噬菌体展示技术和其通用实验技术简介ppt课件

噬菌体展示技术及其通用实验技术简介报告人：王东方*噬菌体展示Phagedisplay*1.什么是噬菌体展示技术？噬菌体展示技术(PhageDisplayTechniques,PDT)是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。使大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。*1.1噬菌体展示技术的发展Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。SmithGP.Science1985;228:1315-7*1985第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽SmithGP.Science.1985;228:1315-71988噬菌质粒系统1990抗体片段的展示1993展示cDNA文库1994/1995研发了‘phagetwo-hybrid’技术1996首次体内invivo淘选试验1998噬菌体展示载体作为基因导入载体1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001Automatedphagedisplayselection*2.噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。*外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。*3.常用的噬菌体展示系统*3.1噬菌体结构图1.噬菌体结构示意图*3.2噬菌体的分类因为噬菌体主要由蛋白质外壳和核酸组成，所以，可以根据蛋白质外壳或核酸的结构特点对噬菌体进行分类。根据噬菌体蛋白结构可分为：无尾部结构的二十面体有尾部结构的二十面体线状体*按照噬菌体的核酸类型分类可分为：ssRNA：噬菌体中所含的核酸是单链RNA。dsRNA：噬菌体中所含的核酸是双链RNA。ssDNA：噬菌体中所含的核酸是单链DNA。dsDNA：噬菌体中所含的核酸是双链DNA。*3.3噬菌体侵染细菌噬菌机理噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌感染而死亡。噬菌体除了能使宿主细菌裂解死亡外，还有一些噬菌体感染细菌后，并不使细胞死亡，称为温和噬菌体，这些噬菌体感染细菌后，将其自身的基因组整合进宿主细胞的基因组，此时，这种宿主细菌称为溶原性细菌。*3.3噬菌体侵染大肠杆菌*3.4λ噬菌体展示系统（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。（2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。*3.5T4噬菌体展示系统T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面，事实上，在DNA包装被抑制时，T4是双链DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体（SOC和HOC也同时组装）。因此，在用重组T4做疫苗时，它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。*3.6单链丝状噬菌体展示系统丝状噬菌体是一个能够感染革兰氏阴性细菌的病毒大家族，他们都含有单链DNA基因组，都包装于由含有几千拷贝的主要衣壳蛋白（PⅧ）和位于顶端的次要衣壳蛋白（PⅢ）所组成的少许柔韧性的管状衣壳中。M13和Fd噬菌体均是丝状噬菌体。*M13噬菌体遗传图谱和结构示意图3.6.1M13噬菌体的组成和结构*次要衣壳蛋白PⅢPⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠杆菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠杆菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。3.6.2次要衣壳蛋白PⅢ展示系统*PⅢ展示系统，PⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。*3.6.3主要衣壳蛋白PⅧ展示系统PⅧ展示系统。PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，每个病毒颗粒有2700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。*3.6.4噬菌粒载体和辅助噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。噬菌体的特征：携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其它噬菌体基因；有质粒复制起点(322ori)和噬菌体复制起点（Ffori用于合成ssDNA)；有包装序列信号；有供筛选的抗生素标记基因；噬菌粒载体可以方便克隆，提高遗传的稳定性。*相比噬菌体载体噬菌粒具有以下优点：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。*pCANTAB5e噬菌体质粒图谱*辅助噬菌体可以提供噬菌粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需的所有蛋白和酶。能够帮助噬菌体载体在大肠杆菌体内包装复制。比如M13KO7辅助噬菌体。M13KO7辅助噬菌体是由M13噬菌体改造而来，在M13复制起点插入了卡那霉素抗性基因用于筛选。能够在唔噬菌体质粒的情况下复制当有噬菌体质粒时，由于噬菌体质粒含有野生型M13或者是f1复制起点，因此，单链噬菌体质粒的DNA会被优先包装并分泌。*噬菌粒在辅助噬菌体的帮助下在大肠杆菌体内完成组装*4.单链丝状噬体展示在重组抗体制备中的应用噬菌体展示技术的应用：1.抗原表位分析2.制备特异性抗体3.制备疫苗，多价疫苗4.构建新型生物催化剂（Renetal在1997年将T4DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效的连接粘性或是平末端。这就有可能吧催化某一代谢途径的多种酶展示于噬菌体上，制造出人工的多酶复合体，或者把众多的酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制作出superenzyme）*4.1单链丝状噬菌体展示在鼠源重组抗体制备中的应用抗体制备时噬菌体展示技术的重要应用之一，噬菌体展示技术可以用来从天然抗体文库中筛选特定的抗体，也可以用于人源或是鼠源免疫抗体文库的的抗体筛选制备。现在以鼠源单链重组抗体的制备为例，简述一下噬菌体展示技术在抗体制备中的作用和方法。*噬菌体抗体文库的构建类型主要有三种：天然抗体文库，免疫文库，合成抗体文库。在残留分析领域最为实用的技术是免疫抗体文库。免疫抗体文库在免疫过程中经历了一个亲和突变的过程，因此从免疫抗体文库中筛选出来的抗体具有更高的亲和力和特异性。*抗体（Ab）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造。其中小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统中表达及易于对其进行基因工程操作等优点而受到研究者的重视，并成为基因工程抗体的研究热点。常见的单价小分子抗体有scFv、Fab、Fv等。其中scFv小分子抗体具有抗体抗原识别的全部位点，而且分子量小，稳定，易于表达的优点被广泛的采用，现以scFv单链重组抗体为例做简述。*4.2scFv单链重组抗体的制备*scFv重组基因的构建***scFv基因与噬菌体质粒pCANTAB5e连接*重组后的噬菌体质粒转化进宿主细胞，并在辅助噬菌体的帮助下在宿主体内完成组装，复制，增值的过程。*融合蛋白的表达是低价的，只有不到10％的噬菌体可以表达融合基因，其余噬菌体展示的均是野生型噬菌体的p3蛋白，所以想要获得亲和高特异性好的噬菌体文库需要进行多轮的淘筛来进行筛选。*淘筛—亲和淘筛*经过多轮淘筛之后获得亲和性高特异性好的噬菌体，然后扩增保种，表达svFv基因，获得抗体蛋白，然后抗体蛋白经过纯化定量之后，就可用于下一步的残留检测。*5.噬菌体展示技术应用与展望*1、抗体制备抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞,中和响尾蛇毒素的单链抗体，等等。2、疫苗展示在噬菌体表面的HIV-1的gp120-V3环可象天然抗原一样引起显著的免疫应答,等等。3.多肽类药物如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13肽，它能中和蛇毒α-bungarotoxin；从CX7C多肽库中掏选到一个多肽能与Hantavirus结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素*4、肿瘤药物导航载体用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具。5、信息传递研究利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80和一个Hantaviral受体；受体的配体，如血管促生素、α-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3和WW区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。*6、DNA结合蛋白锌指蛋白是一类DNA结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的DNA序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同DNA序列的锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与DNA结合位点之间的识别规则，可以通过设计锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。*7.蛋白质组学噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。*谢谢大家*此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！*