IL-6-诱导LNCaP-上皮间质转化(EMT)并增强细胞对抗雄

二甲双胍抑制IL-6诱导的LNCaP增殖及上皮间质转化章国亮1，姜庆1，江军2（400010重庆，重庆医科大学附属第二医院泌尿外科1；400042重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科2）[摘要]目的探索二甲双胍抑制前列腺癌发展的作用机制。方法使用慢病毒感染构建IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6（IL-6过表达病毒转染）和LNCaP-ctr（空病毒转染），运用激光共聚焦扫描确定转染效果，ELISA 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 LNCaP、LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞IL-6分泌水平，倒置显微镜观察细胞形态。实验分为LNCaP-ctr组、LNCaP-IL-6组、LNCaP-ctr+二甲双胍组和LNCaP-IL-6+二甲双胍组，MTT技术检测相对细胞数量，流式细胞技术检测二甲双胍对细胞周期的影响；Westernblot检测LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞TWIST和E-Cadherin表达水平。实验分为LNCaP-IL-6和LNCaP-IL-6+二甲双胍组，运用细胞迁移实验检测两组细胞迁移速度，Westernblot技术检测两组细胞TWIST和E-cadherin表达水平。结果激光共聚焦扫描和ELISA检测证明IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6构建成功，LNCaP-IL-6细胞IL-6分泌水平约为LNCaP-ctr的5000倍。MTT实验显示第5天LNCaP-IL-6相对细胞数量约为LNCaP-ctr的1.4倍，二甲双胍对LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr的抑制率分别为0.58和0.65，处理组的LNCaP-IL-6相对细胞数量约为LNCaP-ctr的1.6倍；流式细胞仪检测显示二甲双胍阻滞LNCaP的细胞周期为S期。细胞形态学观察和Westernblot检测证实IL-6诱导LNCaP发生上皮间质转化，细胞迁移实验显示二甲双胍可抑制LNCaP-IL-6细胞的迁移，Westernblot进一步证实二甲双胍降低LNCaP-IL-6TWIST表达及升高E-Cadherin表达。结论二甲双胍能够抑制IL-6诱导的LNCaP细胞的上皮间质转化。[关键词]前列腺癌；二甲双胍；上皮间质转化；LNCaP[中图法分类号][文献标志码]A［基金项目］国家自然科学基金（81172442/H1619）；重庆市国际合作项目（2011GZ0047）［通信作者］姜庆，E-mail:jq001002@sina.com；江军，E-mail:jiangjun1964@yahoo.com.cnMetformininhibitsIL-6inducedLNCaPproliferationandepithelial-mesenchymaltransitionZhangGuoliang1，JiangQing1，JiangJun2(DepartmentofUrology,TheSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010;DepartmentofUrology,DapingHospital/InstituteofSurgeryResearch,TheThirdMedicalUniversity,Chongqing400042)[Abstratc]ObjectiveDetectingthemechanismbywhichmetformininhibitsprostatecancerprogression.MethodslentivirustransfectionwasusedtoconstructIL-6over-expressingLNCaPstablecellline（LNCaP-IL-6）andLNCaPcontrolcellline（LNCaP-ctr）,ThenlaserscanningconfocalmicroscopeandELISAassaywasusedtoconfirmIL-6over-expressingLNCaPcellline;morphologyofthecellswasobservedunderinvertedmicroscope;Thefollowingexperimentswerecarriedoutonthefourgroups:LNCaP-ctr，LNCaP-ctrwithmetformin，LNCaP-IL-6andLNCaP-IL-6withmetformin.MTTassaywasusedtodetectcellrelativenumber,Flowcytometrywasusedtoanalysetheaffectionofmetforminoncellcycle;woundhealingassaywasusedtodetecttheinvasiveabilityofLNCaP-IL-6eitherwithorwithoutmetformin.WesternblotassaywasusedtodetectE-CadherinandTWISTexpressionlevelofLNCaP-ctrandLNCaP-IL-6，andthealterationofthemaftertreatedwithmetformin.ResultsLaserscanningconfocalmicroscopescanningandELISAassayattestthattheconstructionofLNCaP-IL-6issuccessful,thesecretionlevelofIL-6byLNCaP-IL-6was5000theamountofLNCaP-ctr.MTTassayindicatedthatLNCaP-IL-6relativecellnumberwas1.4timestheamountofLNCaP-ctrandinmetformintreatedgroupitisupto1.6timesafterculturedfor5days，theinhibitionratesofLNCaP-IL-6andLNCaP-ctrare0.58and0.65respectively.FlowcytometryresultsindicatedthatmetforminarrestLNCaPcycleinSphage.MorphologyobservationandwesternblotshowEMTamongLNCaP-IL-6cells.Wound-healingassayprovedthatmetformininhibitedLNCaP-IL-6migration.WesternblotshowedadecreaseinTWISTlevelandapromotioninE-Cadherinlevel.ConclusionThisstudydemonstratethatmetforminreversesIL-6inducedLNCaPcellepithelial-mesenchymaltransition.[Keywords]ProstatecancerMetforminEMTLNCaPSupportedbynaturesciencefoundationofChina（81172442/H1619）,andinternationalcooperationprojectsfoundationofChongQing（2011GZ0047）.Correspondingauthor:JiangQing,E-mail:jq001002@sina.com；JiangJun,E-mail:jiangjun1964@yahoo.com.cn上皮间质转化是前列腺癌进展的重要机制之一。新近文献表明IL-6在前列腺癌的进展中起重要作用［1］。IL-6主要是以自分泌或旁分泌生长因子的方式促进前列腺癌的发展1[]，它还能够诱导乳腺癌、胰腺癌等多种癌细胞发生间质化（EMT）而使细胞获得侵袭和生存能力更强的表型2[ADDINEN.CITE-3]ADDINKyMedRef2008REF:REF。二甲双胍是治疗2型糖尿病常用的药物之一，具有潜在的抗癌作用，流行病学研究显示服用二甲双胍的糖尿病患者患癌风险低于未服药者，服用二甲双胍的癌症患者预后也好于未服用者6[ADDINEN.CITE]。二甲双胍被证明在体外能杀死多种癌细胞7[ADDINEN.CITE-8]。本研究通过构建IL-6过表达前列腺癌LNCaP细胞株(IL-6过表达病毒转染,LNCaP-IL-6），检测IL-6对LNCaP增殖的调节作用，结合细胞形态学观察和Westernblot检测，证实IL-6诱导LNCaP上皮间质转化作用。用2mmol/L二甲双胍处理LNCaP-ctr（空病毒转染）和LNCaP-IL-6，检测二甲双胍是否逆转IL-6诱导的LNCaP的增殖优势和上皮间质转化，探索二甲双胍抗前列腺癌的可能机制。1材料与方法1.1材料RMPI1640培养基、胎牛血清、胰酶、PBS均购自Hyclone公司，慢病毒（pSB388IL-6过表达慢病毒和pSB33对照病毒）购自上海生博医学生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 科技有限公司，TWIST多抗购自SantaCruz公司，E-cadherin购自Epitomics公司，ELISA试剂盒（CHE0009）购自北京四正柏生物科技有限公司，凝胶配置试剂盒（KPG113）和MTT试剂盒（KGA311）购自凯基公司。1.2LNCaP细胞培养LNCaP细胞株由第三军医大学西南医院中心实验室提供，用含10%（体积分数）胎牛血清的1640培养基培养，孵箱培养条件为37℃、5%CO2.。1.3IL-6过表达慢病毒感染实验取处于对数期生长的LNCaP细胞，培养瓶中细胞饱和度＞80%，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为1×105/mL，以2×104/孔接种到24孔板。实验分为3组：IL-6过表达病毒组（pSB388）、对照病毒组（pSB33）、正常组。IL-6过表达病毒（pSB388）和对照病毒（pSB33）滴度分别为5.34×108、1.22×109TU/mL，以MOI值为20计算，每孔加入的病毒数量为4×105TU。感染8h后，弃上清，更换为新鲜培养基，400μL/孔，于第3天观察绿色荧光表达情况，出现绿色荧光表达后加入含2μg/mL飘零霉素的RMPI1640完全培养基对阳性细胞进行纯化筛选，以1μg/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养。将细胞依次转移到6孔板和培养瓶进行传代扩增并冻存细胞株。1.4ELISA鉴定IL-6过表达LNCaP细胞株取处于对数期生长的LNCaP-IL-6、LNCaP-ctr和LNCaP细胞，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为1×105/mL，将细胞以5×104/孔接种于24孔板，每种细胞设3个复孔。次日更换新鲜培养基，400μL/孔，第3天收集上清做ELISA分析。标准品的稀释和加样：加入1.0mL稀释液至冻干标准品中，待彻底溶解后，震荡混匀；准备7个干净的EP管,第1个EP管加入750μL的稀释液，其余加入500μL稀释液。取溶解后的标准品250μL加入1号EP管内，混匀后从1号取500μL加入2号管，混匀后再从2号管取500μL加入第3个EP管，依此方法对标准品进行梯度稀释，使EP管内标准品浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9pg/mL。加样：实验组设3个复孔，另设1个空白孔，加入100μL样品和标准品至反应孔内37℃，90min；加入生物素化抗体工作液100μL/孔，37℃，60min；加入酶结合物工作液100μL/孔，37℃，30min加入显色剂100μL/孔，37℃，10min；加入终止液100μL/孔，混匀，测D（450）值。标准品和样品的检测结果运用Excel2003软件得出标准曲线和公式，并计算样品中IL-6的浓度。1.5MTT细胞增殖分析实验分组：LNCaP-ctr组、LNCaP-IL-6组、LNCaP-ctr+2mmol/L二甲双胍组和LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组。取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为5×104/mL，按5000/孔接种到4个96孔板，每组设6个复孔，用10%FBS1640培养基进行培养，于接种后的第1、3、5天进行MTT实验，结果用SPSS18.0统计软件进行检验。1.6流式细胞检测细胞周期取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，胰酶消化后制成细胞悬液并进行活细胞计数，以3×105/孔接种于6孔板，24h后更换新鲜完全培养基并给实验组细胞培养基中加入2mmol/L的二甲双胍共培养48h，PBS洗涤细胞2遍，加入胰酶消化，1000r/min离心3min，弃上清，加入PBS洗涤1次，离心，弃上清，加入300μLPBS重悬细胞，加入700μL无水乙醇固定，4℃过夜，于次日进行流式细胞仪检测。1.7细胞划痕修复实验取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，按3×105/孔接种于6孔板，待细胞汇合率达到90%即进行实验。用10μL规格Tip头于6孔板正中划一横线使细胞脱落，用PBS缓冲液洗去脱落细胞，加入含1%活性炭过滤的胎牛血清（CS-FBS）培养基1mL/孔，实验组培养基中加入2μL1mol/L的二甲双胍，使其终浓度为2mmol/L，对照组培养基中加入等体积的PBS，分别于划痕后0、24、48h于倒置显微镜下观察细胞迁移情况并采图。1.8Westernblot检测取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，胰酶消化后制成细胞悬液并进行活细胞计数，以3×105/孔接种于6孔板，48h后取出用预冷的PBS洗3遍，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白。LNCaP-IL-6在接种24h后换液并加入2mmol/L二甲双胍处理48h，提取总蛋白。Westernblot分析E-cadherin、TWIST的表达水平的变化。1.9统计学方法采用SPSS18.0统计软件，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。2结果2.1LNCaP细胞转染后IL-6表达的检测慢病毒感染成功后，用ELISA和荧光显微镜检测目的基因的表达（图1、2）。构建的慢病毒基因组中均带有绿色荧光蛋白基因，LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6均带有较强的绿色荧光，表明慢病毒基因组在宿主细胞中稳定表达。LNCaP-IL-6组IL-6表达量为（5802±128.09）pg/mL，LNCaP-ctr组为（1.14±0.19）pg/mL，LNCaP组为（1.98±0.84）pg/mL。A：LNCaP-IL-6绿色荧光标记B：LNCaP-IL-6对照;C：LNCaP-ctr绿色荧光标记;D：LNCaP-ctr对照图1绿色荧光标记显示病毒感染效率2.2二甲双胍对LNCaP-ctr及LNCaP-IL-6细胞增殖及迁移的影响LNCaP-ctr细胞形态规则，排列紧密，呈鹅卵石状或多角形；而LNCaP-IL-6细胞呈纺锤状和长梭形，细胞排列散乱，说明IL-6有诱导LNCaP细胞上皮间质转化倾向（图2）。MTT细胞增殖实验结果显示无二甲双胍处理LNCaP-IL-6表现出较为明显的快于LNCaP-ctr细胞的生长优势；而在含有2mmol/L二甲双胍的完全培养基培养条件下，LNCaP-ctr细胞和LNCaP-IL-6细胞的增殖均受到一定程度的抑制，但LNCaP-IL-6细胞受抑制的程度小于LNCaP-ctr细胞（图3）。细胞划痕修复实验显示在划痕后48h，LNCaP-IL-6细胞缺口已接近愈合状态，而对照划痕缺口仍比较明显（图4）。ABA：LNCaP-ctr组；B：LNCaP-IL-6组图2倒置显微镜LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6形态观察，放大倍数400X1、LNCaP-ctr；2、LNCaP-ctr+2mmol/L二甲双胍组；3、LNCaP-IL-6；4、LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组a：P＜0.05，与相应对照组比较；b：P＜0.05，与LNCaP-ctr组比较图3MTT法检测二甲双胍对LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6增殖的影响1：LNCaP-IL-6对照起始；2：LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组起始；3：LNCaP-IL-6对照48h；4：LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组48h图4划痕实验检测二甲双胍对LNCaP-IL-6细胞迁移的影响2.3二甲双胍对LNCaP细胞周期的影响二甲双胍处理组S期细胞比例明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。表1二甲双胍对LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6细胞周期的影响[n=3，（x±s）%] 组别 G1 S G2 LNCaP-ctr 68.23±0.8 15.87±0.64 15.9±1.4 LNCaP-ctr+2mmol/L二甲双胍组 54.16±0.78 32.97±1.26a 12.87±0.97 LNCaP-IL-6 62.93±0.59 22.33±2.97 14.74±2.43 LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组 59.25±1.07 31.56±0.94a 9.19±1.85aa：P＜0.05，与未加二甲双胍组对比2.4二甲双胍对LNCaP-IL-6TWIST和E-Cadherin蛋白表达的影响LNCaP-ctr组TWIST和E-Cadherin蛋白相对比值分别为（0.13±0.01）和（0.51±0.05），LNCaP-IL-6组分别为（0.43±0.02）和（0.19±0.02）。两组间TWIST和E-Cadherin表达差异有统计学意义（P＜0.05）。加入二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞TWIST和E-Cadherin相对比值分别为（0.31±0.03）和（0.74±0.06），未加二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞TWIST和E-Cadherin相对比值分别为（0.67±0.04）和（0.23±0.02），二甲双胍处理组TWIST表达水平低于对照组，而E-Cadherin高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05,图5）。SHAPE\*MERGEFORMAT1：LNCaP-ctr；2：LNCaP-IL-6；3：LNCaP-IL-6处理48h；4：LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组处理48h图5Westernblot检测LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6细胞TWIST和E-cadherin蛋白的表达3讨论本实验证明治疗2型糖尿病的药物二甲双胍可明显抑制前列腺癌细胞株LNCaP的增殖，并逆转IL-6诱导的LNCaP细胞上皮间质转化过程。上皮间质转化是指上皮细胞的表型向间质细胞转变，其过程伴随EMT转录因子的激活，E-cadherin表达缺失和细胞极性转换。在肿瘤细胞中发生EMT的细胞由于细胞间连接的缺失而更容易迁移。人类的TWIST是一种重要的EMT调节基因9[ADDINEN.CITE]，TWIST高表达与癌症的抗凋亡、耐药和血管生成有关10[]。TWIST高表达引起E-Cadherin表达下降，使癌症患者更容易发生转移11[ADDINEN.CITE]。本实验通过对LNCaP细胞进行慢病毒感染，获得IL-6过表达的LNCaP-IL-6稳定细胞株。MTT实验显示在细胞培养第5天，LNCaP-IL-6的相对数量约为LNCaP-ctr的1.4倍，说明自分泌的IL-6能够明显促进LNCaP细胞的增殖；2mmol/L的二甲双胍能够显著抑制LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6的增殖，但对二者的抑制程度不一，MTT第3天和第5天结果显示LNCaP-IL-6对二甲双胍的抵抗性大于LNCaP-ctr，其机制可能与IL-6的生长促进作用有关。流式细胞仪检测显示二甲双胍处理后的LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6的S期细胞比例增多，表明二甲双胍阻滞LNCaP的细胞周期为S期。细胞形态观察显示以10%的CS-FBS维持培养48h后，LNCaP-IL-6细胞呈纺锤状和长梭形，细胞排列散乱，而LNCaP-ctr细胞形态规则，排列紧密，呈鹅卵石状或多角形，说明IL-6可诱导LNCaP细胞向间质细胞的表型转变；Westernblot实验显示LNCaP-IL-6的TWIST水平显著高于LNCaP-ctr，而E-Cadherin表达水平低于LNCaP-ctr，表明自分泌的IL-6能够诱导LNCaP上皮间质转化。新近研究发现IL-6能够提高TWIST蛋白的稳定性引起头颈部癌细胞的迁移能力增强12[ADDINEN.CITE]，本实验结论与之相符。细胞迁移实验表明二甲双胍能够抑制LNCaP-IL-6细胞的迁移，同时Westernblot检测显示二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞的TWIST蛋白水平下降，E-cadherin水平上调，说明二甲双胍通过抑制TWIST表达而降低E-Cadherin表达水平，从而实现对IL-6过表达诱导的LNCaP细胞上皮间质转化的逆转。研究显示，二甲双胍能够激活MAPK而引起下游靶基因mTOR的抑制，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的13[ADDINEN.CITE-14]。本研究表明IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6细胞株TWIST表达明显高于LNCaP-ctr，这与IL-6调节癌细胞的增殖、粘附、分化和抗凋亡有关15[ADDINEN.CITE]。二甲双胍对TWIST表达有显著的抑制作用，我们推测TWIST也可能是MAPK下游基因，二甲双胍经MAPK/TWIST途径，对前列腺癌细胞上皮间质转化进行控制，抑制前列腺癌细胞的转移。本研究尚未进行MAPK相关检测，需要进一步研究证实MAPK对TWIST是否存在调控。上皮间质转化是前列腺癌的发生与发展的重要机制，IL-6是诱导前列腺癌上皮间质转化的重要调节因素。本细胞实验证明，二甲双胍抑制前列腺癌细胞上皮间质转化是其抗前列腺癌的重要机制之一，有关二甲双胍在前列腺癌方面的研究尚不充分，其抗前列腺癌的详细分子机制有待进一步探讨。参考文献：[1]AzevedoA,CunhaV,TeixeiraAL,etal.IL-6/IL-6Rasapotentialkeysignalingpathwayinprostatecancerdevelopment[J].WorldJClinOncol,2011,2(12):384-396.[2]SullivanNJ,SasserAK,AxelAE,etal.Interleukin-6inducesanepithelial-mesenchymaltransitionphenotypeinhumanbreastcancercells[J].Oncogene,2009,28(33):2940-2947.[3]HuangC,YangG,JiangT,etal.TheeffectsandmechanismsofblockageofSTAT3signalingpathwayonIL-6inducingEMTinhumanpancreaticcancercellsinvitro[J].Neoplasma,2011,58(5):396-405.[4]NotoH,GotoA,TsujimotoT,etal.Cancerriskindiabeticpatientstreatedwithmetformin:asystematicreviewandmeta-analysis[J].PLoSOne,2012,7(3):e33411.[5]BoS,BensoA,DurazzoM,etal.DoesuseofmetforminprotectagainstcancerinType2diabetesmellitus?[J].JEndocrinolInvest,2012,35(2):231-235.[6]CurrieCJ,PooleCD,Jenkins-JonesS,etal.Mortalityafterincidentcancerinpeoplewithandwithouttype2diabetes:impactofmetforminonsurvival[J].DiabetesCare,2012,35(2):299-304.[7]KatoK,GongJ,IwamaH,etal.Theantidiabeticdrugmetformininhibitsgastriccancercellproliferationinvitroandinvivo[J].MolCancerTher,2012,11(3):549-560.[8]SikkaA,KaurM,AgarwalC,etal.Metforminsuppressesgrowthofhumanheadandnecksquamouscellcarcinomaviaglobalinhibitionofproteintranslation[J].CellCycle,2012,11(7):1374-1382.[9]LiuAN,ZhuZH,ChangSJ,etal.Twistexpressionassociatedwiththeepithelial-mesenchymaltransitioningastriccancer[J].MolCellBiochem,2012,367(1-2):195-203.[10]ZhangL,YangM,GanL,etal.DLX4UpregulatesTWISTandEnhancesTumorMigration,InvasionandMetastasis[J].IntJBiolSci,2012,8(8):1178-1187.[11]FuJ,ZhangL,HeT,etal.TWISTrepressesestrogenreceptor-alphaexpressionbyrecruitingtheNuRDproteincomplexinbreastcancercells[J].IntJBiolSci,2012,8(4):522-532.[12]SuYW,XieTX,SanoD,etal.IL-6stabilizesTwistandenhancestumorcellmotilityinheadandneckcancercellsthroughactivationofcaseinkinase2[J].PLoSOne,2011,6(4):e19412.[13]VakanaE,PlataniasLC.AMPKinBCR-ABLexpressingleukemias.Regulatoryeffectsandtherapeuticimplications[J].Oncotarget,2011,2(12):1322-1328.[14]RochaGZ,DiasMM,RopelleER,etal.Metforminamplifieschemotherapy-inducedAMPKactivationandantitumoralgrowth[J].ClinCancerRes,2011,17(12):3993-4005.[15]SanterFR,MalinowskaK,CuligZ,etal.Interleukin-6trans-signallingdifferentiallyregulatesproliferation,migration,adhesionandmaspinexpressioninhumanprostatecancercells[J].EndocrRelatCancer,2010,17(1):241-253.（收稿：2012-12-11；修回：2013-02-26）（编辑龙亮）abaaa1234E-cadherin（120×103）TWIST（20.9×103）β-actin（43×103）�图3中LNCaP-IL-6+met改为LNCaP-ctr+2mmol/L二甲双胍组，LNCaP-IL-6+met改为LNCaP-IL-6+2mmol/L二甲双胍组