来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及分子作用机制（可编辑）

来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及分子作用机制（可编辑） 安徽医科大学 博士学位论文 来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及分子作用机制 姓名:司洪芳 申请学位级别:博士 专业:药理学 指导教师:李俊 20070601安徽医科大学博士学位论文 中英文缩写词对照 中文对照 英文缩写 英文对照 标记脯氨酸 【?. 【明. 明 标记胸腺嘧啶核苷 【】喂 蛋白激酶 燧 丙氨酸氨基转移酶 . 珥‘滑肌肌动蛋白牛血清白蛋白四氯化碳每分钟脉冲数细胞外基质 .胺四乙酸 凝胶迁移或电泳迁移率 。越 检测胞外信号调节激酶 . ? 胎牛血清肝星状细胞 ?一白细胞介素. 口 腹腔注射 . 氨基端激酶 枯否细胞枯否细胞条件培养基 脂多糖 丝裂原激活的蛋白激酶 基质金属蛋白酶 安徽医科大学博士学位论文 非酒精性脂肪性肝炎 ..。核因子一 血小板衍化生长因子? .血小板衍生生长因子 . 受体 一 磷脂酰肌醇激酶 活性氧 信号转导与转录激活因 双醯 子 . 转化生长因予.基质金属蛋白酶组织抑 冒毗 跚 一 制因子 卫闭肿瘤坏死因子? 肿瘤坏死因子相关凋亡 豫?, 诱导配体 一/ 肿瘤坏死因子相关凋亡 渔?购 诱导配体受体学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果.据我 所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过 的研究成果.与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明 并表示谢意. 日 期: 学位论文作者签名: 学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定.学校有权保留学位论 文并向国家主营部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版,有权将学位论文用于非 赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 馆被查阅,有权将学位论文的内容编入有 关数据库进行检索,有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后 适用本规定. 导师签名: 学位论文作者签名: 日期: 日期:安徽医科大学博士学位论文 来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及其分子作用机制 研究生司洪芳 导师李俊教授 安徽医科大学药学院,合肥, 中文摘要 肝纤维化是许多慢性致病因素作用于肝脏引起过量沉积的伤愈合过程, 激活的是产生的主要来源细胞。从静止向激活状态的转化是肝纤 维化发生的一个中心环节。相邻活化的细胞和损伤的肝细胞通过释放各种 细胞因子和活性氧 而参与活化过程。此针对 的抗肝纤维化治疗将成为治疗肝纤维化的关键步骤。目前针对的治疗主 要集中于抑制激活、增殖及胶原合成、促进胶原降解几方面。因此,为了进 一步探讨来氟米特,对肝纤维化的作用机制,我们将深人研究 活化的分子机制,揭示更多来氟米特干预活化的作用靶点。研究主要是 从细胞因子这个角度进行开展,主要以两个重要的肝纤维化细胞因子瘦素和 的信号转导通路为关键环节,为临床防治肝纤维化提供新方法、新线索。研 究内 容主要包括以下三个部分: .对/诱导的肝纤维化的影响 动物实验研究表明,预防给药、、 ?~,适可显著降低血清转 氨酶活性,血清透明质酸及肝组织羟脯氨酸的含量水平;免疫组化显示,亦可 明显抑制大鼠肝脏内型胶原及.的蛋白表达水平;提示预防给药对 诱导的肝纤维化具有明显的保护作用。体外研究发现,一定浓度的外源 性瘦素能明显刺激活化并发生表型改变,刺激其增殖和型胶原的合成。特 定的化学抑制剂、、表明,瘦素是通过激活 激酶/信号转导与转录激活因子 / 安徽医科大学博士学位论文 . ,/、分裂素活化蛋白激酶. ,.通路而传递信号 和磷酸肌醇激酶 的。流式细胞术与掺入实验表明,来氟米特的活性代谢物可通过 阻断瘦素受体的信号转导而显著抑制型胶原的分泌。而且与增殖密切相关 周期蛋白的表达也明显地被来氟米特所抑制。另一方面,可 的 显著抑制瘦素诱导的枯否细胞的活化及枯否细胞条件培养基所刺激的胶原 蛋 白的合成。以上实验结果综合说明了来氟米特在肝炎症和纤维化中的新的作 用机 理。 .体外通过阻断引起的蛋白的活化而抑制增殖 本研究结果表明慢性损伤的细胞经诱导后其条件培养液 可显著促进的增殖,.受体的表达,受体的酪氨酸磷酸化以 及受体介导的蛋白激酶家族的活化、、。本研究还发 现细胞的培养上清对的这种促增殖作用可显著被抗.中和抗体 所阻断,提示在促肝星状细胞增殖上的关键作用。的预处理对 依赖性的合成有显著的抑制作用。这种作用主要是通过抑制 介导的促细胞有丝分裂信号转导通路中的受体本身酪氨酸激酶 的活性,从而导致活性的下降,抑制的增殖。 .体外通过诱导凋亡而抑制增殖 的激活、增殖是肝纤维化发生的一个中心环节,然而诱导或促进激活的 凋亡可避免或减少聚积,这也可能成为抗肝纤维化治疗的重要对策。本 部分将以为靶标,主要集中探讨对增殖、活化的抑制及对 凋亡的诱导。本研究结果发现,慢性损伤的细胞经诱导后其条件培养 液可显著促进的增殖,此过程伴随着.与细胞因子 受体的表达。的干预可明显抑制增殖,同时诱导其凋亡。简言之, 的刺激可显著增加受体的酪氨酸磷酸化以及受体介导的 /、信号转导通路的活化。特定的化学抑制剂、 表明,蛋白激酶在促、/酪氨酸磷酸化中起主导作用。 安徽医科大学博士学位论文 的预处理可显著阻断它们的活化。而且与增殖密切相关的周期蛋白的表达也 明显地被所抑制。另一方面,可显著上调细胞表面 酶原激活,从而导致 凋亡受体的表达,增加其丰度。这个过程伴随着 其下游的蛋白的裂解,调亡负调控蛋白.的切割,最终导致促调亡因子细 的释放。以上实验结果综合说明了抑制增殖并同 胞色素 时诱导其凋亡是来氟米特在肝炎症和纤维化中的新的作用机制。 关键词:来氟米特;瘦素;星状细胞;增殖;桔否细胞;型胶原;凋亡;血小 板衍化生长因子;细胞因子;丝裂原激活的蛋白激酶;肿瘤坏死因子相关凋亡 诱 导配体受体 安徽医科大学博士学位论文. : :., 鹏 ? . 、 饵旧. . ,.,. ,?. : , ./? ,、、 ‘,/? ,, , . 安徽医科大学博士学住论文 , ./ , . / / ,, . ,, 【匐.. .僻 ... / ? , ,, .. ,’ , . .安徽医科大学博士学位论文 ,. ,’ , , 雌 . , . ., , / ./. ., ? . ? , . . 一, , .;; :; ;; ;; ;;? ; 安徽医科大学博士学位论文 来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及其分子作用机制 前言 是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织 肝纤维化 修复过程中的代偿反应,以细胞外基质 ,在肝内过量沉 积为病理特征【?】。我国是病毒性肝炎高发区,仅乙型肝炎病毒携带者就 达.亿,其中慢性乙型肝炎患者有万以上.全球慢性感染者.亿,约 ,甚至肝癌。丙型肝 %慢性乙肝患者最终将发展为肝硬化 炎病毒感染慢性化达%.%,%.%发展为肝硬化,%.%演变为 肝癌’。其他如乙醇性肝病、非乙醇性脂肪性肝炎 , 、自身免疫性肝炎及原发性胆汁性肝硬化 等疾病亦可发生肝纤维化肝硬化,而这些疾病在我国亦不少见。 肝纤维化的形成涉及多种细胞、细胞因子及的变化。目前的研究认为, ,是肝纤维化时肝脏细胞中的主要来源 肝星状细胞 细胞【】,其激活的分子机制成为研究肝纤维发生机制的中心问趔,.。各种 致肝 纤维化因素均把作为最终靶细胞,促使其转化为肌成纤维细胞而导致肝纤维 化的发生。库普弗细胞是肝脏中的巨噬细胞,当肝脏受到各种损伤 刺激后,库普弗细胞被激活,通过释放活性氧物质和细胞因子参与炎症反应, 并 可激活?。抑制巨噬细胞的浸润,可抑制的激活,从而抑制肝纤维化 的形成【。最新研究表明,在肝损伤早期,损伤相关性巨噬细胞促进肌成纤维细 胞的增生和凋亡,总起来说,使肌成纤维细胞数目增多,促进纤维增生和基质沉 积【。各种细胞因子在肝纤维化的发生、发展过程中亦起着极其重要的作用,通 过旁分泌与自分泌作用使增殖、合成大量的,促进肝纤维化的形成【。 在炎症阶段,细胞窦内皮细胞、炎症细胞和血小板可分泌多种细胞因子, 构成复杂的细胞因子网络。在众多的细胞因子中,转化生长因子 .?和血小板衍化生长因子? 安徽医科大学博士学位论文 是肝纤维化发生过程中最重要的细胞因子【她。在后炎症阶段,活化的星 状细胞亦可自分泌和,促使星状细胞进一步活化瞄。主要由 肝内枯否细胞和产生,是肝星状细胞最强力的有丝分裂原【,能够强烈刺激 增殖、迁移,促使其胶原的产生和沉积,在肝纤维化发生发展中起着非常重 要的作用【强冽。瘦素是一种新发现的细胞因子,近年来大量临床及实验 研究显示,瘦素与肝纤维化之间亦有着密切联系。 来氟米特是近年来欧美等国研制的高效、低毒的免疫调节药。在体内迅速转 化为活性代谢物而发挥作用,主要是抑制嘧啶从头合成途径中二氢乳清 酸脱氢酶,在较大剂量可抑制酪氨酸激酶依赖的信号传导系统包括 家族、.、表皮生长因子受体酪氨酸激酶,从而降低细胞对丝裂 原、细胞因子等反应性。其主要适应症为类风湿性关节炎、抗移植排斥反应、 对 系统性红斑狼疮也有治疗作用..本课题组以往的研究发现,对化学性 肝损伤、免疫性肝损伤以及诱导的慢性肝纤维化都具有明显的保护作用。为 进一步探讨对肝纤维化作用的机制,深入开展对肝内不同细胞的作用及相 应细胞内信号转导通路的研究,仍有必要意义。 的活化是肝纤维化发生的一个中心环节,因此针对的抗肝纤维化治 疗将成为治疗肝纤维化的一个重要手段。本文将以为作用靶点,从细胞和分 子水平深入开展对生物学特性和内信号分子的活化的研究,主要 集中于抑制激活、增殖及胶原合成等几方面。这将有助于阐明肝纤维化的发 病机制,揭示更多的干预活化的作用靶点,为临床防治肝纤维化提供新思路 和新方法。 研究内容包括: .来氟米特对诱导慢性肝纤维化的影响。 .体外来氟米特通过阻断引起的蛋白的活化而抑制增殖。 .体外来氟米特通过诱导凋亡而抑制增殖。 实验材料 安徽医科大学博士学位论文 .动物 ?大鼠,雄性,体重,由安徽医科大学实验动物中心 提供合格证号:皖医实动准、。动物自由进食、饮水,喂 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 颗粒饲料, 室温.,饲养常规观察一周后使用。 .药品与试剂 ..抗体 兔抗大鼠、、、辽多克隆抗体,小鼠抗大鼠? 抗体,兔抗大鼠.多克隆抗体,小鼠抗人细胞色素多克隆抗体,兔抗鼠、 多克隆抗体,鼠抗大鼠单克隆抗体,兔抗?多 克隆抗抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体一羊抗兔均购刍 公司。 鼠抗大 、 、、、单克隆抗体,鼠抗人/、 //多克隆抗体,兔抗鼠/、/协埘、 、文抛、及多克隆抗体购 公司。 兔抗大鼠型胶原购自武汉博士德生物技术有限公司。 羊抗鼠、兔抗鼠中和抗体购;公司,鼠抗兔抗鼠 、中和抗体购公司。 大鼠单核巨噬细胞单克隆抗体? ,公司产品。 ..主要试剂与药品 重组小鼠瘦素,美国公司产品。 重组小鼠,公司产品。 特定化学抑制剂与,公司产品。 特定化学抑制剂、,公司产品。 来氟米特,美国欣凯公司上海代表处 .,,提供,批 号:。 ,活性代谢物,美国欣凯公司上海代表处提供,批号:。 安徽医科大学博士学位论文 ?型胶原酶 、链霉蛋白酶、,产品。 型酶,华美公司产品。 脂多糖,产品。 新生胎牛血清 ,玛,杭州四季青生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司产品。 .培养粉、培养基干粉,美国公司产品,应用液加 、 / / 谷氨酰胺、 /青霉素、‖/链霉素、 /丙酮酸钠,.,过滤分装后,.冰箱保存备用。 山羊血清封闭液,公司产品北京中山生物技术分公司。 水合氯醛,黑龙江省医院制药厂产品。 氯仿,上海建信化工有限公司产品。 异丙醇,淮南市化学试剂厂产品。 焦碳酸二乙酯,公司产品。 甘油,蚌埠化学试剂厂。 羟脯氨酸 ,标准品,中国科学院上海生物化学研究所产 品。 氯胺.,天津市光复耩细化工研究所。 对二氨基苯甲醛,天津市博迪化工有限公司。 ,上海华舜生物工程有限公司产品。 ,比放射性为/;.,比放射性为/,均为中国 原子能研究院同位素研究所产品。 乙二胺四乙酸二钠,成都化学试剂厂产品。 四氯化碳 ,,上海长江化工厂产品,临用前用植物 油稀释。 鲁花花生油,山东鲁花集团产品。 二甲基苯青,上海华舜生物工程有限公司产品。 三氯醋酸,上海化学试剂厂。 碘化丙啶,公司产品。安徽医科大学博士擘位论文 ,双.苯基.恶唑基苯,上海化学试剂站分装厂。 ,.二苯基嗯唑,上海试剂一厂。 其余试剂均为进口或国产分析纯。 ..引物基因序列 核苷酸序列:正链, ’,反链,’;正链, ’,反链,’ ?’;链,’不?’, 一蛐反链,’;链, ’,反链,’’:正链, ’, 反链。 .’均由上海生物工程有限 公司合成。 ..试剂盒产品 丙氨酸氨基转移酶 ?,试剂盒,上海荣盛生物技 术有限公司产品。 ,试剂盒购自上海贝西公司。 透明质酸 转化生长因子 ,、、酶联 免疫试剂盒均为晶美生物工程有限公司产品。 大鼠型胶原检测试剂盒,美国嘲公司产品。 总提取试剂盒购自 公司。 试剂盒,编号:, 公司产品。 型胶原、.免疫组化染色:采用生物素一链酶亲和素一辣根过氧化酶 法进行免疫组化染色,试剂盒为美国公司产品。 显色试剂盒,公司产品北京中山生物技术分公司。 活性分析试剂盒系公司产品。 】安徽医科大学博士学位论文 蛋白浓度测定试剂盒,公司产品,编号。 电化学发光试剂盒均购 公司。 细胞核蛋白抽提试剂盒、非放射性活性的试剂盒产品号: 、.底物发光系统产品号:均购自美国 公司,宁波分公司。 ’ 仪器与设备 可见紫外分光光度计,上海精密科学仪器公司产品。 高速冷冻离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司产品。 型电子分析天平,上海精天天平仪器厂产品。 电子天平,德国恼公司产品。 .?型多头细胞收集器,绍兴坡圹医疗器械厂产品。 .水浴恒温振荡器,江苏今坛市振兴仪器厂产品。 培养箱,美国杜邦公司产品。 型倒置显微镜,产品。 电热恒温水浴锅,北京医疗设备厂意成公司产品。 .型可调高速匀浆器,江苏今坛市荣体仪器有限公司产品。 型电泳仪,美国.公司产品。 荧光显微镜,日本产品。 .医用型洁净工作台,中日合资苏州安泰空气技术有限公司。 .型液体闪烁计数仪,美国贝克曼公司产品。 酶标仪,上海雷勃分析仪器有限公司产品。 全自动高速冷冻离心机,湖南仪器仪表总厂离心机厂产品。 型台式冷冻离心机,德公司产品。 一.小型实验室纯水系统,美国公司产品。 流式细胞仪,美国简称.公司产品。扩增仪,美国公司产品。 公司产品。 细胞培养瓶和培养板,美国 安徽医科大学博士学位论文 硝酸纤维素膜,华美生物工程公司产品。 .图象分析软件 图像分析软件,进行蛋白质条带灰度值及电泳条带的灰度 比较分析。 软件,测定组织中型胶原,.染色光密度值。 软件,进行细胞周期分析。 实验方法 .动物的处理和模型的建立 .. 印诱导的大鼠肝纤维化嗍 只雄性大鼠随机分为三组:正常组只、处理组只、 /处理组只和三个剂量组、、.只。自处理之日开始, 除正常组外,给其他各组雄性大鼠腹腔注射%植物油溶液 /或同 时腹腔注射重组鼠的 /,每周次,共周。处理开始后,每 给药相对处理或等容量的%,直至第周结束。处理结束 后免疫组化检测肝组织型胶原和.蛋白表达,蛋白印迹检测肝组织.在 各组表达,生化法检测各组血清活性及肝组织羟脯氨酸的含量,法检测 各组血清、、及透明质酸含量。 .. 致大鼠化学性肝纤维化模型的制备例 将与高压灭菌植物油精致花生油按:比例配成%的油剂,自造模 之日开始,每组大鼠按 /体重背部皮下注射%植物油溶液,每周周 一四各次,共周。 .大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离、培养 .. 原位肝灌注制备肝细胞悬液 大鼠用%水合氯醛. ./,麻醉,常规消毒。剪开腹部皮肤、腹 .,含有 膜,行门静脉插管,用预温.液.%调至安徽医科大学博士学位论文 .%,灌流,流速 .。 后见肝脏膨大,颜色均匀苍白。 于肝下腔静脉插入固定另一导管,并放出积血积液。门静脉改用.% ?迅速灌入,由下腔静脉导管收集,循环灌注约 ?次。待肝脏韧性消 失,压迫下陷不易恢复时切断肝周韧带,置平皿内用眼科剪、镊去除被膜, 加.% 胰蛋白酶继续消化 ,液终止。目尼龙网过滤,加制成 混合肝细胞悬液。 ’ ..大鼠和的分离 混合肝细胞悬液 置锥形瓶,加.% 最终浓度为.%, ,水浴振荡消化 ,加 液终止。 离心 离心 ,反复次。取 弃上清,以’平衡液清洗, 离心管铺液三层:底层..%.%;中 .% 细胞悬液. 层..%与细胞悬液混合体. 。 ,分别在上中层界面吸取 ;上层. 离心 细胞,在中底层界面吸取细胞,悬浮, ,各加 离心清洗。留取少量细胞进行活力和纯度鉴定常规台盼蓝拒染试验鉴定 细胞活力;倒置显微镜下观察贮脂细胞和枯否细胞形态;荧光显微镜下计数 每视 野的蓝绿荧光阳性细胞数,鉴定细胞纯度。和细胞产量接近,约为 /肝,存活率达%以上,纯度达%以上。 。 ... 培养 将细胞重悬于含%小牛血清的培养液中,以/细胞浓 度接种于培养瓶中。%,培养 ,换液除去未贴壁细胞,纯化, 以后每隔天换液一次。在荧光显微镜下新分离的胞浆呈现蓝绿色荧光, 荧光阳性细胞的百分率约%。新分离未贴壁的呈圆形,内含折光颗粒。 细胞贴壁,呈椭圆形,部分细胞伸展。培养至第舡 ,部分细胞开始伸出伪足, 呈星形状,胞浆仍可见有折光颗粒。 后,细胞逐渐融合,增殖细胞形态较大, 并呈局灶性生长。细胞生长成单层,铺满培养瓶后,用.%胰蛋白酶..% 消化并传代。传代后的 就可贴壁生长。结果见图。 安徽医科大学博士学位论文 ...的培养 用尖头吸管小心吸取中底层界面细胞,在培养液中悬浮,离心 ×, ,洗去。将细胞重悬于含%小牛血清的培养 液中,以/细胞浓度接种于孔培养板中。%,的孵箱 中贴壁 ,吸弃培养液,用?预温的液洗涤三次,除去未贴壁细胞。重 新加入含%、牛血清的培养液,继续培养。首次于 更换新鲜的 培养液。以后每 换液一次。培养的在倒置显微镜下观察,细 胞大小不一,形态多样,呈多角形,十字型等不规则形。培养 大部分细胞伸 展生长。从接种细胞至铺满单层约需 左右。免疫细胞化学鉴定:制备的细 , 胞悬液点涂片,干燥后,大鼠大鼠巨噬细胞单克隆抗体室温下孵育 链霉菌抗生物素蛋白.过氧化物酶免疫组化试剂染色法。 .丙氨酸氨基转移酶】测定赖氏法 ..操作步骤 、在测定前将丙氨酸氨基转移酶基质液在水浴分钟后,按下表进行操 作: 测定管 对照管 血清 . . . 丙氨酸氨基转移酶基质液 混匀后,水浴分钟 . . .二硝基苯肼 丙氨酸氨基转移酶基质液 . 、混匀水浴分钟后,再分别加入. 氢氧化钠溶液.置室温 ’ 分钟。 、以对照管校正“零”点,读取在波长 处吸光度值。 、从标准曲线表查得丙氨酸氨基转移酶活力单位。 ..标准曲线绘制 安徽医科大学博士学位论文 、各管加入..二硝基苯肼. 混匀,?水浴分钟后,再分别加入. 氢氧化钠溶液. ,置室温分钟。 、以“”号管校正“零”点,读取各管在波长处吸光度值。 、以吸光度值为纵坐标,酶活力单位为横坐标绘制标准曲线。. 条件培养基 的制备【剖 船原位肝灌注分离的脏细胞原代培养、时后,分别在培养 液中加入终浓度为 /的瘦素与 /的。培养后收集上清液,以 .胂微孔滤膜过滤,滤液即为损伤的,一?冰箱保存备用。 .细胞合成测定阳尸.掺入法帮司 、取对数生长期细胞,制成细胞/的细胞悬液,接种于孔培养板中, 每孔。 、将培养扳放入、%孵箱中培养时左右,使细胞同步化。 、将细胞分成对照组、模型组和各种试剂处理组,每组设三个复孔,继续培 养小时。 、于培养结束前 每孔加入 尸.,最终浓度为./。 “ 、继续培养小时。 、终止培养,小心吸弃培养上清液,用’液洗涤次,以.%胰酶、 .%消化分散细胞后,用多通道细胞收获仪将细胞抽滤到滤膜上。 、加入预冷的%三氯乙酸洗涤,. /氢氧化钠洗涤,最后再加入 无水乙醇脱色脱水。 、取出滤膜,在?下烘干;将滤膜放入闪烁液中.%和.% 安徽医科大学博士学位论文 的二甲苯溶液,放入暗处静置 。用 .型液体闪烁计数仪测 定每分钟脉冲数,重复次取平均值。 .透明质酸测定方法 ..试剂准备 、配制洗涤液:将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按:比例稀释,得到 洗涤液备用。 、配制酶标抗体:酶标抗体须临用前配制,根据实验所需用量,取适量浓缩 酶标抗体用酶标抗体稀释液按:比例稀释。 、配制结合物:结合物须临用前配制,根据实验所需用量,取适量结合 物用样品稀释液按:比例稀释。 、准备标准品:用标准品稀释液将标准品原液 /倍比稀释,得 到浓度为 /, /, /, 咖, /的标准品。 ..操作步骤 、根据实验用量,取出相应数量的板条,其余放回密封袋中,于下密 封保存。 ;然后每孔再 、在相应的微孔中分别加入标准品或被测血清标本 标准品稀 各加入结合物,充分混匀。另取孔为空白孔,加入 释液。温箱中温育反应分钟。 、弃去微孔中液体,用洗涤液洗涤.次,洗涤完毕后,将微孔板在吸水纸 上拍干。 、每孔中加入稀释后的结合物 ,?温箱中温育反应分钟。 、弃去微孔中液体,用洗涤液洗涤次,洗涤完毕后,将微孔板在吸水纸 上拍干。 、每孔加入酶标抗体 ,温箱中反应分钟。 、弃去微孔中液体,用洗涤液洗涤次,洗涤完毕后,将微孔板在吸水纸 上拍干。 、每孔加底物缓冲液滴,避光?反应.分钟。 安徽医科大学博士学位论文 、每孔加终止液一滴终止反应,于酶标仪 处测定各孔.值。 ..结果判断 、各测定孔.值减去空白孔不加结合物,以标准品稀释液代替. 值,为测试实际.值。 、以处的.值为纵座标,的浓度为横座标,根据标准品的浓度 及相应的实际.值制得标准曲线。 、根据被测血清标本在 处的实际.值,在标准益线上求得其相对 应的浓度/。 .双抗夹心法测定、、的含量 ..准备工作 、请提前分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温。 、将浓缩洗涤液用双蒸水稀释:,未用完的放回。 、标准品:加标本稀释液.至冻干标准品中,待彻底溶解后,静置分钟 混匀,然后根据需要进行稀释,标准品浓度依此为::、.、.、 、、、、 /。师:、.、.、.、、、 . .、.、.、 .、、、 /。: /: 复溶标准品若未用完请放入.保存,稀释的标准品不得重复使用。 、生物素化抗体工作液:以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体 :。临用前分钟配制。 、酶结合物工作液:以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物:。临用前 分钟配制。 ..操作步骤 、从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,其它板条请密封放回。 、除空白孔外,分别将标本或不同浓度标准品讪,孔加入相应孔中, 用封板胶纸封住反应孔,孵箱孵育分钟。 、洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板每孔内加入洗涤液, 并去除水滴在厚叠吸水纸上拍干;反复洗涤次。安徽医科大学博士学位论文 、除空白孔外,加入生物素化抗体工作液?孵。用封板胶纸封住反 应孔,孵箱孵育分钟。 、洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板每孔内加.脚洗涤液, 并去除水滴在厚叠吸水纸上拍干;反复洗涤次。 、除空白孔外,加入酶结合物工作液//孔。用封板胶纸封住反应孔, ?孵箱孵育分钟。 、洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板每孔内加入/洗涤液, 并去除水滴在厚叠吸水纸上拍干;反复洗涤次。 、每孔加入埘显色液, 轻轻混匀秒,避孵箱孵育.分钟 处读.值 、每孔加/终止液。轻轻混匀秒;分钟内在 加、以.值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据血清样 品的.值可在标准曲线上查出其浓度。 .肝组织羟脯氨酸含量测定 ..试剂配制 、标准储存液/:称取标准品,用./盐 酸溶解并定容至 ,置棕色瓶子保存。 , 、标准应用液/:取标准储存液 /. 双蒸水定容至 ,?保存,可用周。 、. .:. /柠檬酸缓冲液 柠檬酸和. 柠檬酸钠加双蒸水溶 。 解并定容至 、. /.氯胺一溶液:.氯胺一用少量甲醇溶解并定容至。 、%对二氨基苯甲醛: 用少量甲醇溶解并定容至 。 、. 。 /.高氯酸溶液:%高氯酸加双蒸水至 。 、%溶液: 双蒸水溶解并定容至 ..标准曲线的制备 去离子水作为空白对照,然后掣标准羟脯氨酸溶液/ 安徽医科大学博士学位论文 做倍比稀释,浓度依次为/、.咖、./、../、.//、 .和. /氯胺一 .肛咖。依次加入. /的柠檬酸缓冲液 。. 溶液,?水浴氧化 /高氯酸溶液 ,混匀,室温作 用 终止氧化。%的对二甲氨基苯甲醛溶液 ,混匀,沸水 显色。冰浴冷却,各管取/分别加入酶标板,空白调零,酶标 仪测定。以每管剂量为横坐标,以个复管平均值为纵坐标,绘制标 准曲线。 ..肝组织羟脯氨酸的测定 微量天平称取肝组织,匀浆器匀浆。加入/盐酸, 混匀,移入 的试管,?高压水解。%的调值到., .取 上清加入一新准备的 试管中,依次 离心 。 加入. /的柠檬酸缓冲液和./氯胺一溶液,?水浴氧化 . /高氯酸溶液 ,混匀,室温作用终止氧化。%的 显色。冰浴冷却, 对二甲氨基苯甲醛溶液 ,混匀,?沸水 各管取分别加入酶标板,空白调零,和准备的标准品一起测定。 .大鼠型胶原、免疫组织化学检测 肝组织以%的甲醛固定,石蜡包埋,/连续切片,采用 免疫组化法,具体实验步骤如下: 、石蜡切片常规脱蜡人水。 。 、洗三次,每次 。 、.%封闭 。 、洗次,每次 、加正常山羊血清封闭液,室温。 。 、洗次,每次 、依次加人第一抗体/羊抗大鼠兔抗大鼠型胶原,.抗体,过夜。 、洗次,每次 。 。 、加人生物素化标记的二抗 室温安徽医科大学博士学位论文 、洗次,每次 。 、加人辣根酶标记链亲合素,室温。 、显色: 蒸馏水:显色剂 ,各滴,观察显色程度,约显 色丑。 、自来水流水冲洗,苏木素复染。 、梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片。 所有免疫组化反应均设明性对照组,方法为用正常山羊血清替代一伉,其余 步骤同上。 。采用美国公司真彩色图象 系统分析系统,配套分析软件 为美国公司的锄软件。对各组免疫组化切片进行定性、半定量分 析:在倍物镜下,按照黄色阙值分割阳性细胞,阳性细胞被染成棕黄色颗粒。 选 择各切片阳性细胞,测定各组大鼠肝组织中型胶原,.表达的平均灰度值。 . 法定量测定型胶原 用. ,接 ,痨酶消化细胞,制成浓度为/细胞悬液,每孔. 种于孔培养板中培养。生长至%以上融合度时用于实验,按上述分组处理后, 收集上述细胞上清,按说明书操作。培养上清液用稀释倍,加稀释后样品 工作浓度 口,加兔抗大鼠型胶原抗血清工作浓度:,羊抗兔 :,四甲基联苯胺显色, ./终止反应。阴性对照以新鲜无血清 培养液代替培养上清。 酶标仪波长姗测定吸光度值,以此代表蛋白相 对含量。 . 硒鹤活性分析 , ..准备工作 、裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 、检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 ..测定标准曲线 、标准品稀释液的配制:按照每. 检测缓冲液加入. 裂解液的比例 配制适量的标准品稀释液。安徽医科大学博士学位论文 用标准品稀释液稀释为、、,、 、把试剂盒提供的 和/,作为标准品。 、每个浓度取弘用酶标仪进行检测,或取适当量用容量不超过?也 的分光光度检测杯进行检测,测定。 、每一个标准品的减去不含的空白对照的计算出实际的因 而导致的吸光度,并制作出浓度相当于的标准曲线。 ..操作步骤’ 、收集各处理组细胞,同时设立空白对照组。 、用洗涤细胞二次离心 ,并调整细胞浓度为。 , 加入. 、用/冰冷 悬浮细胞使用前每/ 。 、置冰上。 。 ,?离心 、把离心上清转移至新的管中,并放置冰上。 、用法检测待测样品中的蛋白浓度由于裂解液中含有较高浓度的 ,不适合采用法进行蛋白浓度测定。 、吸取/含/蛋白的细胞裂解上清;如体积不足/用 补足至总体积肚。 使用前每 加入 、加入‖的 ./。 。 、加入? 并于避光孵育 一 如下设置反应体系:安徽医科大学博士学位论文 、用酶标仪测定波长 的吸光度值佾晒。,以此表示.的相 对活性。通过标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的。 . 蛋白浓度测定 、完全溶解蛋白标准品,取稀释至/,使终浓度为. /。 、将标准品按,,,,,,,微升分别加到孔板中,加标准品稀释 液补足到微升。 、加适当体积样品到孔板的样品孔中,加标准品稀释液到微升。 、各孔加入肚染色液,室温放置分钟。 、用酶标仪测定,或 之间的其它波长的吸光度。 、根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 .流式细胞仪检测细胞周期碘化丙啶染色法 、取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打, ,离心去上清。 ,、洗次,加.吹匀,务必吹散。 、用 注射器将细胞吸起,用力打入 %预冷乙醇中,封口膜 ’ 封口。?固定过夜。 、 收集固定细胞,洗次。 、用. 重悬细胞并转至中轻轻吹打防止细胞破碎。 。 、加约“至终浓度约为/./,。水浴消化 。 、加约/至终浓度约为/,在冰浴中避光染色 用目孔径微米尼龙网过滤,上机进行细胞周期检测。 公司对细胞进行分析。 、应用软件美国 . 总提取法 离心 、将孔培养板的细胞用.%胰蛋白酶消化后完全取出,移入. ,混匀,冰上静置 管,加试剂. 。样品总体积不能超过所用 体积的%。 、以每 液加入. 的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡安徽医科大学 博士学位论文 离心管秒。 液加. 异丙醇的比例加入异 、取上层水相于一新的离心管,按每 丙醇,室温放置分钟, ?分钟。 、弃去上清液,按每 液加入至少 的比例加入%乙醇,涡旋混匀, 下 离心分钟。 、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥.钟。沉淀重悬于无的水 中,.?保存备用。 、临用前测定的含量。取?溶液溶于 的水中,混匀, 测定拗和瑚值,含量/./。 .扩增的操作步骤 、按下列组份配制反应液反应液配制请在冰上进行。安徽医科大学博士学位 论文 、进行反应。 、反转录反应 反应 、实验结果分析。 反应结束后确认 的扩增曲线和融解曲线,进行定量时制 作标准曲线等。 . 印迹法 ..用液的配制 / ,% 、单去污剂裂解液 / ., : ,/ . . /? . . . 蒸馏水至 裂解液加 混匀后,保存。使用时,加入至终浓度为//. 入. 埘。 / 、. .?.: / . /.蒸馏水至安擞医科大学博士学位论文 溶解后,一?保存。制作蛋白标准曲线时,用. /进行倍稀释 成 /,一?保存。 、分离胶和浓缩胶的配制以%,%为例: 加后,立即混匀即可灌胶。 ? 、还原型 上样缓冲液. / .,. /二硫 叔糖醇,%,.%溴酚蓝,%甘油:安徽医科大学博士学位论文 . . . /? 混匀后,分装于.离心管中,保存。 、电泳液缓冲液 /,. /甘氨酸,.%: . . . 甘氨酸 .蒸馏水至 溶解后室温保存,次溶液可重复使用次。 、转移缓冲液/, /甘氨酸,.%,%醇: 甘氨酸. . 碱 . . . 甲醇 蒸馏水至 溶解后室温保存,次溶液可重复使用.次。 、丽春红染液: 丽春红 三氯乙酸 磺基水杨酸 蒸馏水至 使用时将其稀释倍。安徽医科大学博士学位论文 、缓冲液/? .,/: ./? . 蒸馏水至 、缓冲液含.%的缓冲液: 旦堑里呈 :箜型 :混匀后即可使用,现用现配。 、封闭液含%脱脂奶粉的缓冲液: 脱脂奶粉 溶解后保存。使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。 / / 、洗脱抗体缓冲液 ,%,. ? .: 配制时,在通风厨内进行。保存。可重复使用次。 、显影液: 自来水加热至? 米吐尔 . 亚硫酸钠无水 . 碳酸钠无水 . 溴化钾 . 补水至 安徽医科大学博士学位论文 配制时,上述药品应逐一加入,待一种试剂溶解后,再加入后一种试剂。保存。 使用时用自来水稀释至倍。 、定影液: 自来水~? 硫代硫酸钠 亚硫酸钠无水 . 冰乙酸 , . 硼酸 钾明矾。 水温冷至以下时再加入 加水定容至 ,室温保存药品按顺序加入前者溶解后再加后者。 、抗体: 。 用稀释至一定浓度使用,每张膜需. ..蛋白样品制备 ... 细胞总蛋白的提取 、倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。 、每瓶细胞加 ’预冷的. .~.,洗涤三次。 、按裂解液加讲,摇匀置于冰上。 。 、每瓶细胞加含的裂解液,于冰上裂解 离心管中。 、裂解完后,用枪将细胞碎片和裂解液移至. 、子下 离心, . 、将离心后的上清分装转移倒. 的离心管中放于.?保存。 ...肝组织中总蛋白的提取 、将少量肝组织块置于. 匀浆器中球状部位,用干挣的剪刀将组织块尽 量剪碎。 ,加皿单去污剂裂解液裂含于匀浆器中,进行匀浆。然后置 于冰上。 、裂解后,即可用移液器将裂解液移至.离心管中,然后在 安徽医科大学博士学位论文 下 ,取上清分装于. 离心管中并置于保存。 离心 一 ...加药物或抑制剂处理的细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以还应再额外收集培养液中 的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取: 、将培养液倒至离心管中,于 离心。 。 ,弃上清,加入 并用枪轻轻吹打洗涤,然后 离心 弃上清后用重复洗涤一次。 。 ,用枪洗干上清后,加裂解液含冰上裂解 ,取上清 ,将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起?、 离心 分装于. 离心管中并置于一?保存。 ..蛋白含量的测定 ...制作标准曲线 ,从.取出 ,室温融化后,备用。 / 、取个. 离心管,个一组,分别标记为、.、.、. 、.、.? ,按下表在各管中加入各种试剂: ,混匀后,室温放置。在生物分光光度计上比色分析。 ...检测样品蛋白含量 、取足量的. 离心管,每管加入储存的考马斯亮蓝溶液。室温 放置后即可用于测蛋白。 、取一管考马斯亮蓝加. /溶液,混匀放置分钟做为空 白样品。 、弃空白样品,用无水乙醇清洗比色杯次每次. ,再用无菌水洗一 安徽医科大学博士学位论文 次。一 、取一管考马斯亮蓝加‖ ./溶液和肛待测蛋白样品,混 匀后静置 ;测定样品。 以牛血清蛋白标准品绘制标准曲线,由标准曲线读取蛋白浓度。 .. .电泳 ...清洗玻璃板 ...灌胶与上样 、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 、用 枪吸取 胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可, 然后胶上加一层水。 、等胶凝固后,倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 、将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中;待到浓缩胶凝固后,两 手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 、用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。 、测完蛋白含量后,计算含岸蛋白的溶液体积即为上样量;上样前要将 . 样品于沸水中煮 便蛋白变性。 、加足够的电泳液后开始准备上样,电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。 ...电泳 电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。 。。转膜 、准备张滤纸和张硝酸纤维素膜。 、将硝酸纤维素膜浸入%甲醛秒钟,浸入去离子水分钟,再浸入电 转液分钟。 、安装转膜装置。 。 、转移或转移 、转完后将膜用×丽春红染液染 于脱色摇床上摇。然后用水冲洗掉 没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。安徽医科大学博士学位 论文 ..抗原抗体反应 、将膜用浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封 闭。 、将一抗用稀释至适当浓度,将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中 后,用在室温 取出膜,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,室温下孵育. 。 下脱色摇床上洗两次,每次 ;再用洗一次, 后,用在 、同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育. 室温下脱色摇床上洗两次,每次 ;再用洗一次, ,进行化学发 光反应。 ..化学发光、显影、定影 、将和两种试剂在保鲜膜上等体积混合;后,将膜蛋白面朝下与 此混合液充分接触;后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入. 光片夹中。 、在暗室中,打开光片夹,把.光片放在膜上,关上光片夹,根据信 号的强弱计时适当调整曝光时间。 、在暗室中,曝光完成后,打开.光片夹,取出.光片,迅速浸入显影液 中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影;显影结束后,马上把光片浸入定 影液中定影,以胶片透明为止。 、用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。 。.凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密 度值。 .非放射性凝胶迁移试验 ..准备抽提试剂,按照下列方法制备胞浆一核蛋白抽提液安徽医科大学博士 学位论文 、制备 胞浆蛋白裂解液: 试剂 体积 . “ 溶液 越 溶液“ 总体积 . 注: 须在抽提试剂加入到样品中前分钟内加入. 、制各. 胞浆蛋白裂解液: 试剂 体积 ?溶液 . 胞浆蛋白裂解液 . 总体积 、制备 核裂解液: 试剂体积 “ .“ 溶液 溶液 .“ .口 .“儿 总体积 注: 须在抽提试剂加入到样品中前.分钟内加入。 ..细胞核蛋白抽提步骤 、将 规格的细胞培养物细胞生长面积约 置于冰盒上低温操 作。 、弃培养瓶中上清培养液,加 冷 于细胞培养瓶中漂洗细胞两次。 安徽医科大学博士学位论文 、取. 胞浆蛋白裂解液漂洗细胞一次,弃漂洗后的缓冲液。 、取. 胞浆蛋白裂解液?于培养瓶中溶解细胞,可用. 移液枪贴壁 吹打细胞多次,可以在显微镜下观察细胞的裂解情况。 ,尽量吸干净培养瓶中的裂解液,转入.离心管中,?, 离 心。 、用移液器分开上清和沉淀,上清液即为胞浆蛋白液,请于一?保存。 、取. ,弃 胞浆蛋白裂解液漂洗沉淀一次,,离心 上清。 ,取核裂解液重悬沉淀,,静置离心管咄并不是剧烈震动重悬 沉淀。同时调离。 、, . 离心 、取上清液即核抽提物与一?保存。 .. ~蛋白质结合反应 对每个核抽提物样品,按以下步骤于. 离心管中操作。 ...结合反应体系 结合反应液 . .. :: 细胞核提取物 . 双蒸水 / 混匀室温静置分钟 生物素标记的探针 . 总量 / 混匀室温静置分钟或以上。安徽医科大学博士学位论文 ...特异性反应确认竞争反应体系 结合反应液 . :: . 细胞核提取物 .“ 未标记的竞争性寡核 . 双蒸水 ./ 混匀室温静置分钟 生物素标记的探针 “ 总量 “ 混匀室温静置分钟或以上。 ...聚丙稀酰胺凝胶电泳 、制备.%聚丙烯酰胺凝胶。在试管中混合以下组分: . . %%聚丙烯酰胺 . %%甘油 蒸馏水 . 四甲基乙二氨 脱气 %过硫酸氨 总量. 、制备预冷的. ,保存: 双蒸馏水 总量 、预电泳:用预冷的. 在冰二 预电泳小时。并在上样前用电 泳缓冲液冲洗加样孔.次,孔。 。 、制备上样混合液: