显 微镜 (日本 O lympus公司 )。所有引物由 Invitrogen 公司合成。 1. 2　细胞分离与培养 [ 3 ] 　人脐带无菌条件下置于 含体积分数 10% FBS的 LG2DMEM 培养基中 , 4 ℃ 保存。在超净工作台内取出脐带 ,剔除动静脉血管 , 取脐带基质 ,用 PBS液清洗 ,剪为约 1 mm ×1 mm × 1 mm的组织块 ,接种于 LG2DMEM培养基 ,置于饱 和湿度孵箱内培养 , 4～6 d后首次换液 ,以后每 3～ 4 d更换培养基。培养 10～14 d后去除组织块。细 胞长至 80%融合时 , 2. 5 g /L胰蛋白酶 (含 1 mmol/L EDTA)消化 ,传代培养。 1. 3　细胞生长曲线绘制 　取第 1、5及 10代的培养 细胞悬液 (2. 0 ×105 cm - 2 )分别接种于 3个 6孔板 内 ,依次于培养第 1～8 d消化细胞 ,计数。细胞生 长达平台期即停止观察 ,绘制生长曲线。每个样本 进行 3次实验 ,每次实验均采用复孔。 1. 4　细胞表面抗原检测 [ 3 ] 　取第 2代培养细胞 ,弃 去培养液 ,用 PBS洗 2次 ,再用 2. 5 g/L胰蛋白酶 (含 1 mmol/L EDTA )消化 ; PBS洗涤后制成浓度为 1. 0 ×107 mL - 1 的单细胞悬液。分别加入抗人 CD132F ITC、CD142PE、CD342PE、CD442PE 及 HLA2 DR2F ITC单克隆抗体各 5 μL,最后 4 ℃孵育 30 m in,上流式细胞仪检测。 1. 5　体外诱导分化 1. 5. 1　向脂肪细胞诱导分化 　以每孔 1. 0 ×105 cm - 2的密度接种于 4个培养皿 ,当细胞达 80%融合 时 ,取其中 2个培养皿加入成脂诱导分化液 [ 4 ] :体积 分数 10% FBS、10 - 6 mol/L 地塞米松、0. 5 mmol/L IBMX、60μmol/L吲哚美辛及 5 mg/L胰岛素的 LG2 DMEM培养基 ,另 2个培养皿作对照。每 3～4 d换 液 1次。第 14天采用油红 O染色 ,于倒置显微镜下 观察脂肪滴的形成情况。 1. 5. 2　向成骨细胞诱导分化 　细胞以每孔 1. 0 × 105 cm - 2的密度接种于 4个培养皿 , 当细胞达 80%～ 90%融合时 ,取其中 2个培养皿加入成骨诱导液 :含 体积分数 10% FBS, 10 - 7mol/L地塞米松、50 mg/L维 生素 C及 10 mmol/Lβ2甘油磷酸钠的 LG2DMEM培 养基 ,另 2个培养皿作对照。每 3～4 d换液 1次。第 14天用茜素红染色检测钙化基质沉淀。 1. 5. 3　RT2PCR 检测诱导分化结果 　经诱导的细 胞 (实验组 )和未经诱导细胞 (对照组 )用 RT2PCR 在培养第 7天检测成脂转化基因过氧化物酶增殖剂 受体 ( PPARγ) 2和成骨特异性基因骨桥蛋白 (OPN ) 基因的表达。Trizol试剂盒提取总 RNA。 PPARγ2 ( 307 bp ) 上 游 引 物 : 5 ’2TTCTCCTATTGACCCA GAAAGC23’, 下游引物 : 5’2CTCCACTTTGATTGC ACTTTGG23’; OPN ( 330 bp )上游引物 : 5’2 CTAGG CATCACCTGTGCCATACC23’,下游引物 : 5’2CAGTG ACCAGTTCATCAGATTCATC23’;内参 GAPDH ( 186 bp ) 上游引物 : 5’2CACCCACTCCTCCACCTTTGAC2 3’,下游引物 : 5’2TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC23。 反应体系 : 10 ×PCR bufferⅡ 5μL, 2 mmol/L dNTPs 混合物 5μL,上、下游引物 ( 20μmol/L )各 1μL, Taq DNA聚合酶 1μL, 25 mmol/L MgCl2 4μL, cDNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 2μL, RNase2free水 31μL,定容至 50μL。PCR 反应条件 : 94 ℃ 10 m in; 94 ℃变性 30 s; GAPDH 55 ℃、OPN 59 ℃、PPARγ2 50 ℃退火 30 s; 72 ℃延伸 1 ·412· 郑州大学学报 (医学版 ) 　2010年 3月 　第 45卷 　第 2期 m in,共 30个循环 ,然后 72 ℃延伸 10 m in。扩增产 物以 20 g/L 的琼脂糖凝胶电泳 ,紫外灯观察并 照相。 1. 5. 4　胚胎干细胞特异基因 Oct24检测 　采用 RT2 PCR法。取第 1、10代培养至 80%融合时的细胞及 第 1、10代成脂诱导 7 d的细胞 , Trizol试剂盒分别 提取总 RNA,逆转录得 cDNA。Oct24 (235 bp )上游 引物 : 5’2CCGAAAGAGAAAGCGAACC23’, 下游引 物 : 5’2CCCTGAGAAAGGAGACCCA23’; 内参 GAP2 DH同 1. 5. 3。反应体系 : 10 ×PCR bufferⅡ 5μL, 2 mmol/L dNTPs 混合物 5 μL, 上、下游引物 ( 20 μmol/L)各 1μL, Taq DNA聚合酶 1μL, 25 mmol/L MgCl2 4μL, cDNA模板 2μL, RNase2free水 31μL, 定容至 50μL。PCR条件 : 94 ℃ 10 m in; 94 ℃变性30 s; GAPDH 55 ℃, Oct24 57 ℃退火 30 s; 72 ℃延伸 1 m in,共 30个循环 ,然后 72 ℃延伸 10 m in。扩增产物以 20 g/L的琼脂糖凝胶电泳 ,紫外灯观察并照相。2　结果2. 1　细胞形态及生长特点 　组织块培养 4～6 d后 ,可见有典型的纺锤形细胞从组织块游离出来 ,贴壁细胞的形态为梭形或多角形 (图 1A ) ;培养 10d左右可见大量散在分布、贴壁生长的细胞集落 ,2～3周细胞达 100%融合 (图 1B ) ;传至第 10代未见细胞有明显的形态学改变 (图 1C)。 图 1　原代和传代细胞的形态变化 ( ×100) A:原代培养第 6天 ; B:原代培养 2～3周 ; C:第 10代培养第 3天。 2. 2　细胞生长曲线 　第 1、5及 10代的细胞具有以 下共生长特征 :培养潜伏期 12～24 h, 2 d后进入对 数生长期 ,对数增殖期持续 3～5 d, 5～7 d后长满 培养皿底 ,进入细胞生长平台期 ,生长停止。10代 以内的细胞各代间增殖能力无明显差别。 2. 3　细胞表面抗原检测 　第 2代细胞可检测到 CD13、CD44等 MSCs标志物的阳性表达 ,而造血系 细胞表面抗原 CD14、CD34及免疫排斥反应重要抗 原 HLA2DR未见表达。 2. 4　体外诱导分化观察 　成脂诱导第 7天 ,倒置显微镜下即可见部分细胞胞质内脂滴形成 ,第 14天 ,油红 O染色呈阳性 ,但脂滴较小 (图 2A ) ;对照组细胞无脂滴形成 ,油红 O染色阴性 (图 2B )。成骨诱导第 14天 ,实验组茜素红染色可见有红色颗粒构成的小片状结节 ,颗粒大小不均 (图 2C) ;对照组细胞茜素红染色未见红色矿化物沉积 (图 2D )。RT2PCR证实上述被诱导的细胞分别表达成脂及成骨特异性基因 PPARγ2和 OPN,而未诱导组细胞无表达 (图 3) 。 图 2　成脂和成骨诱导分化的 M SC s(倒置显微镜 ) A:成脂诱导第 14天 ,油红 O染色阳性 ( ×200) ; B:成脂诱导的阴性对照 ( ×200) ; C:成骨诱导第 14天 ,茜素红染色阳性 ( × 100) ; D:成骨诱导的阴性对照 ( ×100)。 ·512·Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) 　Mar. 　2010　Vol. 45　No. 2 图 3　M SC s诱导分化后 PPARγ2和 O PN的表达 M:Marker; 2:成骨分化 ; 4:成脂分化 ; 1, 3:分别为 2和 4的阴 性对照。 2. 5　胚胎干细胞特异基因 O ct24检测 　RT2PCR检 测结果表明 ,第 1、10代细胞均表达 Oct24 mRNA ,但 成脂诱导后未见 Oct24 mRNA的表达 (图 4)。 图 4　第 1、10代培养细胞成脂诱导前后 Oct24 mRNA的表达 M:Marker; 1, 4:内参 GAPDH; 2, 5:分别为第 1代及第 10代 未成脂诱导组 ; 3, 6:分别为 2和 5的阴性对照。 3　讨论 研究 [ 527 ]表明从脐带基质可分离出同骨髓 MSCs 生物学特性相似的 MSCs。作者曾采用文献 [ 627 ]的 培养方法 :将切碎的脐带组织块置 DMEM 培养基 (含体积分数 10% FBS、25 mmol/L 谷胺酰胺、100 kU /L青霉素和 0. 1 g/L链霉素 )培养 ,结果发现从 脐带游离出的成纤维样细胞增殖缓慢 ,体积大、多突 触、多细胞核 ,且随着培养时间延长 ,细胞逐渐凋亡。 如果改用含体积分数 10% FBS、100 kU /L青霉素 , 0. 1 g /L链霉素的 DMEM培养基 ,继续培养 1～2 d 后 ,发现培养皿中出现大量体积变小的梭形细胞 ,且 细胞增殖速度加快。研究 [ 8 ]表明细胞培养液中谷 氨酰胺的自然分解及能量代谢都会产生大量的氨 , 对细胞有较强的毒性作用。在体外培养中 ,过高浓 度的谷氨酰胺会对细胞的生长产生限制。一般培养 液中谷氨酰胺的含量应为 1～4 mmol/L [ 9 ]。所以作 者认为用 DMEM培养基培养人脐带 MSCs时 ,不需 另加高浓度的谷氨酰胺。 该研究结果显示 ,从脐带中提取到的细胞有很 强的增殖能力 ,流式细胞仪检测结果表明其抗原标 志与骨髓 MSCs相同 ,生物学特征与骨髓 MSCs相 似 ,且培养细胞具有成脂和成骨分化能力 ,更进一步 证明了人脐带 MSCs具有多向分化潜能。此外 ,第 1、10代细胞均表达胚胎干细胞特异性抗原 Oct24 mRNA , Oct24对维持干细胞未分化状态具有重要意 义 [ 10 ]。 总之 ,作者建立了人脐带 MSCs的培养方法 ,该 法简单、易操作且费用低 ,细胞扩增能力未随传代次 数的增加而明显下降 ,经多次传代后仍能处于未分 化状态 ,所获 MSCs可作为组织工程种子细胞来源 , 在脂肪、骨等组织工程和相关疾病治疗方面有着广 阔的应用前景。 参考文献 [ 1 ] 裴雪涛. 干细胞实验指南 [M ].北京 :科技出版社 , 2006: 83 [ 2 ] Bertani N,Malatesta P, Volp i G, et al. 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