枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢

生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 第 17卷 第 4期 2005年 8月 Vol. 17, No. 4 Aug., 2005 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢 形成过程中的几个关键事件 刘　燕，秦玉昌*，潘宝海 （中国农业科学院饲料研究所，北京 1 0008 1） 摘　要：在枯草芽孢杆菌形成芽孢的整个过程中，基因表达的方式主要由 Spo0A、σH、σ F、σE、σG 和 σK等因子来控制。不对称分裂(asymmetric division)和裹吞作用(engulfment)是芽孢形成过程中经历的 两个非常特殊的形态结构变化。各 sigma因子出现的时间与地点都与这两个形态结构的变化紧密相连。 本文将主要介绍芽孢形成起始点的调控，不对称分裂和裹吞作用发生的机制与 σF、σE、σG 和 σK等 sigma 因子活化的时间和地点等方面的研究近况。 关键词：枯草芽孢杆菌；Spo0A；不对称分裂；裹呑作用；σ F；σ E；σ G；σ K 中图分类号：Q934；Q939.124　　文献标识码：A Several crucial events in sporulation of Bacillus subtilis LIU Yan, QIN Yu-Chang*, PAN Bao-Hai (Feed Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract: In the whole process of sporulation of Bacillus subtilis, Spo0A, σH, σF, σE, σG and σK are key regulators to the pattern of gene expression. Asymmetric division and engulfment are two mainly morphogenetic changes. The time and place of the sigma factors appearance have connection with two morphogenetic changes. This article is about the initiative of sporulation, the process of asymmetric division and engulfment, regulation of the activation of σF, σE, σG and σK. Key words: Bacillus subtilis; Spo0A; asymmetric division; engulfment; σF; σE; σG; σK 文章编号 ：1004-0374(2005)04-0360-04 收稿日期：2005-04-04；修回日期：2005-05-03 作者简介：刘　燕(1982—)，女，硕士研究生；秦玉昌(1965—)，男，硕士，研究员，*通讯作者；潘宝海(1971 —)， 男，博士，助理研究员。 1　引言 当外界条件适宜形成芽孢时，Spo0A的含量和 磷酸化水平都达到一定阈值，Spo0A-PO4的存在提 高了 σH 的表达量，在 Spo0A-PO4和 σH的共同作用 下，细胞发生不对称分裂，产生大小不等的两个细 胞，前芽孢(forespore)和母细胞(the mother cell)。 这两个细胞在经历短暂的基因组含量不等之后，各 自拥有一条完整的染色体。前芽孢和母细胞基因表 达程序是完全不同的，但又相互影响。首先 σF在 前芽孢中活化，随后导致 σE在母细胞中活化。两 个细胞在σF和σE的作用下发生裹吞，母细胞将前芽 孢吞入胞内。裹吞作用发生之后，在 σF和 σE的共 同作用下，σG 在前芽孢中活化，随后导致 σK 在母 细胞中活化。最终前芽孢在 σF和 σG的作用下发育 为成熟的芽孢；母细胞在 σE 和 σK的作用下形成皮 层和芽孢衣等保护性结构，并最终裂解，释放成熟 的芽孢。 2　Spo0A与芽孢形成的起始 2.1　Spo0A的简介 　DNA结合蛋白 Spo0A是细胞 从营养生长期进入芽孢形成时期的关键应答调节 (master response regulator) 蛋白。Spo0A由两个结 构域构成，N 端的磷酸基团接受结构域和 C 端的 361第4期 刘　燕，等：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢形成过程中的几个关键事件 DNA 结合结构域，中间通过灵活的铰合部连接。 Spo0A-PO4是其活化形式。磷酸化诱导 Spo0A自身 二聚化，二聚化的 Spo0A对基因启动子区域重复的 “0A-box”的亲和力增加，从而作为基因的抑制或 激活的转录因子而行使功能(图 1)。“0A-box”序 列由TGNCGAA 7个核苷酸组成(其中N代表任意核 苷酸)。在枯草芽胞杆菌中，Spo0A的磷酸化是由 五种组氨酸蛋白激酶KinA、KinB、KinC、KinD、 KinE和两种磷酸传递蛋白Spo0F 和Spo0B组成的磷 酸中继转移(phosphrelay)系统完成的。具体的氨基 酸顺序为His-Asp-His-Asp。当外界信号适宜，五 种蛋白激酶之一自我磷酸化其上的一个 His残基， 磷酸化的蛋白激酶将磷酸基团传递给 Spo0F上的一 个Asp残基，再通过磷酸化转移酶 Spo0B上的一个 His残基将磷酸基团传递给 Spo0A N端的一个Asp， 而将 Spo0A活化(图 2)。Spo0A的去磷酸化是由磷 酸酶 Spo0E、YisI和YnzD来实现的。这三种磷酸 酶具有很高的同源性，同属于一个家族，但三种酶 表达的情况各不相同：Spo0E主要由于营养缺乏而 被诱导表达；YnzD在富含葡萄糖的环境下被诱导 表达；YisI 则是在营养体时期组成型表达。同时 Spo0F的去磷酸化也会影响到 Spo0A的磷酸化水 平。Rap家族的 RapA、RapB、RapE是 Spo0F去 磷酸化酶。 2.2　胞外环境因素与Spo0A的活性　细胞是否开始 形成芽孢最终由内外环境条件来决定。内外界环境 是否适宜开始形成芽孢最终反映为 Spo0A的含量和 磷酸化水平。只有当 Spo0A的含量和磷酸化水平达 到一定阈值，芽孢才开始形成。影响芽孢形成的外 界因素主要是细胞密度和营养状态[3](图 2)。磷酸酶 调节蛋白 Phr是一种被分泌到胞外的蛋白。当环境 中细胞密度过大，Phr被寡肽通透酶Opp运回胞内 并活化。活化的 Phr蛋白可以专一性(即 phrA抑制 RapA，phrE抑制RapE)抑制磷酸酶 Rap的活性，导 致 Spo0F的磷酸化水平升高，最终反映为 Spo0A的 磷酸化水平提高[4]; 反映环境中营养状况的胞内鸟嘌 呤磷酸化水平的关键效应蛋白 CodY也是通过抑制 phrA、phrE及 KinB等来影响 Spo0A磷酸化水平 的[5]; 胞内DNA的损伤以及DNA复制过程中不正确 的中止都可以导致芽孢不能形成。当遇到这些情况 时，原本受到DnaA和LexA抑制的 sda基因不再受 到抑制，使之表达。Sda可破坏 KinA的自我磷酸 化过程，从而阻碍了 Spo0A被磷酸化过程[6]。 2.3　Spo0A调节子　Spo0A作为细胞芽孢形成起始 的关键应答调节蛋白，受其直接或间接调控的基因 有 500多个，占枯草芽孢杆菌全部基因组的 1/8。 121个基因受到 Spo0A的直接调控，其中 1/3是正 调控，2/3是负调控[7]。Spo0A改变基因转录的能 力除了来自磷酸化，还需要量的积累， Spo0A对其 自身编码基因 spo0A 具有正调控的作用。spo0A基 因具有两个启动子：一个被 E-σA；另一个被 E-σH 识别。在营养生长期σH的编码基因 spo0H的转录是 受ArbB的蛋白抑制的，使 σH含量保持在一个较低 的水平，这时 s p o 0 A 基因的转录主要是依赖于 E-σA，从而保持 Spo0A蛋白在一个较低的水平。当 形成芽孢的条件适宜，一定量的 Spo0A被磷酸化，图1　Spo0A二聚化后的二级结构[1] 图2　芽孢形成的起始[2] 注：—┤表示抑制；→表示激活。 362 生命科学 第17卷 Spo0A-PO4可以抑制 ArbB的表达，解除 ArbB对 spo0H基因转录的抑制，增加了 σH的表达量，同 时也提高了 Spo0A自身的表达量。作为激活因子 时，Spo0A- PO4一般是识别基因启动子中的“0A- box”序列。其中最重要的是分别是位于前芽孢和 母细胞中编码特殊的 sigma因子 σF和 σE的 spoⅡ A 和 spoⅡ G操纵子。yjcP与 yneE和 ybcO与 ybcP、 ybcQ、ybcS、ybcT、ybcA、ybcB组成的 7顺反子 操纵子也是处于 Spo0A的直接控制之下。在不对称 分裂完成之后，Spo0A在母细胞侧仍然行使其转录 因子的 职责 岗位职责下载项目部各岗位职责下载项目部各岗位职责下载建筑公司岗位职责下载社工督导职责.docx [8 ]。 3　不对称分裂过程 不对称分裂是芽孢形成过程中第一个重大的形 态结构变化。在枯草芽孢杆菌的营养体对称分裂中 所需要的基因在不对称分裂过程中都需要(可能除 PbpB 外)。但有几点不同，首先，染色体要进一 步成形成轴丝(axial filament); 其次，分裂装置不是 在细胞中部而是细胞的两个亚极点；再次，隔膜要 薄，含的肽聚糖也较少，形成的位置也不在两个拟 核体中间。 轴丝是染色体的复制原点 oriC区域，从细胞的 中部移向细胞的两极，并在 Spo0J、Soj、DivⅣ A 和RecA 蛋白的作用下形成的贯穿于细胞整个长轴的 结构。轴丝的结构已经通过电子显微镜和荧光显微 镜观测到，不能形成轴丝的细胞是不能进行对称分 裂的。当染色体复制原点 oriC区域到达细胞极部 时，RecA蛋白取代分裂抑制蛋白MinCD与DNA结 合。DivⅣA蛋白以依赖Spo0J/Soj的方式通过DNA 结合蛋白 RecA蛋白将染色体定位于细胞极部。接 着就开始分裂装置在两个亚极点的组装。研究表 明，在不对称分裂时，由 FtsZ形式的 Z环首先在 细胞中部组装，然后 Z环通过由两个肌动蛋白Mb1 和MreB形成的动力螺旋中间体(dynamic helical intermediate)转移到两个亚极点[9]。Spo0A依赖表达 的SpoⅡE蛋白在Z环的正确定位过程中也起到很重 要的作用。SpoⅡ E蛋白以 FtsZ依赖的方式结合于 不对称分裂的位点。酵母双杂交实验表明，SpoⅡ E 和 FtsZ两者可直接相互结合。FtsZ环定位以后，隔 膜就开始形成。由于隔膜形成的位置不是在两个拟 核体的中间，隔膜刚刚形成后所形成的两个细胞， 一个包含 2/3的染色体，另一个包含 4/3的染色体。 包含 2/3染色体的是将来要发育为芽孢的前芽孢， 为了保持基因的完整性，需要一个由 DNA转移酶 SpoⅢE来完成的DNA转移过程，此过程需要ATP。 在此过程中出现了15 min左右的在母细胞和前芽孢 两侧基因不对称。这短暂的基因不对称可能在建立 母细胞和前芽孢两侧基因区域化表达中起到重要 作用。 研究发现几种蛋白的突变会造成不对称分裂完 全的失败。Spo0A缺失，会使不对称不能发生，只 能发生对称分裂；Spo0H蛋白缺失会使 Z环在两个 亚极点的组装均不完善，不能发生分裂；不对称分 裂完成之后，如果 SpoⅡA或 SpoⅡG突变，导致 母细胞中由E-σE转录的SpoⅡD、SpoⅡM、SpoⅡP 不能正常出现，则在另一个亚极点会发生第二次分 裂，产生两个前芽孢样的，但不能最终形成成熟芽 孢的细胞。 4　不对称分裂完成与 σF和 σE的活化 在不对称分裂完成之后并且前芽孢中得到一条 完整的染色体之前，σF就在前芽孢侧被活化。不 对称分裂前的σF的活性被抗sigma因子SpoⅡAB抑 制。分裂后这种抑制被抗抗 sigam 因子 SpoⅡAA 所解除。SpoⅡAA的活性受到其自身磷酸化水平的 调节。分裂前被具有磷酸激酶活性的 SpoⅡAB磷 酸化而钝化。分裂后，由于磷酸酶 SpoⅡ E的存在 使之去磷酸化而活化(图 3)。SpoⅡ E在不对称分裂 过程中与 FtsZ相结合，对不对称分裂是必不可少 的。SpoⅡ E被认为是将不对称分裂与在前芽孢中 活化这两个事件连接起来的蛋白。 σE在母细胞中的 活化是紧接着发生在σF在前芽孢中活化之后。一旦 接到前芽孢中的信号(SpoⅡ R蛋白)，定位于膜上 的 pre-σE即被蛋白酶 SpoⅡGA切割为活化的 σE。 pre-σE的编码基因的转录可以极大地被 Spo0A所加 强。近来研究表明，不对称分裂后，Spo0A的含 量在母细胞侧比在前芽孢侧高得多。这可能解释 σE 只存在于母细胞侧的原因[8]。生物芯片 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，存在 于157个操纵子中的253个基因直接被σE所控制[10]。 这足以说明母细胞在σE的作用下，基因的表达方式 出现了很大的改变。 5　裹吞作用 不对称分裂后前芽孢和母细胞特异活化的σF和 σE导致隔膜被修饰，以及隔膜中的肽聚糖从隔膜的 中间位置开始向四周被裂解(而不是对称分裂时的从 四周向中间)。但两个细胞并不像一般细胞分裂那 样相互分开，而是大的母细胞将小的前芽孢裹吞进 细胞内部，形成一个细胞游离在另一细胞内部的形 363第4期 刘　燕，等：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢形成过程中的几个关键事件 式。整个裹吞过程可以分为三步：首先，隔膜中 所含的肽聚糖逐渐裂解消失；其次，隔膜与外周膜 相交处的膜逐渐在前芽孢侧向一起聚拢，直至融 合；再次，前芽孢与母细胞完全分开，此时前芽 孢又被包裹上一层膜，并悬浮于母细胞中。 对裹吞过程的分子机理目前了解尚少。三个与 裹吞相关的蛋白 SpoⅡD、SpoⅡM、SpoⅡ P(这 三种蛋白与防止出现两次分裂也有关，见上文)是 在母细胞中合成，并定位于隔膜。认为这三种蛋白 起到水解肽聚糖的作用，并促使裹吞作用开始[11]。 SpoⅡQ是一个由前芽孢中合成的，裹吞所必须的 蛋白，它插入并在裹吞过程中一直保留在隔膜中， 其具体的功能目前尚不清楚。 6　裹吞作用完成与 σG和 σK的活化 σG和 σK的编码基因是分别由前芽孢中的 σF和 母细胞中 σE所形成的 RNA 聚合酶转录的。裹吞完 成之后被活化。σG在裹吞之前就存在，只是以未 被活化的形式。σG的活化需要 spoⅢ J和 spoⅢA基 因。spoⅢ J基因是组成型转录的，而 spoⅢ A只 在母细胞侧被转录[12]。目前的解释可能是操纵子 spoⅢ A的某个产物作为信号，从母细胞侧传给前 芽孢侧的 spoⅢ J，从而活化 σG 。σG 的活化过程 可能还需要某些未知因子(图 3)。 σK是最后一个活 化的 sigma 因子。与 σE相似，σK也是最初以非活 化的前体形式存在的。 σK的编码基因 sigk 是由 spoⅣCB和 spoⅢC基因通过去除大约 42kb的间插 DNA的位点特异重组而得来的。重组酶是SpoⅣCA 蛋白。pre-σK的切割是由 SpoⅣ FB完成的。一般 情况下SpoⅣFB和SpoⅣFA与BofA结合形成复合 物，只有在接到有前芽孢中 σ G 转录的信号蛋白 SpoⅣ B后[13]，复合物才能打开，解除对 SpoⅣ FB 的抑制，出现活化的 σ K。 7　展望 枯草芽孢杆菌芽孢形成过程的简单性和可操作 性，已经使其成为研究原核细胞发育过程的模型。 芽孢形成过程的研究不仅对基础科学有重大意义， 而且也具有巨大应用潜力。芽孢被用作生物计量 器、天然杀虫剂、工业上生产酶、抗生素以及微 生态制剂等已经有很长时间。最近有报道，利用枯 草芽孢杆菌芽孢上的芽孢衣蛋白CotB和CotC成功地 表达了破伤风毒素的C末端(TTFC)和大肠杆菌的热 不稳定毒素(LTB)，被用作口服疫苗饲喂小鼠后， 得到了相应的抗血清。与其他疫苗相比，用芽孢制 作的口服抗原具有热稳定、安全、制作简单、成 本低廉等优点。 [参　考　文　献] [1] Bará k I, Ricca E. 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