免疫性血小板减少症儿童FV10基因变异检测及分析

山东医药2012年第 52卷第 11期 免疫性血小板减少症儿童 FV10基因 变异 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 及 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 崔海荣 ，罗建明 ，欧丹艳 ，梁群友 ，：豪 媛 (1广西医科大学研究生学院，南宁5130021；2广西医科大学第一附属医院) 摘要：目的 探讨儿童免疫性血小板减少症(ITP)与 FV基因第 10外显子(FVIO)基因变异的相关性。方法 对 51例 ITP儿童(ITP组)和28例非 ITP儿童(对照组)的 FVIO进行 PCR扩增、凝胶电泳、基 因测序 ，比较两组数 据差异。结果 成功扩增 FV10基因；与数据库 FV基因及氨基酸序列对比结果显示 ，ITP组和对照组均存在氨基 酸 R513K变异(94．1％、100％ ，P=0．191)，杂合子率为 87．5％、78．6％(P=0．303)；两组氨基酸均存在 Q534R变 异，且变异率均为100％；未发现FV氨基酸506位的FV Leiden突变(核苷酸G1691A变异＼氨基酸A506G变异)。 结论 FV10基因变异与儿童 ITP无明显相关性；FV氨基酸 Q534R变异可能为广西壮族 自治区人群特有变异，文 献所描述的FV Leiden突变氨基酸位置可能有误。 关键词 ：免疫性血小板减少症；凝血因子 V第 10外显子；凝血因子；凝血因子 V基因Leiden突变 中图分类号：R558．2 文献标志码：B 文章编号 ：1002—266X(2012)11-0057-03 免疫性血小板减少症 (Immune thromboeytope— nia，ITP)是 自身免疫紊乱、抗血小板抗体增多、凝血 因子缺乏及血小板破坏增多、生成减少或功能缺陷 导致的血小板减少性疾病 ¨J，因其发病机制未完 全明了，极易致误诊、误治 J。目前关于 ITP发病机 制的研究颇多 “¨ ，基因水平上 ITP的研究逐渐成 为热点 ， 。国内外有关凝血因子 V(FV)基因变异 致血栓形成相关疾病的研究非常多，但与 ITP关系 的研究却鲜有报道l8 。FV由FV基因指导合成， 是一种极活跃的促凝血球蛋白原，可：通过激活凝血 酶、直接调控 VⅢ因子、与激活的蛋白C(APC)协同 调控血凝块的大小及数量而影响血小板聚集 j。 FV第 10外显子(FV10)的 FV Leiden突变(点突 变)，可导致506位精氨酸被谷氨酰胺纯合或杂合 表达，进而增加血栓风险；与脑血管意外、高血压、深 静脉血栓、肺栓塞、肾衰竭、镰刀形红细胞增多症、自 然流产、子痫、宫内发育受限等均有相关性 。 2011年4—12月，我们对 5例 ITP儿童 FV10基因 变异情况进行了检测，旨在进一步探讨其发病机制。 1 资料与方法 1．1 临床资料 同期收治的 51例 ITP患儿 (ITP 组)，年龄6个月 ～9岁。均符合《血液病诊断和疗 效 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 》(张之南、沈悌主编，北京科学出版社，2008 年，第 3版)制定的诊断标准，外周血血小板计数 (PLT)均 <100×10 ／L。另选择 28例非 ITP儿童 通讯作者：罗建明 为对照组，年龄 6个月 一15岁，PLT均 >100×10 ／ L。两组一般资料具有可比性。 1．2 FVIO基因变异检测 1．2．1 样本收集与 DNA提取 抽取两组空腹静脉 血0．5 mL，枸橼酸钠抗凝，采用 OMEGA公司的血液 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。在 NR2000仪 上测量产物浓度及纯度，质量浓度 100—800 ng／ L，纯度 70％ 一95％。储存于 DNA收集管，置于 一 20 cC冰箱备用。 1．2．2 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物 PCR扩增片段包含 FV Leiden突变点，其上游引物为 5 ．CCq3TFGCAATAT— TAATYGGTFCC-3 ，下游引物 为 5 一GACAATI'ACT— GTrCTCTrGAAGGAAAT--3，测序结果显示产物为 430 bp。 1．2．3 基因扩增 采用 PCR对 FV10进行扩增。 反应体系为 50 L，视提取的 DNA及引物不同，加 样量稍有不同；1～2 L模板 DNA，25 IxL预混 2× TaqMIX，1—2 L引物，余以ddH O补足反应体系 到50 txL。PCR反应在多通道 PCR仪(型号)上进 行，反应条件：95 c【=预变性 3 rain，95 oC变性40 S，59 ℃退火 40 s，延伸 1 min，进行 40个循环，终延伸 10 min；产物置于4℃保存。 1．2．4 凝胶电泳 为确定 PCR产物是否为目的扩 增基因片段，对每次 PCR产物行凝胶电泳，以 DNA Marker作为片段大小的参照物，待 DNA Marker在 凝胶上完全分离成大小不同的条带后，在紫外凝胶 成像系统上对凝胶进行成像，剔除因加样偶然误差 57 产生的非 目的条带及产生了目的片段以外杂带的 PCR产物。选择符合要求的PCR产物送生物公司 进行基因测序，对不符合引物 目的条带条件的样本 重新行 PCR，直至获得电泳结果符合条件后再行测 序。 1．2．5 基因测序 将经凝胶电泳检测后所有符合 条件的样本在 1～3 d寄送上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术 服务有限公司进行基因测序。将测序结果与 Gen． Bank中的基因组核苷酸碱基数据进行 Blast比对， FV基因全序列变异位点在(http：／／www．ncbi．nlm． nih．gov／snp／)查询，将测序所得核苷酸序列对应 的氨基酸序列与数据库比对；FV氨基酸序列参照 (http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／CCDS／CcdsBrowse． cgi?REQUEST=CCDS&GO=MainBrowse&DATA= CCDS1281．1)上公布序列。 1．3 统计学方法 采用 SPSS13．0软件进行统计学 处理。组间数据 比较进行 检验 ，检验水准 o【= 0．05。 2 结果 2．1 凝胶电泳结果 PCR产物与目的扩增基因片 段相符，见图 1。 图 1 FV10基 因扩增产物凝胶 电泳 2．2 基因测序片段 FV10核苷酸 G1683A变异， 导致氨基酸 R513K杂合变异或者纯合子变异，见图 2a；FV10核苷酸 GI776A变异(纯合子)，导致氨基 酸 Q534R变异，见图2b；文献描述的FV leiden突变 (测序结果亦该位点核苷酸及氨基酸皆与文献描述 不相符，但与 GenBank数据库正常序列一致)在第 2 个 Y(酪氨酸 rryr)位置即FV氨基酸第 506位，见图 2c。 2．3 FV氨基酸变异率及 R5315k杂合情况 两组 FV氨基酸变异率见图3，FV氨基酸 R5315k杂合情 况见 图4。 3 讨论 58 220 230 A T C A T G A A A G A C A T C G I M K D I A 图 2a FVIO核苷酸 G1683A变异 山东医药 2012年第52卷第 11期 280 290 C T G G A C A G G C G A G G A A 图2b FV10核苷酸 G1776A变异(纯合子) 墓 篓 磊 譬 50 40 30 = 2O l0 O 图 2c FV leiden突变 RS13K Q534R Y506Y 变异位点 图3 FV氨基酸变异率 组 对照组 TIP组 对 J强组 图4 FV氨基酸 R513K杂合情况 随着医学界对血小板减少性紫癜认识的不断深 入，ITP的概念有了新的定义，“特发性血小板减少 性紫癜”渐被放弃，而“免疫性血小板减少症”的定 义逐渐得到学术界认同 -4]。研究显示，ITP是 自 身抗体、免疫失调等多种因素介导的血小板减少性 疾病，但更深层次的发病原理仍不清楚。临床对 ITP的诊断方法仍然是排除性诊断，其发病机制至 今仍不十分明确 。笔者在临床实践中发现，输注 血小板无效(输注血小板后 P 无升高)的 ITP患 儿，使用抗血小板聚集药物(如双嘧达莫等)后约 60％病例 PLT明显升高。此现象提示 ITP患儿血液 AS ^¨， A ^¨， 一 瑚 CP =^== ∞ 舳 ∞ ∞ 加 0 山东医药 2012年第 52卷第 11期 中存在血小板异常聚集情况。Fv与血小板凝聚关 系密切。FV因子在血管受损凝血过程启动后被激 活，激活态的FV可与凝血因子 x结合成复合物，进 一 步转化凝血酶原为凝血酶，凝血酶可促使血小板 活化并释放内源性性 ADP及血栓素 A2(TXA2)，促 使血小板不可逆性聚集在血管损伤处，最终形成血 小板止血栓，阻塞伤口而止血；FV能将纤维蛋白原 转化为纤维蛋白，后者可形成血凝块而止血；FV可 被APC经由FV506位精氨酸(FVIO编码)处断裂 而灭活，从而避免循环血中血凝块过多、过大，APC 能与灭活的 FV因子协同作用于钝化因子 VII1a，抑 制凝血。FV发生 Leiden突变时，其被 APC灭活的 速率下降，导致血液高凝态、血凝块增多、甚至血栓 发生 。本研究对 FVIO进行了基因检测。结果 显示，观察组和对照组均存在 FV10变异，FV10核 苷酸 G1683A变异导致 氨基 酸 R513K杂 合变异 (94．1％、100．0％，P=0．191)，杂合子率为(87．5％、 78．5％，P=0．303)，两组杂合变异以及杂合子率均无 统计学意义；FV10核苷酸 G1766A变异(纯合子)导 致氨基酸 QS34R变异，两组变异率均为 100．0％。提 示人群中FV氨基酸 R513K的杂合变异率均高；本实 验样本来 自中国广西地区，具有地域人群特性， Q534R变异可能为广西壮族地区人种特有变异。 此外，本研究 FVIO测序结果 中，未见文献描述的 1691位核苷酸碱基 G被 A替代(G1691A)，亦无氨 基酸506位精氨酸为谷氨酰胺替代表现，未见 V因 子上著名的 FV Leiden突变_9 ；氨基酸 506位不 是精氨酸而是酪氨酸，与 NCBI数据库氨基酸序列 相符。Morteza等H 对 Leiden突变与妊娠关系进行 的研究发现，实验组和对照组均未见任何 G1691A 变异，与本实验结果类似。参照文献用内切酶 Mnl I酶切识别序列5 ⋯ CCTC(N)7 ⋯ 3 的比对测序 结果显示，氨基酸516位置的核苷酸为 CCTC。 FV基因有 25个外显子 。本次测序核苷酸数 据源 自其中编码 FV氨基酸最多、包含 目前研究极 广的 FV Leiden突变位点的 FV10，FVIO基因测序 结果显示其与 ITP发病无相关性，两组间差异亦无 统计学意义；因时间及科研经费原因，本实验未对 FV 10 mRNA的转录水平及转录后翻泽情况与 ITP 发病的关系进行研究，加之FV其余24个外显子的 变异也可能会导致血小板聚集异常，因此尚不能确 定 FV遗传变异与ITP的发病有无相关性。鉴于FV 与 APC的协同关系，APC基因缺陷与 ITP的关系亦 值得深入研究。FV基因位于一号染色体23区段 (1q23)，此基因区域是一些免疫相关基 因所在区 域，此区变异与 SLE等免疫疾病相关，而 SLE患者 亦存在 PLT减少 ；FV基因与该区段其他基因是 否有关系尚待深入研究。 总之，FVIO基因变异与儿童 ITP无明显相关 性；FV氨基酸 QS34R变异可能为广西壮族地区人 群特有变异，文献所描述的 FV Leiden突变氨基酸 位置可能有误。 参考文献： [1]Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer 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