三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证（可编辑）

三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证（可编辑） 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证 汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证摘要 三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum ) 已完成基因组测序, 具备成熟的遗传转化技 术, 是 海洋硅藻的模式种 。 由于 其生长快、 油脂含量高 (占细胞干重的 20%~50% ) , 具备 大规模培养的技术基础, 已成为微藻生物柴油研究的理想材料。 本文对其 三酰基甘油 (TAG ) 合成的关键基因 进行了克隆, 并在相应酵母缺陷型菌株中开展了功能验证, 进一步构建了 硅藻表达载体,完成了基因枪转化,取得进展如下: 1. 通过 RT-PCR 方 法 从 三 角 褐 指 藻 总 cDNA 中 克 隆 得 到 磷 酸 甘 油 酰 基 转 移 酶 1 (PtGPAT1 ) 基因的完整 cDNA 序列, 通过与 基因组序列比较分析, 发现该基因序列全长 1947 bp , 编码 648 个氨基酸, 基因组全序列共有 5 个外显子和 4 个内含子, 利用信息学方 法分析共有 6 个跨膜结构,分析该 GPAT 定位于内质网。 2. 针对 PtGPAT1 与 实验室之前克隆的二酰甘油酰基转移酶 2 基因 (PtDGAT2 ) , 构建 了酵母表达载体 pYGPAT1 与 pYDGAT2,导 入后 分别在 2 株 GPAT (Y13037 、Y15983 ) 和 1 株 DGAT (H1246 )缺陷型酵母菌株中进行 相关基因的功能验证。尼罗红染色观察显 示, PtGPAT1 在 2 种酵母 缺陷型转化子中的相对荧光值 均显著高于转化空白载体的 对照组, 证明 PtGPAT1 重组表达蛋白具备 磷酸甘油酰基转移酶 活性。 而 PtDGAT2 不能使 DGAT 缺 陷性酿酒酵母 H1246 回复突变 ,提示不具备二酰甘油酰基转移酶功能。 3. 针对 PtDGAT2 与 实 验 室 之 前 在 酵 母 中 已 验 证 功 能 的 二 酰 甘 油 酰 基 转 移 酶 4 (PtDGAT4 ) , 构建了硅 藻表达载体 pfcpA-DGAT2/pfcpB-Bar 和 pfcpA-DGAT4/pfcpB-Bar , 并完成了基因枪转化,后续抗性藻株的筛选与检测实验正在进行中。 本文首次对三角褐指藻的 GPAT 基因完成功能验证,相对荧光值半定量结果显示, PtGPAT1 可以显著提高酵母缺陷型菌株中的 TAG 含量, 提示 PtGPAT1 可以作为三角褐指 藻油脂代谢基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 的重要靶基因。 构建了 PtDGAT2 与 PtDGAT4 的硅藻转化载体, 为 进 一步基因功能验证和 硅藻 油脂代谢基因工程奠定了必要基础。 关键词 :三角褐指藻; 磷酸甘油酰基转移酶 1;二酰甘油酰基转移酶 2 ;三 酰基甘油 I汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证Abstract As a model of marine diatom research, Phaeodactylum tricornutum has been completed genome sequence, which has established successful genetic transformation system. Because of its high growth rate, rich lipid content 20%~50% of dry weight and large-scale culture technology foundation, it has been a perfect feedstock for microalgae biodiesel research. This thesis bases on cloning important enzymes in triacylglycerol TAG biosynthesis and their function-identified in defective-yeast strains, respectively. Then after construction of diatom expression vectors, gene gun transformation has been done. The main investigation results in this project are as follows:1. By using the method of RT-PCR, the whole cDNA sequence of glycerol-phosphate acyltransferase 1 PtGPAT1 gene has been cloned from total cDNA. After aligning with genome sequence, it shows PtGPAT1 sequence contains1947 bp and codes 648 amino acids. The total sequence of the PtGPAT1 in genome contains 5 exons and 4 introns. Through bioinformatics analysis, there are 6 transmembrane domains in the putative protein, which is supposed to locate at endoplasmic reticulum2. Both of PtGPAT1 and former cloned diacylgycerol acyltransferase 2 PtDGAT2 have been constructed as yeast expression vectors, pYGPAT1 and pYDGAT2. Then these two vectors were transformed into 2 GPAT-defective Y13037 、Y15983 and 1 DGAT-defective H1246 yeast strains for identifying functions. After dyeing by Nile Red, the relative fluorescence value of both pYGPAT1-transformedY13037 and Y15983 are significant higher than control. It shows PtGPAT1-expression protein has the fuction of glycerol-phosphate acyltransferase. However, pYDGAT2-transformed H1246 can not reverse mutation which means PtDGAT2 has non function of diacylgycerol acyltransferase3. Both of PtDGAT2 and diacylgycerol acyltransferase 4 PtDGAT4, which has been indentified the DGAT fuction have been constructed as diatom expression vectors, pfcpA-DGAT2/pfcpB-Bar 和 pfcpA-DGAT4/pfcpB-Bar, and finished gene gun transformationThe follow step for selection resisitant algae strains and tests are keeping onII汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的 功能验证This thesis identifies the fuction of P. tricornutum GPAT gene for the first time. The relative fluorescence value semi-quantitative results show PtGPAT1 is able to increase the TAG content in GPAT-defective yeast strains, which presents PtGPAT1 can be developed as an important target gene in P. tricornutum lipid metabolism genetic engineering. The successful construction of diatom expression vectors lays the foundation of lipid metabolism genetic engineering Keyword: Phaeodactylum tricornutum; Glycerol-phosphate acyltransferase 1; Diacylgycerol acyltransferase 2; Triacylglycerol III汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证目录 摘要I Abstract. II 附录 1 VI 附录 2VII 第一章 绪论. 1 1.1 微藻柴油研究概况2 1.2 植物细胞 TAG 的合成 途径 2 1.2.1 ACCase 的研究进展4 1.2.2 FAS 酶系的研究进展5 1.2.3 TAG 组装酶的研究进 展. 6 1.2.4 其它相关途径的研究进展. 8 1.3 三角褐指藻的生物学概述8 1.4 本论文研究内容和意义. 10 第二章 三角褐指藻磷酸甘油酰基转移酶 1(PtGPAT1 )基因的克隆与分析 11 2.1 三角褐指藻的培养与分子鉴定. 11 2.1.1 材料与方法11 2.1.2 结果与分析13 2.1.3 讨论17 2.2 三角褐指藻 PtGPAT1 基因完整 cDNA 序列的 克隆与分析 18 2.2.1 材料与方法18 2.2.2 结果与分析23 2.2.3 讨论27 2.3 小结 28 第三章 三角褐指藻 PtGPAT1 、PtDGAT2 基因酵母表达载体的构建与功能验 证29 3.1 三角褐指藻 PtGPAT1 、PtDGAT2 基因酵母表达载体 pYGPAT1 和 pYDGAT2 的构建 29 IV汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证3.1.1 材料 与方法29 3.1.2 结果与分析33 3.2 PtGPAT1 和 PtDGAT2 基因在酿酒酵母中的功能验证. 37 3.2.1 材料与方法37 3.2.2 结果与分析42 3.2.1 讨论48 3.3 小结 50 第四章 三角褐指藻表达载体的建构与遗传转化51 4.1 三角褐指藻表达载体的构建51 4.1.1 材料与方法51 4.1.2 结果与分析54 4.2 三角褐指藻的遗传转化. 56 4.2.1 材料与方法56 4.2.2 结果与分析59 4.2.1 讨论59 4.3 小结 60 第五章 总结61 参考文献. 62 致谢69 V汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证附录 1 仪器 型号 厂家 智能光 照培 养箱 宁波江 南仪 器厂 光学显 微镜 BH-2 Olympus 分光光 度计 WFJ 7200 型 尤尼柯 (上 海) 仪器 有限 公司 超净工 作台 AIR TECH 苏净集 团安 泰公 司 琼脂糖 凝胶 电泳 装置 PAC300 Bio-Rad 凝胶成 像系 统 ImageMaster VDS Pharmacia 磁力搅 拌器 78HW-1 杭州仪 表电 机厂 台式常 温离 心机 SIGMA1-14 Sigma 冷冻离 心机 SIGMA-3K15 Sigma PCR 仪 T-Gradient Biometra 酶连仪 BG25 杭州朗 基科 学仪 器有 限公 司 空气浴 振荡 器 HZQ-C 哈尔滨 市东 明医 疗仪 器厂 恒温水 浴锅 购 长风集 团 电子天 枰 BP610 Sartorius 超声破 碎仪 JY92-11 宁波邱 隘金 达超 声波 仪器 厂 冷冻离 心机 FD-1 北京博 医康 实验 仪器 有限 公司 荧光显 微镜 HBO-50 Zeiss 公司 荧光分 光光 度计 f-4500 HITACHI 基因枪 PDS-1000/He Bio-Rad VI汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证附录 2 英文缩写 英文全称 中文名称 ACCase Acetyl-CoA carboxylase 乙酰-CoA 酰 基羧 化酶 ACL ATP:citrate lyase ATP: 柠檬 酸裂 解酶 ACP Acyl-carrier protein 酰基转 移蛋 白 ACS Acetyl-CoA 乙酰-CoA 合 成酶 CoA Coenzyme A 辅酶 A DAG Diacylglycerol 二酰基 甘油 DGAT Diacylgycerol acyltransferase 二酰甘 油酰 基转 移酶 DHAP Dihydroxyacetone phosphate 磷酸二 羟基 丙酮 ENR Enoyl-ACP reductase 烯酰 ACP 还 原酶 ER Endoplasmic reticulum 内质网 FAT Fatty acyl-ACP thioesterase 酯酰 ACP 硫 酯酶 G3P Glycerol-3-phosphae 三磷酸 甘油 G3PDH Gycerol-3-phosphate dehydrogenase 3- 磷酸甘油 脱氢 酶 GPAT Glycerol-phosphate acyltransferase 磷酸甘 油酰 基转 移酶 HD 3-hydroxyacyl-ACP dehydratase 3- 羟酰 ACP 脱氢 酶 KAR 3-ketoacyl-ACP reductase 3- 酮酯酰 ACP 还 原酶 KAS 3-ketoacyl-ACP synthase 3- 酮酯酰 ACP 合 成酶 LPA Lysophosphatidate 溶血磷 脂 LPAT Lysophosphatidate acyltransferase 溶血磷 脂酰 基转 移酶 MAT Malonyl-CoA:ACP transacylase 丙酰-CoA:ACP 转酰 基酶 ME Malic enzyme 苹果酸 脱氢 酶 PAP Lyso-phosphatidylcholine acyltransferase 溶血磷 脂胆 碱酰 基转 移酶 PDH Pyruvate dehydrogenase complex 磷酸烯 醇式 丙酮 酸脱 氢酶 复合体 PEPC Phosphoenolpyruvate carboxylase 磷酸烯 醇式 丙酮 酸羧 化酶 TAG Triacylglycerol 三酰基 甘油 VII汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证第一章 绪论 藻 类 结 构 简 单 , 具 有 叶 绿 体 、 能 够 进 行 光 合 作 用 , 无 根 茎 叶 的 分 化 , 是 一 群 最 古 老 、 最原始的低能植物。 藻类物种繁多, 适应环境的能力强, 因此分布的地域极其广泛, 但主 要分布在淡水、 半咸水和海水等水环境中, 甚至在南北两极和温泉中等极端环境中也可能 找 到 它 们 的 足 迹 。 藻 类 的 形 态 各 异 , 从 几 微 米 至 数 十 米 不 等 , 多 为 单 细 胞 、 多 细 胞 群 体、 丝状体、 叶状体和枝状体等; 藻体细胞都含有光合色素, 都具有光合作用产生有机物的能 力, 不同门类的藻类的具有不同的色素组成, 分布于在不同光强和光质的水层当中。 藻类 以其简单的个体形态和构造和细胞壁的成分, 载色体的 结构和所含色素的 种类, 贮藏营养 物质的类别, 繁衍后代 的方式、 能力, 鞭毛的 有无及其数目, 生殖方 式和生活类型等, 中 国藻类学者们将其分为 12 个门: 蓝藻门 (Cyanophyta ) 、 红藻门 (Rhodophyta ) 、 隐藻门 (Cryptphyta ) 、 黄藻 门 (Xanthophyta ) 、 金 藻门 (Chrysophya ) 、 甲藻门 (Purrophyta)、 硅藻门(Bacillariophyta ) 、 褐 藻 门 (Phaeophyta ) 、 原 绿 藻 门 (Chloroxybacteriaphyta )、 [1] 裸藻门(Euglenophyta )、绿藻门(Chlorophyta )、轮藻门(Charophyta ) 。 如今, 越来越多的学者们将目光锁定在产油微藻上, 由微藻作为制备生物柴油的原材 料 不 会 对 农 作 物 及 其 副 产 品 的 生 产 构 成 负 面 影 响 , 而 且 由 于 微 藻 生 长 速 度 快 、 含 油 量 高, [2, 3] 随着科学技术的发展, 可以完全替代化石燃料维持供给需求 。 在最佳生长环境中, 藻类 会将脂肪酸优先合成甘油基膜脂 (主要是半乳糖基二酰基甘油和磷酸甘油) , 占其干重的 5%~20% 。 在 具 有 环 境压 力 的 培 养 条件 下 , 许多 藻 类 会 改 变它 们 的 油脂 生 物 合 成 通路 , 积 [4] 累合成中性油脂(主要是以三酰基甘油的形式)储存化学能 ,占其干重的20%~50% 。 [5] 在过去 10 亿年中, 海洋硅藻进化速度显著快于其它藻类 。 海洋硅藻富含油脂, 而三 角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum ) 内的油脂含量最高可占细胞干重的 57% , 是制备生 [2] 物 柴 油 的 优 质 原 材 料 。 此 外 , 三 角 褐 指 藻 已 完 成 全 基 因 组 测 序 , 是 继 假 微 型 海 链 藻 [6, 7] (Thalassiosira pseudonana )后第二株被全基因组测序的硅藻 ,也 是硅藻生物学研究的 模 式 藻 。 通 过 基 因 工 程 技 术 手 段 对 三 角 褐 指 藻 进 行 改 造 , 提 高 细 胞 合 成 积 累 油 脂 的 能 力, 进而提高生物柴油的产率。 TAG (triacylglycerol ,三酰基甘油) 在植物细胞内合成的主要场所是内质网, GPAT (glycerol-phosphate acyltransferase , 磷 酸 甘 油 酰 基 转 移 酶 ) 和 DGAT (diacylgycerol 1汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证 acyltransferase ,二酰甘 油酰基转移酶)是 TAG 合成过程中的催化酶。TAG 合成的起始步 骤是 G3P (diacylgycerol acyltransferase , 三磷 酸甘油) 与乙酰-CoA 由 GPAT 催化产生 LPA (lysophosphatidate ,溶 血磷脂 )。DGAT 是催 化合成 TAG 途径的最后一步的关键酶,也 [8, 9, 10, 11] 是该途径的限速酶。在 DGAT 的催化下, 第三个酯酰-CoA 与 DAG 结合产生 TAG 。 1.1 微藻柴油研究概况 生物柴油的发展主要经历了三节阶段: 第 一 代 生物 柴油 是 以油菜 籽 、 大豆 、油 棕 榈等农 作 物 为主 要原 材 料制备 而 成 ,由 于 绝 大部分制备原料来源于人类食用油, 对全球食品市场和食品安全造成冲击, 带来诸多问题。 第 二 代 生物 柴油 主 要原材 料 为 麻疯 树、 蓖 麻和废 弃 油 脂。 由于 有 些油料 植 物 可以 生 长 在 比 较 恶 劣 的 环 境 中 , 这 不 仅 解 决 了 利 用 食 用 油 制 备 生 物 柴 油 所 带 来 的 原 料 和 经 济 问 题, 还可以充分利用荒地。但是由于原料供给的限制,严重制约着生物柴油的规模化生产。 第 三 代 生物 柴油 主 要以微 藻 为 主要 原料 制 备得到 的 。 微藻 主要 可 生产合 成 三 类生 化 组 [12, 13] 分 : 碳 氢 化合 物 ,蛋 白质 和 油 脂 。仅 在 美国 , 生 物 柴油 如 需完 全取 代 化 石 燃料 , 每 年 [14] 共需要消耗 5.3 亿生物 柴油 。只采用油料作 物、废弃的食用油和动物脂肪作为原材料是 远远达不到这个要求的, 而且 以消耗农作物为 代价而生产出的生物柴油不仅会对食品安全 [12, 15] 产 生 负 面 影响 , 还会 导致 生 物 柴 油价 格 不菲 ,不 利 于 普及 。 相 比于 其 他 制 备原 材 料 而 [3, 14, 16] 言, 微藻具有许多优点 :1 生长速度快;2 可合成和积累中性油脂;3 生长环境限 制少;4 可利用荒地进行养殖;5 净化水质与空气;6 生产有价值的副产物 ;7 在合适 的生物反应器中可全年生长。 1.2 植物细胞 TAG 的合成途径 油脂合成是一个非常复杂的生理生化过程, 在过去的半个世纪中, 学者对油脂合成的 生 化 途 径 了 解 较 为 深 入 , 并 成 功 克 隆 、 鉴 定 了 一 些 与 油 脂 合 成 相 关 的 关 键 酶 基 因 。 目 前, 许多关键酶基因的功能已经有了初步了解, 利用基因工程技术手段, 在提高种子含油量和 改变脂肪酸组分取得一些进展。 微藻与高等植物 脂 类代谢途径基本相同, 见图 1.1。 在细胞叶绿体中,CO 经过卡尔文 2 循 环 在 细 胞 内 合 成 葡 萄 糖 , 葡 萄 糖 经 过 糖 酵 解 反 应 生 成 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 进 而 产 生 乙 酰 -CoA 。 脂肪酸的合成是以乙酰-CoA 为前提, 在 ACCase (acetyl-CoA carboxylase , 乙酰-CoA 2汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证酰基羧化酶) 的催化下, 两个乙酰-CoA 合成 一个丙酰-CoA 。 丙酰-CoA 在 FAS (fatty acid synthesis ) 酶系的催化 下, 酰基碳链进行延长, 每个催化反应酰基碳链可增加两个碳原子, 羟基碳链在 FAT (fatty acyl-ACP thioesterase , 酯酰 ACP 硫酯酶)的催化下生成游离脂肪 酸。 细胞质中, 游离脂 肪酸与 CoA 合成酯酰-CoA 。 脂酰辅酶 A 进入 TAG 合成过程, 这个 过程主要在内质网上进行, 游离脂肪酸在 GPAT 的催化下, 结合至甘油 sn-1 位生成溶血磷 酸; LPAT (lysophosphatidate acyltransferase , 溶血磷脂酰基转移酶) 催化下, 第二个酯酰 -CoA 结合至甘油 sn-2 位合成 DAG;在 DGAT 的催化下, 第三个酯酰-CoA 结合至甘油 sn-3 [17] 位上,最终形成 TAG ,这三个酶被定义为 TAG 组装酶。 由三个主要步骤组成: 1 在 ACCase 的催化下,两个乙酰-CoA 羧化生成丙酰-CoA ; 2 在 FAS 酶系的催化下 ,酰基碳链延长; 3 在 TAG 组装酶的催化 下,内质网上合成 TAG 。 另外, 油脂与磷脂的合成有许多重叠交叉的地方, 作为细胞生命活动的重要场所, 磷 脂的合成和其脂肪酸的组成在其正常生长过程中必然会受到精密的调控。 因此, 如需通过 基因手段提高细胞产油量,则必须将细胞自身正常的代谢调控等因素考虑在内。 3汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证 [18] 图 1.1 微藻 油脂 合成 的代 谢通路 的简 单图 示 Figure 1.1 Simplified overview of the metabolites and representative pathways in microalgal 1.2.1 ACCase 的研究进 展 [9, 19, 20, 21] ACCase 是植物细胞中 脂肪酸合成的重要限速酶,具有三个功能 :1 生物素羧 基载体蛋白;2 生物素 羧化酶;3 羧基转移 酶。 植物细胞中, 脂肪 酸合成全部都是在形 成 [22, 23] 的种子之中 。 质体 ACCase 较细胞质 ACCase 结构相差很大, 质体 ACCase 是一个多亚 [9] 基的原核型催化酶,而细胞质 ACCase 是一个多功能的真核型催化酶 。 [19, 24] [25] ACCase 在植物体内对脂肪酸合成的代谢途径有很强的控制作用 。Sellwood 等 通 过反义 RNA 技术将油菜 ACCase 活性抑制, 转基因油菜植株的成熟种子中的油脂含量明显 下降,从此可以看出油菜籽的油脂含量与 ACCase 活性密切相关。 在大豆形成的早期和中 [26] 期时,高油脂大豆细胞中的 ACCase 活性比低油脂大豆细胞的高 2 倍 。拟南芥细胞质 4汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证 [27] ACCase 在土豆细胞中过表达会导致土豆块茎的 TAG 含量提高 5 倍 。 说明 ACCase 表达 [28] 水 平 可 能 是 脂 肪 酸 合 成 途 径 的 关 键 因 素 。Ohlrogge 等 利 用 农 杆 菌 转 基 因 法 将 拟 南 芥 ACCase 成 功 导 入 油 菜 之 中 , 转 基 因 植 株 产 生 的 成 熟 种 子 比 野 生 型 植 株 ACCase 活 性 高 [39] 12~19 倍,但种子内的脂 肪酸含量却只提高 6% ,Roesler 也发现了相 似情况 。 [24] 1995 年, Dunahay 等 成功将内源 ACCas 转 化硅藻隐形小环藻 (Cyclotella cryptica), 并实现细胞内的过表达。此外还将隐性小环藻 ACCase 转化 Nicotiana saprophila ,研究发 [31] 现,尽管两株转化藻细胞 ACCase 活性提高了 2~3 倍,但没有发现油脂产量升高 。虽然 隐性小环藻油脂含量并未提高, 但却是人类首次尝试通过修饰油脂代谢的相关基因, 对提 高 油 脂产 油能 力 进行 研究 。 不论 在高 等 植物 或硅 藻 中,ACCase 的 过表 达 都不 能大 幅 度增 加细胞 油脂含 量, 因此 可以推 断,ACCase 并 不能作 为大幅 度提 高油 脂代谢 研究中 的操作 靶点。 1.2.2 FAS 酶系的研究 进 展 脂肪酸合成过程比较复杂, 整个过程是由许多酶同时参与进行的, 这些酶被称作脂肪 酸合成酶系,每个酶促循环使酯酰碳链增加两个碳原子,见图 1.2。 [18] 图 1.2 叶绿 体中 脂肪 酸从 头合成 通路 Figure 1.2 Fatty acid de novo synthesis pathway in chloroplasts 5汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证FAS 酶系催化产生脂肪 酸, 作为前提供给合成叶绿体或其他细胞器的磷脂膜等, 同 时 也 作 为 微 藻 在 不 利 环 境 下 积 累 油 脂 ( 主 要 为 TAG ) 的 原 料 。 在 此 反 应 中 , KAS (3-ketoacyl-ACP synthase ,3- 酮酯酰 ACP 合 成酶) 是植物质体合成脂肪酸研究的主要关键 [32] 酶。Verwoert 等 将大肠杆菌 KAS III 基因导 入油菜籽中, 发现油菜 籽中脂肪酸的主要组成 成分发生了很大变化, 转基因油菜籽中短链脂肪酸 (14:0 ) 增多而 18:1 脂肪酸减少。 Dehesh [33] 等 从菠菜 (Spinacia oleracea ) 中克隆得到 KAS III 基因, 并成功在烟 草 (Nicotiana tabacum)、 拟南芥和油菜籽中过表达,结果发现油脂代谢的速率 反 而 降 低 了 , 并 且 积 累 16:0 脂肪酸。 由于 FAS 是一个多酶的复合体,彼此之间联系紧密,所以单纯的以 FAS 中的单独一 个酶作为油脂代谢工程的改造目标以提高细胞产油的能力,似乎并不是一个好的选择。 1.2.3 TAG 组装酶的研究 进展 [4] 图 1.3 藻类 TAG 生 物合 成 通路 Figure 1.3 TAG biosynthesis pathway in algae 1 GPAT 在生物体的作用 GPAT 是生物体内合成三酰基甘油过程中催化第一步反应的催化酶, 是 TAG 在细胞内 [34] 合成的关键步骤,并被推测为限速酶 。在 GPAT 的催化下,酯酰-CoA 与 G3P 反应合成 LPA 。 实验发现,定位于内置网的 GPAT 的催化效率高于质体 GPAT 。红花质体 GPAT 基因 经 基 因 修 饰 ( 将 质 体 结 合 靶 序 列 去 除 , 连 接 上 内 质 网 结 合 靶 序 列 ) , 成 功 导 入 拟 南 芥 后, 实验结果发现, 转入未经修饰的 GPAT 的拟南芥成熟种子内油脂含量提高 了 10%~21%,而 [35] 转入修饰后的 GPAT 的拟南芥成熟种子内的油脂含量可提高 22% 。 6汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证除提高细胞油脂含量 GPAT 还会对细胞的其他代谢途径产生影响: 1 在植物萼片和花瓣中, [36] [37, 38] GPAT 是植物表皮合成途径中重要的催化酶 ; 2 GPAT 会对植株的生育能力产生影响 ; 3 GPAT 对催化底物的 选择具有偏好性 。 在不同温度下,LPA 的脂肪 酸组成种类大小也 主 [39] [40, 41] 要是由 GPAT 的选择性决定的 。 低温条件下 倾向于选择不饱和脂肪酸为催化底物 , 提 [35, 42, 43 高植物的低温耐受力 。 高温条件下 , 类囊 体膜结构的饱和脂肪酸含量普遍增加, 使得 [44] 在高温胁迫下植株的光合作用场所的稳定性增强 。 [45] 目前, 对于藻类 GPAT 研究刚刚起步。Xu 等 从硅藻假微型海链藻中克隆得到膜结合 TpGPAT 基因, 在酵母 中功能验证发现, 油脂的脂肪酸组分发生变化,16:0 脂肪酸在 TAG 的组成中增加约 18% , 磷脂的组成中增加约 12% ,而不饱和脂肪酸 16:1 和 18:1 分别减少 15% 和 21% 。 2 LPAT 的研究进展 在 LPAT 的催化下,LPA 与酯酰-CoA 生成 DAG 。 [40] Rao 等 将酵母 SLC1 和 SCL1-1 (LPAT ) 成功 在拟南芥、 油菜和大豆胚胎中异源表达, 发现转基因植株中 TAG 含量都有所增加。类似于 GPAT ,LPAT 对植株的生育能力产生影 [47, 48, 49] 响,并且也对催化底物具有偏好性 。 3 DGAT 的研究进展 DGAT 是生物体中控制 合成 TAG 的最后一步催化反应, 在 DGAT 的催化下, 酯酰-CoA 结合至 DAG 的最后一 个羟基上,合成 TAG 。 DGAT 基因在 TAG 合成的过程中具有重要作用。拟南芥 AtDGAT 突 变会直接减少种 [50, 51, 52] [53, 54, 55, 56] 子内油脂积累量 ,TAG 脂肪酸组分发 生改变 ,对种 子的形成、发芽率和幼 苗 [57] 生长产生影响 。 此外,AtDGAT1 基因的缺失还会增加植株对脱落酸、 葡萄糖和外界渗透 [50, 5] 压的敏感性。油菜和烟草的 DGAT1 基因沉默实验中也得到了类似的结果 。 拟南芥 AtDGAT 在烟草中的异源表达会导致烟草叶片中 TAG 积累量 提高 20 倍, 植株 [58] [59] 干重油脂含量提高 2 倍 。旱金莲(Tropaeolum majus )TmDGAT1 在拟南芥和油菜中的 异源表达也发现转基因植株的油脂含量有所增加。 当油菜 BnDGAT1 基因过表达时,转基 [60, 61] 因植株在干燥的环境之下,种子的油脂含量显著升高,最高可达 14% 。 7汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证单细胞绿藻 Ostreococcus tauri 中 OtDGAT2 基因 (OtDGAT2A 和 OtDGAT2B ) 在缺陷型 [62] [63] 酵 母 中 进 行 功 能 验 证 后 , 发 现 OtDGAT2B 具 有 更 广 泛 的 底 物 催 化 性 。Gong 等 和 [64] Guiheneuf 等 分别从 三角褐指藻中克隆得到 PtDGAT2B 和 PtDGAT1 基因,并在缺陷性酵 母中成功对其功能进行了验证。 1.2.4 其它相关途 径的研 究进展 [9] 图 1.4 与 TAG 合成 过程 相 关的其 他旁 路 Figure 1.4 Bypasses connected to TAG biosynthesis ACS (acetyl-CoA ,乙 酰-CoA 合成酶)、ME (malic enzyme,苹果 酸脱氢酶)和 ACL (ATP:citrate lyase ,ATP: 柠檬酸裂解酶) 基 因在生物体内过表达实验发现, 细胞内脂肪酸 [9] 合成速率升高, 油脂含量也得到了相应升高 。 在真核细胞中,β- 氧化是主要降解脂肪酸的 [65] [66] 通路 , 但阻断β- 氧化会对细胞的生长有负面影响 。 磷脂合成过 程是 TAG 合成的竞争 过程,LPA 进入磷脂合 成通路直接导致 TAG 合成途径中催化底物的减少,TAG 合成效率 [9] 降低 ;油菜细胞内 PEPC (phosphoenolpyruvate carboxylase ,磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶) [67] 的抑制使得油脂含量升高 6.4%~18% ,意味 着 PEPC 活性的降低 可以促进 油脂的积累 。 [68, 69] Sugimoto 等 在转基 因大豆中也得到了相似的结果。 在微藻中,PEPC 在脂肪酸的积累过 程中具有重要的调节作用,降低 PEPC 在聚球 藻属 Synechococcus sp. 细胞内的活性可以直 [70] 接增加油脂含量 。 1.3 三角褐指藻的生物学概述 三角褐指藻 (P. tricornutum ) 是一种单细胞海洋 硅藻 , 隶属于硅藻门 (Bacillariophyta), 羽纹藻纲(Pennatae ) ,褐指藻科(Phaeodactylaceae ),褐 指藻属(Phaeodactylum ) 。藻 8汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证体单细胞, 细胞中部有一个细胞核, 细胞内含有黄褐色的色素体 1~3 片, 有卵形、 纺锤形 和三出放射形细胞三种形态, 见图 1.5, 常见的为纺锤形和三出放射形。 卵形细胞长 8 μm , 宽 3 μm , 有硅质外壳, 纺锤形和三出放射形细胞均无硅质外壳, 纺锤形细胞长 25~35 μm , 三出放射形细胞长度约为 10~18 μm (两臂间的垂直距离) 。 三种形态 在不同的环境条件下 可以相互转变。 三角 褐 指藻的增殖一般是通过平行分裂的方式平均产生 两个形态相同的子 细胞, 因为细胞无硅质外壳, 所以不同于其他种的硅藻, 藻细胞不会随着细胞分裂而缩小。 [7] 三角褐指藻在中国沿岸海域均有分布。 三角褐指藻油脂含量高, 一般可达干重的 20%~30% , [2] 最高可达 57% 。 [1] 图 1.5 三 角褐 指藻 Figure 1.5 P. tricornutum 三 角 褐 指 藻 是 研 究 硅 藻 生 理 学 和 分 子 生 物 学 的 模 式 藻 种 , 完 整 基 因 组 序 列 已 于 2008 [6] 年 11 月 13 日由 Nature 发布 ,也是继假微型 海链藻 (Thalassiosira pseudonana )后第二 [7] 个被测序的硅藻 。 三 角褐指藻全基因组较小, 仅为 27.4Mb , 分析 得到约 10000~14000 条 基因, 仅有约 50% 可在现有的实验条件下分析预计出它们的功能, 其中三角褐指藻特殊的 [5, 6, 71, 72] 基因约占 35% 。 假 微 型 海 链 藻 和 三 角 褐 指 藻 的 全 基 因 组 序 列 展 示 了 发 展 起 源 和 新 陈 代 谢 的 适 应 性 使 它们获得在生态上的成就。 一个重要的研究是 它们从内共生的细菌中得到并整合至基因组 中, 此外还从其它海洋细菌的基因进行了横向转移, 使得硅藻成为了一个独特的基因 “熔 [73] 炉”, 有控制 某些特 殊 新陈代 谢过程 的能力 。由“ 熔炉” 硅藻的 基 因组的 分析发 现,硅 [74] 藻的发 展起源 源自于 一 系列异 养性细 胞宿主 和 内源性 红藻、 绿藻间 的 基因转 移 。这个过 程 既 有 从 捕 获 的 红 藻 、 绿 藻 或 海 洋 细 菌 的 细 胞 核 也 有 从 其 他 细 胞 器 转 移 至 宿 主 细 胞 核 中。 [73] 硅藻似乎在分化出中心硅藻和羽纹硅藻后也通过基因转移的方式获得了核基因 。 9汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证1.4 本论文研究内容和意义 硅 藻 是 海 洋 生 态 系 统 中 重 要 的 初 级 生 产 者 , 贡 献 了 地 球 全 部 初 级 生 产 力 的 五 分 之 一, 在硅循环和碳固定反应中也占据重要地位。 三角褐指藻作为一种优良的经济微藻, 受到了 人 们 的 重 视 。 三 角 褐 指 藻 的 培 养 易 于 人 为 控 制 、 个 体 单 细 胞 , 生 长 速 度 快 、 生 长 周 期 短 , 而且细胞富含蛋白质、多糖、 多不饱和脂肪酸 和脂肪酸等多种高价值活性物质, 具有广 阔 的应用开放前景。 以三角褐指藻作为研究材料具有以下优势: 1 三 角 褐 指 藻 作 为 重 要 的 硅 藻 研 究 的 模 式 藻 种 , 全 基 因 组 测 序 已 经 完 成 , 大 小 仅 为 27.4 Mb ; 2 藻细胞油脂含量高,一般可达 20%~50% ; 3 单细胞藻种,细胞结构简单,生长速度快,生长周期短; [75] 4 三角褐指藻通用转化载体 pfcpA-MCS/fcpB-Bar 构建成功 ; 5 遗传转化系统成熟,基因转化参数为:压力 1550 psi ,轰击距离 6 cm ; 6 三角褐指藻 PtDGAT2 和 PtDAGT4 基因表达框的成功克隆; 7 比较基因组学发现,TAG 合成途径在植物细胞内比较保守,可利用高等植物的研 究方法对三角褐指藻进行研究。 本文基于 GenBank 已 登录的序列,利用 RT-PCR 的方法对三角褐指 藻 TAG 组装酶 基 因进行克隆,希望得到 TAG 合成过程中 GPAT 基因的完整 cDNA 序列。通过基因工程手 段,使三角褐指藻与 TAG 合成相关的内源基 因在细胞内过表达,对藻种进行改造,提高 其产油能力,增加胞内油脂含量。 10汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证第二章 三角褐指藻磷酸甘油酰基转移酶 1 (PtGPAT1 ) 基因 的克隆与分析 2.1 三角褐指藻的培养 与分子鉴定 2.1.1 材料与方 法 2.1.1.1 藻种 三角褐指藻(P. tricornutum )单克隆藻株 PT-05 由中国科学院海洋研究所殷明炎惠助 理研究员赠。 2.1.1.2 主要试剂和培养基 植物基因组提取试剂盒购自北京天根生物有限公司; 引物均由上海桑 尼生物科技有限 公司合成 ;Taq DNA polymerase 和 dNTPs 购自北京 全式金 生物技 术有限公 司;Lambda DNA/EcoR I+Hind III Marker, 3 购自 fermentas 公司,见下图; 11汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证f/2 海水培养基配方如表 2.1, 大量元素、 微量 元素和维生素溶液分别配置为 1000 倍母 液,大量元素、微量元素和过滤海水 1 经 15 ? 灭菌处理,维生素溶液使用 0.22 μm 的滤 膜过滤除菌。f/2 海水固体培养基补加 1.5% 琼脂粉。 表 2.1 f/2 海水 培养 基母 液 (1000 ×) 配方 Table 2.1 Composition of f/2 seawater media 组成成分 含量(g/L ) 组成成分 含量(g/L ) 大量元素 微量元素-2 NaNO 74.8 ZnSO ?4H O 2.3×10 3 4 2 NaH PO 4.4 MnCl ?4H O 0.178 2 4 2 2 -2 EDTA-Na 4.35 CuSO ?H O 1×10 2 4 2 -3 Na SiO ?H O 8.4 Na MoO ?2H O 7.3×10 2 3 2 2 4 2 -2 CoCl ?6H O 1.2×10 维生素 2 2 -4 B 5×10 FeC H O ?5H O 3.9 12 6 5 7 2 B 0.1 1 -4 H 5×10 2.1.1.3 藻种培养条件 -2 -1 培养温度为 22 ?,光照强度为 30 μmol photons? m ?s ,光周期为 光 16 hr :暗 8 hr , 于 f/2 海水培养基不充气静置培养,每天摇动一次 2.1.1.4 三角褐指藻 生长曲线的测定 藻液初始接种密度为 OD 0.020 ,每隔 24 hr 取样测量一次,同时使用血球计数板 460 在显微镜下统计藻细胞个数,并计算其浓度。 将培养的藻液摇匀, 用血球计数板在显微镜下计数, 每个样品测定三个平行, 每个平 行重复测定三次,统计藻细胞浓度后计算平均值。根据藻细胞浓度绘制其生长曲线。 2.1.1.5 三角褐指藻总 DNA 的 提取 利用植物基因组提取试剂盒(天根)提取三角褐指藻总基因组 DNA (Pt-DNA )。 12汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证6 三角褐指藻培养至指数生长中期,取约 1.0×10 个藻细胞,4?,6000 ×g 离心 5 min , 收集藻体,置于 1.5 ml 离心管中,转入液氮冰冻 1 hr ,转移到预冷研 钵中,再加入液氮, 迅速将材料研磨成粉末;具体操作步骤参见 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 。 2.1.1.6 ITS 序列扩增及测序 三角褐指