黄体生成素类似物对离体大鼠颌下腺细胞分泌神经生长.doc

黄体生成素类似物对离体大鼠颌下腺细胞分泌神经生长.doc 黄体生成素类似物对离体大鼠颌下腺细胞分泌神经生长 【摘要】 目的: 探讨黄体生成素(LH)类似物对离体大鼠颌下腺细胞分泌神经生长因子(NGF)的影响。方法: 体外孵育大鼠颌下腺细胞并给予不同浓度的LH类似物, 采用酶联免疫分析(ELISA)方法检测上清液中神经生长因子的含量。结果: 当加入终浓度为10-6、 10-4、 10-2 U/L的LH类似物孵育颌下腺细胞时, NGF的分泌量随着浓度的升高而逐渐增高; 当LH类似物浓度为10-2、 100、 102 U/L时, NGF的分泌量随LH类似物浓度的递减而降低; 同时随着时间的增加, NGF的分泌量也会增加, 孵育8 h时达高峰, 随后开始下降。结论: 在体外LH类似物可双项调节大鼠颌下腺细胞分泌NGF的功能。 【关键词】 LH受体 颌下腺 神经生长因子 ELISA 大鼠 先前的研究已经证实大鼠的颌下腺组织存在黄体生成素(luteinizing hormone, LH)受体,1, 2,, 并且已知其LH受体的基因序列与大鼠睾丸组织的完全一致,2,, 这说明大鼠颌下腺是LH作用的靶器官, LH通过与其特异性受体结合, 介导特定的生理功能。本实验我们在原有研究的基础上, 采用离体细胞孵育法和酶联免疫(ELISA)技术, 探讨了LH类似物对颌下腺分泌功能的影响, 为LH对消化系统进行功能调节提供依据。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1 材料 正常雄性SD大鼠22只(质量250,300 g), 购自第四军医大学实验动物中心; LH类似物及胶原酶均购自Sigma公司; NGF定量ELISA检测试剂盒购自美国EBIOSOURCE公司; DME/F 12培养基购自Gibco公司; 小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所; DG 3022型酶联免疫检测仪由国营西安华东电子管厂生产; CO2孵箱由美国Nuaice公司生产。 1.2 方法 1.2.1 大鼠颌下腺细胞的分离 根据文献,3, 4,介绍的方法并稍作修改。选用正常雄性SD大鼠22只, 禁食24 h, 饮水不限, 经腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉, 750 mL/L乙醇酒精消毒颈部后, 暴露并剪取双侧颌下腺, 立即置冰冷的生理盐水中, 反复冲洗干净并去除表面结缔组织, 用眼科剪剪碎, 剪成体积至少小于1 mm3, 置于一定量的0.1 g/L胶原酶中, 放置室温搅拌消化30 min, 然后过70 μm筛网, 1000 r/min离心终止消化并收集细胞, 并以DME/F 12培养液洗涤1次, 然后用DME/F 12培养液(含50 g/L小牛血 清)制备成细胞悬液, 经台盼蓝(1 g/L)染色, 其成活率可达95%以上。 1.2.2 实验分组 用DME/F 12培养液(含50 g/L小牛血清)调整细胞密度为1×109/L, 种植入24孔培养板中, 每孔1 mL, 置37?、 950 mL/L O2和50 mL/L CO2培养箱中孵育, 实验分为两大组, 第一大组按照每3孔为一组将其随机分为5个试验组和一个对照组。孵育2 h后, 分别加入LH类似物, 使其终浓度分别为10-6、 10-4、 10-2、 100、 102 U/L, 孵育8 h后, 1 000 r/min离心, 取上清。第二大组仍按照每3孔为一组将其随机分为5个试验组和各自的对照组, 孵育2 h后, 加入10-2 U/L的LH类似物, 分别于孵育2 h、 4 h、 6 h、 8 h和10 h后, 1000 r/min离心, 取上清, 留作ELISA检测。 1.2.3 酶联免疫分析(ELISA)程序 采用双抗体夹心ABC ELISA法, 将抗大鼠NGF单克隆抗体(mAb)包被于酶标板上, MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714794351155_0品和样品中的NGF与mAb结合, 加入生物素化的抗大鼠NGF抗体, 形成免疫复合物连接在板上, 然后通过显色等进行检测, 具体步骤如下: ?实验前20 min从冰箱取出试剂盒, 以平衡至室温; ?建立标准曲线; ?加样: 待测品孔中每孔加入样品100 μL, 将反应板置入37?, 2 h, 然后用洗涤液充分洗涤3 min×5次, 并在滤纸上印干, 同时设立阴性对照和空白对照; ?每孔中加入第一抗体工作液100 μL, 将反应板充分混匀后置入37?、 60 min, 然后用洗涤液充分洗涤3 min×5次, 并在滤纸上印干; ?每孔加入酶标抗体工作液100 μL, 将反应板置入37?、 60 min, 然后用洗涤液充分洗涤3 min×6次, 并在滤纸上印干; ?每孔中加入底物工作液100 μL, 置37?暗处反应10 min, 然后每孔加入50 μL终止液混匀; ?读板: 立即用酶标仪测定各孔492 nm处A值, 每孔测3次, 取其均数作为该孔的最终检测值, 并根据标准曲线计算出实验组及对照组NGF的含量。 1.2.4 统计学处理 实验数据均以x?s表示, 并采用 SPSS11.5统计软件进行方差分析。 2 结果 2.1 不同浓度的LH对离体大鼠颌下腺细胞分泌NGF的影响 将不同浓度的LH类似物 (10-6、 10-4、 10-2、 100、 102 U/L)加入培养液中, 孵育8 h后, 其上清液经ELISA检测各孔492 nm处吸光值, 并根据标准曲线获得各组NGF的含量, 发现随着药物浓度在逐渐增加, 颌下腺细胞分泌NGF的含量也逐渐增加, 至10-2 U/L时达到最高, 随后随着药物浓度的升高, NGF的含量逐渐下降。经方差分析, F=29.61, 除了对照组与10-6 U/L (A)组、 10-4 U/L (B)组与100 U/L (D)组、 100 U/L (D)组与102 U/L (E)组之间P>0.05外, 其余 各组之间P<0.05(图1)。 图1 不同的LH类似物浓度对大鼠颌下腺细胞分泌NGF的影响(略) Fig 1 Effects in various concentration of LH analogs on secretion of NGF in submaxillary gland of rats 2.2 LH不同加药时间对离体大鼠颌下腺细胞分泌NGF影响的时间依赖性 将10-2 U/L浓度的LH类似物加入培养液中, 分别孵育2 h、 4 h、 6 h、 8 h、 10 h后, 收集取上清, 经ELISA检测后, 发现颌下腺细胞分泌NGF的含量也逐渐增加, 至8 h时达高峰, 随后增加时间, NGF的含量并不增加,经放差分析, F=56.13。各用药组之间, 除2 h和4 h组、 6 h组和10 h组、 8 h组和10 h组之间没有差异外, 其余各组间P<0.05, 各对照组之间无差异,但与用药组之间有差异(图2)。 图2不同孵育时间对大鼠颌下腺细胞分泌NGF的影响(略) Fig 2 Effects of different incubation time of LH analogs on secretion of NGF in submaxillary gland of rats 3 讨论 LH受体与绒毛膜促性腺激素(hCG/CG)受体是具有相似立体结构的同一个受体, 属于含有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体超家族, 在哺乳动物生殖过程中起重要的调节作用。LH和CG通过与靶细胞上的LH/CG受体结合, 激活腺苷酸环化酶系统, 引起甾体激素的合成与分泌, 参与哺乳动物性腺发育、 受精卵着床及一系列功能活动的调节。但近年来大量的研究证据表明, LH/CG受体广泛存在于性腺轴之外, 对多个系统和脏器进行生理调节,5, 6,。Toth等,7,发现, 在子宫肌层血管平滑肌细胞、 血管内皮细胞及子宫内膜上皮细胞上均存在有LH/CG受体, 并可以直接调节子宫血管流量, 增加子宫血运, 如在体时给予hCG肌注, 可以明显降低子宫血管阻力, 特别是在植入期还可以促进血管的发生; 而离体时给予hCG, 则可以使子宫血管平滑肌增加血管舒张类物质的分泌。Lin等,8,发现, 孕妇的T淋巴细胞可以表达LH/CG受体, 并提出hCG对孕妇是一种免疫调节剂, 但是其具体的调节机制还不清楚。P含量明显升高, 而使环氧合酶2(COX 2) 水平明显降低, 二者均呈剂量依赖性, 但是在对宫颈阴道部组织则无此作用。cAMP的升高说明LH/CG受体的作用途径可能是通过激活腺苷酸环化酶/cAMP和磷脂酶C(PLC)/IP3两个信号传递系统进行的; COX 2下降可使宫颈处的前列腺素E2下降, 而这种下降可以诱导宫颈的成熟。 目前的研究表明颌下腺不仅是一种重要的外分泌腺, 而且是具 有内分泌细胞属性的、 可归属于消化道弥散性神经内分泌系统一部分的腺体, 其功能已超过一般消化腺的范畴。其颗粒曲管(GCT)及大于颗粒曲管的上皮细胞可以分泌多种血管活性物质, 如肾素、 NGF、 表皮生长因子等, 但关于LH对颌下腺分泌NGF的影响尚未见报道。我们先前的实验已经发现,2,, 大鼠颌下腺颗粒曲管(GCT)及大于颗粒曲管的上皮细胞均呈LH和LHR免疫反应阳性, 上述细胞同样含有LH和LHR mRNA杂交信号, 即大鼠颌下腺这类上皮细胞既能产生LH, 又能表达LHR, 说明LH对颌下腺功能作用可能是通过自分泌或旁分泌的作用来实现的。本实验中观察到LH在一定的浓度范围内对颌下腺细胞NGF的分泌有刺激作用, 并呈剂量依赖性。但当LH浓度较高, 达到10-2 U/L以上时, 又呈现NGF的下降。同时加药时间对NGF分泌也有一定影响, 加药孵育8 h一定NGF分泌达高峰,随后又呈现NGF的下降, 并呈时间依赖性, 以上结果提示, LH类似物对颌下腺NGF的分泌可能起双项调节作用。 总之, 我们运用离体细胞分离、 孵育及酶联免疫技术, 首次研究了LH类似物对颌下腺分泌NGF的影响, 说明外源性的LH可直接作用于颌下腺GCT细胞上的LH受体, LH受体是一种G蛋白偶联受体, 它可以激活腺苷酸环化酶(AC)和磷脂酶C(PLC)/IP3两个信号系统, 并调节其分泌NGF的功能, 但其具体途径仍需要进一步研究。 【hemical localization and quantitative assessment of GnRH , FSH , and LH receptor mRNA Expression in canine skin: a po Cell Biol, 2006, 126(5): 527-535. ,10, Lin PC, Li X, Lei ZM, et al. Human cervix contains functional luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptors ,J,. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88(7): 3409-3414.