响应面分析法优化槐米芦丁超声波提取工艺的研究

响应面分析法优化槐米芦丁超声波提取工艺的研究 马国刚 ，王建 中 ，卢晓蕊 1(北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京，100083) 2(山西运城学院生命科学系，山西运城。044000) 摘 要 通过超声波辅助提取技术，考察了提取时间、超声波功率及提取次数、料液比四因素对槐米芦丁提取率 的影响。用 SAS软件程序对实验数据进行 了二次响应面分析，对4项工艺参数进行 了优化，得出槐米芦丁超声 波提取的二次回归方程；通过岭脊分析得出槐米芦丁超声波提取的最佳条件为：室温下，20 kHz、1 000 W 超声 波，料液比(g：mL)1：15，提取 10 rain，连续提取 2次。在此条件下测得的芦丁提取率为 19．16 。 关键词 响应 面分析法 ，芦丁，超声波提取 槐米 (flos sophorae)为豆科植物槐树 (Sophora japonica L )的干燥花蕾及花 ，夏季花蕾形成时或花 开放初采收，及时干燥，除去枝、梗及杂质。前者习 称”槐米 ”，后者习称“槐花”。槐米用 作药用 已有 2 000多年历史 ，《神农本草经》还将其列为上品。槐米 中含有芦丁、槲皮素、皂苷、多糖黏液质等成分，其中， 芦丁是主要药用成分，因此对其研究有非常现实的意 义。目前 ，我国芦丁生产主要 以槐米 (槐米中的芦丁 随产地及收取时间的不同其含量在 10 ～28 之 间)为原料进行提取 ]。由于传统的芦丁提取工艺 如热水提取法、热醇提取法、冷碱水浸提法等，多存在 提取效率低、成本高、工艺流程长、提取芦丁的纯度 差、炽灼残渣偏高等缺点 ]。为了降低成本，提高效 率 ，本研究采用超声 波辅助方法对传 统工艺进行改 进，优化提取条件从而为生产应用提供技术支撑。 有关槐米芦丁超声波提取工艺的研究 国内有一 些报道 ，但不够系统 ，国外相应研究较少。本文就超 声波提取中影响槐米芦 丁提取率的几个重要因素作 了系统研究 ，并运用响应 面分析(response surface a— nalysis，RSA)法[11]对槐米芦丁的超声波提取条件进 行 了优化。用 Box—Benhnken的中心组合实 验设 计，对实验数据进行 RSA法分析，对拟合数学模型进 行了较为详细的描述 ，得到了槐米芦丁超声波提取的 最佳条件。 l 实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 1．1 材 料 槐米干品 ，北京中洋大药房 ，产地河北 ；芦丁标准 第一作者：硕士研究生(王建中教授为通讯作者)。 *北京林业大学自选课题基金 收稿Et期：2007—02—14，改回日期：2007—07～2O 品，北京化学试剂公 司，ACROS进 口分装；硼砂、亚 硫酸氢钠 ，分析纯 。 1．2 主要仪器 SHB-11I循环式多用真空泵，郑州长城科工贸有限 公司；722S分光光度计，上海市棱 光技术有 限公 司； DF204电热鼓风干燥箱 ，北京西城区医疗器械二厂 ； JAC-600超声波中药处理机 ，山东济宁超声 电器有 限 公司；TDL-5台式离心机，上海安亭科学仪器厂。 2 实验方法 2．1 芦丁浓度一吸光值工作曲线 根据 中国药典 2005年版(第一部)，绘制芦 丁浓 度一吸光值标准曲线 。 精密称取在 120℃减压干燥至恒重的芦丁标准 品 200 mg，置 100 mL容量瓶中，加甲醇 70 mL，置水 浴上微热使溶解，凉至室温时，加甲醇至刻度，摇匀。 精密吸取 10 mI ，置 100 mL容量瓶中，加水至刻度 ， 摇匀即得(每 1 mL中含无水芦丁 0．2 mg)。精密量 取上述标准溶液 0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0与 6．0 mL 分别置 25 mL容量瓶中，各加水至 6 mL，加质量分 数 5％亚硝酸钠溶液 1 mL使混匀，放置 6 min，加 10 硝酸铝溶液 1 mL摇匀 ，放置 6 rain，加氢氧化钠 试液 10 mL，再加水至刻度 ，摇匀 ，放置 15 rain；按照 分光光度法，在 500 nm 的波长处 比色测定 吸光度， 以吸光度为纵坐标，芦丁浓度 为横坐标，绘制标准 曲 线，如 图 1所示 。其趋 势线 方程为 Y=9．175 9+ 0．002 4X 2．2 超声波提取槐米芦丁的工艺流程 槐米干品一粉碎一超声波提取(pH8～9)一过 滤 一 酸沉(pH 2～3)一静置一过滤一干燥一芦丁粗 品 取约 10 g经粉碎过筛预处理 的槐米干粉 ，按一 生蔓塑鲞笺 塑(篁笺 塑2I167 维普资讯 http://www.cqvip.com 定料液比加入水 ，同时加入 0．35～0．45 g硼砂 、0．50 ～ 0．60 g亚硫酸氢钠 ，用氢氧化钠溶液调 pH 为 8～ 9，搅拌均匀 ，放入超声波发生器(20 kHz)，室温超声 处理。离心、过滤得滤液。滤渣 中再加水 ，硼砂 0．35 ～ 0．45 g、0．50～0．60 g亚硫酸氢钠 ，用氢氧化钠溶 液调 pH为 8～9，再次超声波处理，离心、过滤 。合 并 2次滤液，以盐酸调 pH至 2～3。结晶析出时，抽 滤 ，干燥得到芦丁粗品。 2．3 芦丁提取率测定 取干燥芦丁粗品约 1 g，精密称定，加甲醇溶解后 移入 100 mL容量瓶 ，再加甲醇洗涤并入容量瓶 ，加 甲醇至刻度，摇匀。精密量取 10 mL置 100 mL容量 瓶，加水至刻度，摇匀。精密量取 3 mL置 25 mL容 量瓶中，按照标准曲线制备项下的方法 ，自“加水至 6 mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试 品溶 液中芦丁的浓度，计算即得槐米 中芦丁的含量。 芦丁含量／ ： × ×1O0 M一 槐米干粉，g；M ——称取的干燥芦丁粗 品 g；M2～ ～总的干燥芦丁粗品，g；C——从标准曲 线上读 出供试 品溶液中芦丁的浓度 mg／mL。 3 结果与讨论 3．1 超声波提取过程中的单因素影响 影响槐米芦丁超声波提取率的因素很多，如提取 温度 、提取时间、料液 比、提取次数 和超声波功率 、超 声波频率等 ，在进行 RSA分析前 ，应先通过单因素实 验来选取实验因素与水平。 3．1_1 料液比的影响 结合预实验结果和前人报道『4]，本研究利用 1 000W、2 kHz超声波提取装置 ，在 pH 8～9的碱溶液 中室温下超声波提取 20 min，连续提取 2次 。研究 不同料液比对槐米芦丁提取率的影响，其结果如图 2 所示 。 0 0l 0，02 0．03 004 0．()5 0．1 _Y芦 】一浓度 mgmL 图 1 芦丁标准曲线 168 l ! l ! ! ! 鱼 图 2 提取料液 比对槐米芦丁提 取率 的影响 由图 2可见料液 比达 1：15时芦丁提取率达最 大值。证明此时槐米芦丁 已全部被溶解 出来 ；理论 上，随着料液比越大，溶解出的芦丁不变，芦丁提取率 应该为恒值。但在整个提取过程中总会有原料和成 品的损失 ，料液比越大 ，损失越大，所以芦丁提取率在 料液比大于 1：15时有下降趋势。因此，在提取过程 中只有选择合适比例的料液比，芦丁才会充分溶解。 3．1．2 提 取 温度 的影响 固定提取料液 比为 1：15，20 kHZ、1 000 W 超 声波提取 20 min，2次。改变提取温度 ，研究不同提 取温度对槐米芦丁提取率的影响，其结果如图 3所 示。从图 3可见，室温下槐米芦丁提取率达到最大 值，这主要是因为芦丁是多酚羟基化合物，室温下氧 化速率慢，故芦丁提取率高。随着温度的升高，芦丁 在碱溶液中的溶解度增大，同时氧化速率也加快 ； 提取温度在 30～70~C之间，随着温度的上升，芦丁的 提取率也缓慢上升 ；在温度 70℃时，芦丁在碱溶液 中 的溶解度达最大值，提取率相对较高，但由于氧化速 率相应增大，故提取率仍低于常温提取。提取温度 70℃以上时 ，芦丁的溶解度不再加大或增加缓慢，而 其氧化速率却继续增大，故芦丁提取率显著下降。 、 簪 醛 L_ 扭 图3 温度对槐米芦丁提取率的影响 3．1_3 超声波功率的影响 固定提取料液比为 1：l5，室温下 20 kHz超 声 波提取 20 min，2次。改变超声波功率 ，研究不同超 声波功率下槐米芦丁提取率的变化，其结果如图4所 维普资讯 http://www.cqvip.com 示。从图 4可见 ，随着超声波功率 的增加芦丁的提取 率不断增加 ，在 1 000 W 达到最大值。这主要是因为 芦丁为槐米细胞中的次生代谢产物，存在于槐米细胞 的液泡中，通过破坏槐米 的细胞 壁和细胞膜 ，也就使 芦丁更易于被提取出来口 ，超声波功率越大，越能有 效的破坏原料的细胞壁，使得芦丁充分溶出。 ＼ 静 盛 垃 图 4 超声波功率对槐米芦丁提取率的影响 3．1．4 提 取 次数 的影响 固定料液比为 1：15，室温下 1 000W、20 kHz超 声波提取 20 rain。研究在提取次数改变情况下槐米 芦丁提取率的变化 ，其结果如图 5所示 。 提取次数 图 5 提取料液比对槐米芦丁提取率的影响 从图 5可见 ，超声波 2次提取的槐米芦丁即达到 最大值，提取次数越多芦丁提取率反而下降。主要是 因为芦丁被氧化造成的。 3．1．5 提取 时间的影 响 固定料液比为 1：15，室温下 1 000W、20 kHz超 声波提取 2次 。研究在提取时间改变情况下槐米芦 丁提取率的变化 ，其结果如图 6所示。 从图 6可见 ，提取时间小于 10 rain时，随着时间 的增加 ，芦丁提取率不 断增加 ，但提取 时间大于 10 rain时，随着提取时间的延长，芦丁的提取率反而有 下降的趋势。主要原因是超声波辐射时间过短，不能 有效地破坏原料 的细胞壁 ；辐射时 间长 ，理想上应该 获得较高的提取率，但在长时间的超声作用下，原料 会被粉碎成较细的颗粒而穿透滤布(纸)，造成损失。 同时芦丁被氧化(时间越长芦丁被氧化的量就越大)， 2() 母 15 ＼ ．Iii- 盛 1O 救 5 O 5 10 20 30 40 50 00 提取时间／rain 图 6 提取时 间对槐米芦丁提取率的影响 不能获得满意的结果 ]。实验中加人硼砂、亚硫酸氢 钠的目的就是为了保护芦丁分子的邻二酚羟基和母 核不被氧化 。 3．2 采用响应面分析法对槐米芦丁超声波提取工艺 的优化 3。2．1 响应面分析因素水平的选取 根据 Box--Benhnken的中心组合 实验设 计原 理，综合 3．1单因素影响实验结果，选取提取时间、料 液比、提取次数 、超声波功率对槐米芦 丁提取影响显 著的四个因素，在单因素试验的基础上采用四因素三 水平的响应面分析方法。实验因素与水平设计见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1。 表 1 响应面分析因素与水平 试验因素 ——二 翌生 3．2．2 响应 面分析试验设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 以提取时间 x 、提取功率 x 、和料液比 x。、提 取次数 X 为 自变 量，以槐 米芦 丁提 取率 为响应值 (y)，进行响应面分析实验。实验方案及实验结果见 表 2。 3．2．3 多元二次响应面回归模型的建立与分析 对表 2实验的结果通过 SAS软件程序进行二次 回归响应面分析 ，建立 多元二次 响应 面回归模 型：y 一 17．516 67— 0．112 5X1+ 0．590 8X2— 0．015X3— 0．19X4—0．129 6X】。+0．095 0X2X1+1．442 9X；+ 0．24X3X1— 0．175 OX3 X2+ 0．514 2X3。+ 0．187 5X4X1—0．692 5X4X2+ 0．485 0X4X3— 0．640 8X 生蔓 鲞蔓 塑(璺蔓 塑!J169 维普资讯 http://www.cqvip.com 表2 响应面分析方案及实验结果 表 3 二次响应 面回归模型方差分析 表 3是二次响应面回归模型的方差分析表 ，从表 3来看，此回归模型的 R 一0．893 9 F一7．22 Pr<0．001，所 以该 方程 是高度显著的；从另一 种意义上讲，这种实验方法是可靠的，从而表明该方 程对实验拟合情况好 ，实验误差小 ，因此可用该 回归 方程代替实验真实点对实验结果进行分析。回归模 型各项的方差分析结果还表明，一次项 、二次项都有 较高显著影响 ，所以响应值 的变化相 当复杂 ，各个具 体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。 表 4是各因素的方差分析表 。从表中可 以看出 影响槐米芦丁提取率的各 因素按影响大小排序依次 为超声波功率 x。、提取次数 x 、料液 比 X。、提取时间 170 1 ! ‘-曼 璺 !旦! 垒 x ，其中超声波功率对槐米芦丁提取 率的影 响达到 高度显著水平(Pr％0．001) 表 4 因素方差分析表 图 7～图 12直观地反映了各因素对 响应值的影 响，比较六组图可知：超声波功率(X )对槐米芦丁提 取率的影响最为显著 ，表现为曲线较陡；其次为提取 次数(X )、提取料液 比(X。)与提取时间 (X )，表现 为曲线较为平滑，随其数值的增加或减少 ，响应值变 化较小。 l8 18 l8 17 l7 图 7 Y — l厂(X ，X )的响应面 图 8 Y — f(X ，X。)的响应 面 一 1 o 一】fl 图 9 Y — f(X ，X )的响应 面 帅 H I{ 艘 引 懈 !===二 ／t 维普资讯 http://www.cqvip.com 20 l3 19．33 l8．54 17．74 l6．95 1 19 97 l9 l9 墙 4l l7 62 16．84 l 18．7l 18 27 l7 83 17．39 l695 l 图 1O Y — f(Xz，Xs)的响应 面 图 11 Y — f(Xz，X )的响应 面 1．O 图 12 Y — f(Xs，X )的响应 面 表 5 典型分析表 从典型分析表(见表 5)中可 以看出，4个 因素的 特征值有正有负，表明此二次响应面是鞍面，无极值 存在 ，因此不能直接从此二次响应面上找出最佳工艺 参数 ，需要进一步作岭脊分析。 3．2．4 脊岭分析 脊岭分析的原理是在以原始设计中心点为球心， r为半径的超球 面与 响应面的交点形成 的轨迹 范围 内找出最佳响应值，即最佳工艺条件 。岭脊分析 结果见表 6。 表 6 脊岭分析 从表 6可以看出，最大响应值时的编码半径为 1．0，此时的提取时间 X 一一0．02，超声波功率 X 一 0．98，料液 比 X。一一0．11，提取 次数 X 一一0．19。 由此可以确定超声波提取槐米芦 丁的最佳工艺参数 为 ：室温提取 ，时间 9．9 min，超声波 20 kHz、996 W， 料液 比 1：14．5，提取 1．81次。 3．2．5 模 型的验证 为检验 RSA法的可靠性，采用上述最优提取条 件进行槐米芦丁超声波提取实验，同时考虑到实际操 作的便利，将槐米芦丁超声波提取最佳条件修正为室 温下提取时问 10 min，超声 20 kHz、1 000 W，料液比 1：15，提取 2次 。实际测得的提取率为 19．16 ，与 理论预测值相差不大 ，因此 ，采用 RSA法优化得到的 提取条件参数准确可靠 ，具有实用价值。 4 结 语 响应面分析方法是研究几种因素 间交互作用的 回归分析方法。用该方法研究槐米芦丁超声波提取 工艺参数，求得的回归方程精度高；可以准确找到整 个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，是比较 理想的方法。该方法通过响应面图直观分析 了各因 素对槐米芦丁提取率的影 响，以及各因素之间对提取 过程的交互影响。因此，可以判断槐米芦丁超声波提 取过程是个复杂的传质过程。 参 考 文 献 1 董艳芬，李 坚．槐花的现代研究与临床应用EJ]．中医药 信息 ，2001(6)：21～23 2 史振民，张祝莲，杨文选，等．超声法提取芦丁操作条件的 最佳选择[J]．延安大学学报(自然科学版)，1999，18(3)： 46～ 49 3 萨燕平，彭永芳．超声辐射提取槐花米中的芦丁[J]．云南 l 2007年第33卷第8期(总第234)期)J 171 一J 维普资讯 http://www.cqvip.com FOOD AND FERMENTAT10N INDUSTR 化工，1996(4)：25～26 流大会(大会邀请 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 )，北京，2004—1O一26，26～29 4 王昌利，杨景亮，朱周才，等．超声提高芦丁得率的实验研 13 赵 兵，循环超声提取技术在 中药提取中的应用Ec]．中 究[J]．中成药，1993，15(2)：7～8 药提取技术(国际)研讨会(大会邀请报告)，西安，2005— 5 龚盛昭，何远伦．从槐米中提取芦丁的研究[J]．中国资源 O3—25 综合利用 ，2003(1)：22～24 14 关 奕，葛 锋，王晓东，等，新疆紫草中紫草宁及其衍生 6 张来新．槐花米中芦丁的提取[J]．山西化工，2002，22(1)： 物的循环超声强化提取[c]．第二届中药提取技术(国 16～17 际)研讨会论文集(国内专场报告会)，西安，2005—07． 7 舒晓宏，冯 梅，邓 卅，等．槐花米中芦丁提取最佳 pH 188～192 值的实验研究[J]．大连医科大学学报，2005，27(2)：91～ 15 孟祥颖，郭 良，高文义，等．芦丁的来源、用途及提取纯 92 化方法[J]．长春中医学院学报，2003，19(2)：61～64 8 陈永城，李宝才，余艳颖，等．芦丁提取工艺改进的研究 16 费荣昌．实验设计与数据处理(第 4版)I-M]．无锡：江南 [J]．医药学刊，2004．22(11)[J]：6O～61 大学出版社，2001．59～63 9 曹永刚．芦丁提取工艺 的研究 [J]．中国医药工业杂志， 17 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北 1993，24(2)：51～52 京 ：化学工业 出版社 ，2005 1O 王永宁，卢挺，田玉勇，等．槐花 中黄酮类物质提取研究 18 Carbonaro M，Grant G，Pusztai A．COST 916 Bioactive [J]．青海师范大学学报(自然科学版)，2003(4)：51～52 Micronutrients in Mediterranean Diet and Health[M]． 11 慕运动．响应面方法及其在食品工业中的应用[J]．郑州 Luxembourg：European Commission，2001，1。g～111 工程学院学报，2001，22(3)：91～94 19 Box G E P，Hunter W G．Statistics for Experiments：An 12 赵 兵．循环超声提取 分离技术 在农产 品深加 工 中的应 Introduction to Design ，Data Analysis and Model Build一 用[c]．中国农学会第六届中国农产品贮藏加工学术交 ing[M]．New York：Wiley，1990 Optim ization of the Ultrasonic W ave Extraction Technology of the Rutin from Sophara j aponica L Using Response Surface Analysis Ma Guogang ，Wang Jianzhong ，Lu Xiaorui 1(Department of Food Science and Engineering，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China) 2(Department of Lie Science，Yuncheng College，Yuncheng 044000，China) ABSTRACT The effects of time，ratio of material to water(g：mL)，extraction times，ultrasonic wave pow— er on the yield of Rutin were studied and the parameters for optimum yield were obtained by using SAS soft— ware．The results showed that the optimum parameters was：room temperature，2O kHz、1 000 W ，1：1 5 (g：mL)，10 minutes twice．In this situation，the extraction yield of Rutin is 19．16 ． Key words Sophara japonica L Rutin，extraction，response surface analysis，optimization (上接第 166页) Study on Extraction of Anthocyanins from Blackcurrant Mare with Solvents W ang Ping ，M iaoYu ，W ang Ying 1(Northeast Forestry University Forestry College，Harbin150040，China) 2(Heilongjiang Province Nongker Green Food Office 1，Harbin 150001，China) ABSTRACT Ethanol as suitable solvent was determined through single factor trials on extraction of antho— cyanins from blackcurrant marc．The optimum extraction conditions showed by response surface methodolo— gy as follows：extraction at 50~C for 108．79~131．21min with1：7．767~1：8．805 ratio of marc to 8og etha— nol and the extraction yield has 95 possibility for exceeding 82 ． Key words fruit marc of blackcurrant，anthocyanin，extraction，response surface methodology 172 2007 VoI 33 No 8(Total 236) 维普资讯 http://www.cqvip.com