一例猪伪狂犬病毒分离和鉴定

中国动物检疫 2007年第24卷第4期 伪狂犬病(pseudorabies,PR)是 猪疱疹病毒Ⅰ型引起的一种多种家 畜感染得的急性传染病。其特征为 发热、奇痒及脑脊髓炎.可引起妊娠 母猪繁殖障碍、流产、死胎、呼吸症 状。新生仔猪除出现神经症状外还 可侵害消化系统。临床症状主要表 现为腹泻、呕吐、生长不良等。在自 然条件下猪、牛、绵羊、犬、猫、兔、鼠 等及多种野生动物都能发生感染。 试验结果证实猪和鼠类是自然界中 病毒的主要贮存宿主,也是引起其 他家畜发病的疫源动物。猪既是本 病原的原发感染宿主,又是病毒的 长期贮存者和排毒者,在伪狂犬病 的传播上起着重要作用。河南某猪 场发生临床症状相似的传染病。从 病猪脑部采集病料,对病毒进行分 离鉴定。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 试验材料 可疑病料采自河 南某猪场病猪脑部,PRV阳性血清, PRV阴性血清和 PRV 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 强毒株 (闽A株)均由郑州牧专中心试验室 保存。PK-15细胞由郑州牧专中心 试验室保存。 1.2 试验试剂 明胶、DMFM自购 J-Sigma公司,新生犊牛血清购自杭 州四季青生物工程材料研究所。 1.3 病料处理 无菌取病猪脑部与 PBS(0.1M,pH7.2)以 V/V1:5制成 一例猪伪狂犬病毒分离和鉴定 韩 勇 1,2) 李文刚 1,3)* 项朝荣 1) 高卫科 1) 王 鑫 1) 魏娟 1) (1河南农业大学 郑州 450002 2日照市畜牧局 2768003郑州牧专 450011) *通讯作者 通讯地址:郑州牧业高等专科学校科研处 2.3 染色镜检结果:49份可疑细菌 均为革兰氏阳性小杆菌,大小为 0.4-0.5μm×0.5-2.0μm;在油镜下 观察,49份可疑细菌均出现轻微旋 转或翻滚样的运动。 2.4 生化试验:分离出的 49份可 疑细菌分别在 SIM培养基上有动 力、不产硫化氢;在TSI琼脂上底层 和斜面产酸,不产硫化氢;在羊血琼 脂平板上产生窄小透明的 β型溶 血环,其它生化结果见下表,均与单 核增生李斯特氏菌标准株生化试验 结果一致。 2.5 协同溶血试验:靠近金黄色葡 萄球菌接种点的 49份可疑细菌溶 血均增强,与单核增生李斯特氏菌 标准株试验结果一致。 3 讨论 3.1 李斯特氏菌的检测方法主要有 细菌分离、血清学检测、ELISA技术、 基因探针技术、PCR技术等。原来我 局使用国家标准检测单增李斯特氏 菌,至少需要4d才能完成检验。2004 我局用商品化的Reveal李斯特氏菌 快速检测试剂盒,进行单增李斯特氏 菌检测。该试剂盒利用侧流式免疫色 谱分析技术,可快速检测食品及环境 样品单增李斯特氏菌,检测和初步鉴 定可在43h内完成。该试剂盒特异 性强,对任何其它微生物反应均未发 现有交叉反应。该方法已经通过 AOAC认证(RI#960701),敏感性为 1-25CFU/25g样品。 从 2004年 8月我局开始使用 该方法,到 2006年底为止,共检样 1523批,经过 Reveal李斯特氏菌 快速检测试剂盒初筛、初筛出 61 批;然后在显色培养基上分离细菌, 最后确认检出单增李斯特氏菌 49 批,其生化反应结果及协同溶血试 验结果,均与单核增生李斯特氏菌 标准株试验结果一致,符合单增李 斯特氏菌的特征,因此确定分离的 可疑细菌就是单增李斯特氏菌。初 筛出61批,最后确认检出单增李斯 特氏菌49批,准确率达80.3%。 根据国家质量监督检验检疫总 局第26号令《进出境肉类产品检验 检疫办法》的规定,目前对单增李斯 特氏菌只需要进行监测性检验。从 2004年 8月到 2006年底为止,我 局共检样1523批,检出单增李斯特 氏菌49批,阳性率达3.2%,存在一 定风险。为了严防有害有毒物质进 境,切实保护我国消费者身体健康 和公共卫生安全,以后有必要进一 步加强进口肉类产品单增李斯特氏 菌的检验。 3.2 该方法比较简单,主要使用常 规仪器。基层实验室使用该办法也 不需要购买新的仪器,对基层实验 室比较实用。但在使用中,需要严格 按照实验规程进行操作,否则会影 响检测结果的准确性。此外,基层实 验室分离鉴定的单核增生李斯特氏 菌,最好送上级实验室或参考实验 室复核,防止将李斯特氏菌属其它 细菌鉴定为单核增生李斯特氏菌, 避免出现假阳性结果。 3.3 一般标准方法都推荐使用选 择性培养基。本实验直接使用显色 培养基,选择性强,平板上的菌落特 征更明显更容易识别,对快速检测 比较适用。但缺点是成本比较高。 参考文献(略) 文章编号:1005-944X(2007)04-0040-02 防检技术 -40- 中国动物检疫 2007年第24卷第4期 OIE向非洲国家提供1800万剂禽流感疫苗以防H5N1型家禽禽流感 在过去三个月期间,OIE向非洲国家提供了 1800万剂量合格的禽流感疫 苗用于预防 H5N1家禽禽流感,其中送往埃及 1400万剂量、马里 100万剂量、毛 里塔尼亚20万剂量和塞内加尔10万剂量。 非洲联盟非洲动物资源局(AU-IBAR)负责分发工作,包括对各国冷链及运 行状况以及国家免疫程序进行合格审查。疫苗供应商将由OIE根据产品质量、 价格和送货快捷程度进行国际招标。 本刊袁丽萍供稿 匀浆,反复冻融3次,3000r/min离 心15min,取上清中加双抗,37℃作 用18h;经0.45um滤膜除菌。 1.4 小鼠接种试验 取 10只 8周 龄 Balb/c小鼠,其中 4只腹腔注射 病料滤液0.2ml/只,另4只背部脊 柱附近皮下注射病料滤液 0.2ml/ 只。接种后观察小鼠的采食、饮水、 精神状况及临床表现。 1.5 细胞接种试验 接种 0.5ml 病毒滤液于长成单层的细胞。连续 观察,直到出现细胞病变(CPE)。 1.6 分离毒的毒价 滴定 PK-15 细胞培养于96孔细胞板上,待细胞 生长成单层。分离病毒作10倍系列 稀释(病毒浓度为10-1-10-10).每个稀 释度接种 8孔.每孔 0.1ml,第 11, 12列为空白对照。 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 各个梯度的 病变数,连续观察5d。参照杜念兴 主编《兽医免疫学》[1]中的 Karber法 计算出分离毒的TCID50。 1.7 微量中和试验鉴定分离毒 (固 定病毒稀释血清法) 将 PRV阴性 血清和阳性血清分别进行 10倍系 列稀释 (血清浓度为 10-1-10-10),加 等 量 的 200TCID50,37℃感 作 20 min。分别接种96孔板单层PK-15 细胞,每孔0.1m1,每个稀释度接种 8孔,第11列为空白对照,第 12列 为标准强毒株对照(200TCID50)。记 录各个梯度的细胞病变数,连续观 察5d。同时设标准强毒株(闽A株) 与阳性血清及标准强毒株(闽 A株) 与阴性血清对照。方法同上。 1.8 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 根据基因库的 PRV gE基因设计 1对引物鉴定 该病毒。 Prv 上游引物:5'-agtactcgcaggggc gcaact-3’下游引物 3'-tgtgga tgtggttctagccgc-5' 1.9 聚合酶链式反应(PCR) 将病 毒接种PK-15细胞。当细胞病变达 80%以上时收集细胞,用常规方法提 取病毒DNA[2],用TE溶液溶解沉淀, 分装备用-70℃冻存 (殷震等.1997)。 按照宝生物工程(大连)有限公司LA PCR试剂盒说明进行扩增.反应程序: 94℃5min,94℃ 1min,55℃1min, 72℃1min,共进行30个循环。72℃ 10min,最后取PCR产物在1%琼脂 糖凝胶上电泳鉴定。 2 结果与分析 2.1 小鼠接种试验 小鼠接种病 料12h后,.表现打堆,不爱活动,其 中1只小鼠出现后肢麻痹,可能是 病毒侵入神经引起麻痹;48h后 2 只小鼠出现被毛逆立;60h后 3只 小鼠死亡,直到72h共死亡6只。 2.2 细胞病变的观察 PH-15细 胞接种病料12h后出现空洞,细胞 变圆,第 24h出现明显的拉网病 变,48h细胞脱落。 2.3 分离毒的毒价滴定 不同稀 释度的病毒在 96孔细胞板 PK-15 细胞单层出现的CPE。结果见下表, 经统计细胞病变.参照以下 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 TCID50=1,+d(S-0.5)[3] 计算该病毒在Vero细胞培养 物的毒价为10-9.45/0.1ml。 2.4 微 量 中 和 试 验 结 果 分 析 PRV阳性血清特异中和分离毒,抑 制细胞病变,说明所分离的病毒是 伪狂犬病毒。 2.5 PCR反应结果分析 琼脂糖 凝胶电泳鉴定结果表明,扩增出的 片段大小约为370bp,与预期长度 相符。图1。 3 讨论 分离伪狂犬病毒可以将采集的 样品匀浆接种易感细胞加以增殖, 通过特异性抗血清中和试验检测特 异性细胞病变加以鉴定,还可以用 PCR来鉴定。作者从急性死亡病猪 脑部分离出的病毒,经过动物接种 试验、细胞接种试验及对其毒价进 行滴定初步判断其为伪狂犬病毒; 经中和试验 PRV阳性血清能够特 异中和分离毒,抑制细胞病变;根据 PRVgE基因设计的引物对分离毒 DNA进行 PCR反应,可扩增出特 异性条带。以上结果可鉴定分离毒 为伪狂犬病毒。 参考文献 1.杜念兴.兽医免疫学,北京:中国农 业出版社,1995. 2.殷震,等.动物病毒学,北京:科学 出版社,1997:988-1009 3.范伟兴,等.中国顶防兽医学报, 2003,25(4):294-298. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! " !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!" ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! " 防检技术 -41-