酱检测作业指导书

云南阳光食品有限公司YGSP—JS—05（03）—2014保密等级：三级酱检测作业指导 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 2013-01-01发布2014-01-01实施云南阳光食品有限公司（技术部）发布目录第一章水分的测定 1第二章食盐的测定 5第三章氨基酸态氮的测定 6第四章总酸的测定 7第五章过氧化值的测定 8第六章还原糖的测定 9第七章大肠菌群的检测 11第八章菌落总数的测定 16第一章水分的测定执行 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ：GB5009.3—2011食品安全国家标准食品中水分的测定第一法直接干燥法1原理利用食品中水分的物理性质，在101.3kPa（一个大气压），温度101℃～105℃下采用挥发方法测定样品中干燥减失的重量，包括吸湿水、部分结晶水和该条件下能挥发的物质，再通过干燥前后的称量数值计算出水分的含量。2试剂和 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 除非另有 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ，本方法中所用试剂均为分析纯。盐酸溶液（6mol/L）：量取50mL盐酸，加水稀释至100mL。氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取24g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100mL。海砂：取用水洗去泥土的海砂或河砂，先用盐酸煮沸0.5h，用水洗至中性，再用氢氧化钠溶液煮沸0.5h，用水洗至中性，经105℃干燥备用。3仪器和设备扁形铝制或玻璃制称量瓶、电热恒温干燥箱、干燥器（内附有效干燥剂）、天平（感量为0.1mg）4分析步骤4.1固体试样：取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于101℃～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2mm，不易研磨的样品应尽可能切碎，称取2g～10g试样（精确至0.0001g），放入此称量瓶中，试样厚度不超过5mm，如为疏松试样，厚度不超过10mm，加盖，精密称量后，置101℃～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。（注：两次恒重值在最后计算中，取最后一次的称量值。）4.2半固体或液体试样：取洁净的称量瓶，内加10g海砂及一根小玻棒，置于101℃～105℃干燥箱中，干燥1.0h后取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量，并重复干燥至恒重。然后称取5g～10g试样（精确至0.0001g），置于蒸发皿中，用小玻棒搅匀放在沸水浴上蒸干，并随时搅拌，擦去皿底的水滴，置101℃～105℃干燥箱中干燥4h后盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。以下按4.1自"然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h左右"起依法操作。5分析结果的表述试样中的水分的含量按式（1）进行计算。X=100(m1-m2)/（m1-m3）(1)式中：X——试样中水分的含量，单位为克每百克（g/100g)；m1——称量瓶(加海砂、玻棒)和试样的质量，单位为克（g）；m2——称量瓶(加海砂、玻棒)和试样干燥后的质量，单位为克（g）；m3——称量瓶(加海砂、玻棒)的质量，单位为克（g）。水分含量≥1g/100g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。6精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。第二法减压干燥法7原理利用食品中水分的物理性质，在达到40kPa～53kPa压力后加热至60℃±5℃，采用减压烘干方法去除试样中的水分，再通过烘干前后的称量数值计算出水分的含量。8仪器和设备真空干燥箱、扁形铝制或玻璃制称量瓶、干燥器（内附有效干燥剂）、天平（感量为0.1mg）9分析步骤9.1试样的制备：粉末和结晶试样直接称取；较大块硬糖经研钵粉碎，混匀备用。9.2测定：取已恒重的称量瓶称取约2g～10g（精确至0.0001g）试样，放入真空干燥箱内，将真空干燥箱连接真空泵，抽出真空干燥箱内空气（所需压力一般为40kPa53kPa)，并同时加热至所需温度60℃±5℃。关闭真空泵上的活塞，停止抽气，使真空干燥箱内保持一定的温度和压力，经4h后，打开活塞，使空气经干燥装置缓缓通入至真空干燥箱内，待压力恢复正常后再打开。取出称量瓶，放入干燥器中0.5h后称量，并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。10分析结果的表述同5。11精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第三法蒸馏法12原理利用食品中水分的物理化学性质，使用水分测定器将食品中的水分与甲苯或二甲苯共同蒸出，根据接收的水的体积计算出试样中水分的含量。本方法适用于含较多其他挥发性物质的食品，如油脂、香辛料等。13试剂和材料甲苯或二甲苯（化学纯）：取甲苯或二甲苯，先以水饱和后，分去水层，进行蒸馏，收集馏出液备用。14仪器和设备14.1水分测定器：如图1所示（带可调电热套）。水分接收管容量5mL，最小刻度值0.1mL，容量误差小于0.1mL。1.250mL蒸馏瓶；2.水分接收管，有刻度；3.冷凝管。图1水分测定器14.2天平：感量为0.1mg。15分析步骤准确称取适量试样（应使最终蒸出的水在2mL～5mL，但最多取样量不得超过蒸馏瓶的2/3），放入250mL锥形瓶中，加入新蒸馏的甲苯(或二甲苯)75mL，连接冷凝管与水分接收管，从冷凝管顶端注入甲苯，装满水分接收管。加热慢慢蒸馏，使每秒钟的馏出液为两滴，待大部分水分蒸出后，加速蒸馏约每秒钟4滴，当水分全部蒸出后，接收管内的水分体积不再增加时，从冷凝管顶端加入甲苯冲洗。如冷凝管壁附有水滴，可用附有小橡皮头的铜丝擦下，再蒸馏片刻至接收管上部及冷凝管壁无水滴附着，接收管水平面保持10min不变为蒸馏终点，读取接收管水层的容积。16分析结果的表述试样中水分的含量按式（2）进行计算。X=100V/m(2)式中：X——试样中水分的含量，单位为毫升每百克（mL/100g）（或按水在20℃的密度0.998，20g/mL计算质量)；V——接收管内水的体积，单位为毫升（mL）；m——试样的质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。17精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第四法卡尔•费休法18原理根据碘能与水和二氧化硫发生化学反应，在有吡啶和甲醇共存时，1mol碘只与1mol水作用，反应式如下：C5H5N•2I+C5H5N•SO2+C5H5N+H2O+CH3OH2C5H5N•HI+C5H6N[SO4CH3]卡尔•费休水分测定法又分为库仑法和容量法。库仑法测定的碘是通过化学反应产生的，只要电解液中存在水，所产生的碘就会和水以1:1的关系按照化学反应式进行反应。当所有的水都参与了化学反应，过量的碘就会在电极的阳极区域形成，反应终止。容量法测定的碘是作为滴定剂加入的，滴定剂中碘的浓度是已知的，根据消耗滴定剂的体积，计算消耗碘的量，从而计量出被测物质水的含量。19试剂和材料卡尔•费休试剂、无水甲醇（CH4O）：优级纯卡尔•费休水分测定仪、天平（感量为0.1mg）、21分析步骤21.1卡尔•费休试剂的标定（容量法）在反应瓶中加一定体积（浸没铂电极）的甲醇，在搅拌下用卡尔•费休试剂滴定至终点。加入10mg水（精确至0.0001g)，滴定至终点并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 卡尔•费休试剂的用量（V）。卡尔•费休试剂的滴定度按式（3）计算：T=M/V(3)式中：T——卡尔·费休试剂的滴定度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；M——水的质量，单位为毫克（mg）；V——滴定水消耗的卡尔·费休试剂的用量，单位为毫升（mL）。21.2试样前处理可粉碎的固体试样要尽量粉碎，使之均匀。不易粉碎的试样可切碎。21.3试样中水分的测定于反应瓶中加一定体积的甲醇或卡尔·费休测定仪中规定的溶剂浸没铂电极，在搅拌下用卡尔·费休试剂滴定至终点。迅速将易溶于上述溶剂的试样直接加入滴定杯中；对于不易溶解的试样，应采用对滴定杯进行加热或加入已测定水分的其他溶剂辅助溶解后用卡尔•费休试剂滴定至终点。建议采用库仑法测定试样中的含水量应大于10g，容量法应大于100g。对于某些需要较长时间滴定的试样，需要扣除其漂移量。21.4漂移量的测定在滴定杯中加入与测定样品一致的溶剂，并滴定至终点，放置不少于10min后再滴定至终点，两次滴定之间的单位时间内的体积变化即为漂移量（D）。22分析结果的表述固体试样中水分的含量按式（4），液体试样中水分的含量按式（5）进行计算。X=100(V1-D×t)×T/M（4）X=100(V1-D×t)×T/(V2ρ)（5）式中：X——试样中水分的含量，单位为克每百克（g/100g）；V1——滴定样品时卡尔•费休试剂体积，单位为毫升（mL）；T——卡尔•费休试剂的滴定度，单位为克每毫升（g/mL）；M——样品质量，单位为克（g）；V2——液体样品体积，单位为毫升（mL）；D——漂移量，单位为毫升每分钟（mL/min）；t——滴定时所消耗的时间，单位为分钟（min）；ρ——液体样品的密度，单位为克每毫升（g/mL)。水分含量≥1g/100g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量<1g/100g时，计算结果保留两位有效数字。23精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二章食盐的测定执行标准GB5009.40酱卫生标准的分析方法1试剂硝酸银标准溶液〔C(AgNO3)=0.1000mol/l〕：按GB601规定配制铬酸钾指示剂（50g/l）：称取5g铬酸钾用少量水溶解后定容至100ml。2分析步骤称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸馏水50ml充分搅拌（必要时加热），移入100ml容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。吸取2.0ml稀释液于200ml锥形瓶中，加100ml水及1ml铬酸钾溶液（50g/l），混匀，用硝酸银标准溶液（0.1000mol/l）滴定至初显桔红色。量取100ml水，同时做试剂空白试验。3计算X=100×（V1-V2）×C×0.0585×100/（5×2）式中：X——样品中食盐（以NaCl计）含量，g/100mlC——硝酸银标准溶液实际浓度，mol/l；V1——测定用试样稀释液消耗硝酸银标准溶液的体积，ml；V2——试剂空白消耗用硝酸银标准溶液的体积，ml；0.0585——与1.00ml硝酸银标准滴定溶液C(AgNO3)=1.000mol/l〕相当的氯化钠的重量，g；4精密度在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第三章氨基酸态氮的测定执行标准GB5009.40酱卫生标准的分析方法第一法甲醛值法1 原理利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。2 试剂甲醛（36%）：应不含聚合物、氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=0.050mol/l]3 仪器酸度计、磁力搅拌器、10ml微量滴定管4 分析步骤称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸馏水50ml充分搅拌（必要时加热），移入100ml容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。吸取10.0ml，置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=0.050mol/l]滴定至酸度计指示pH8.2，记下消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量。加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至PH9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时取80ml水，先用氢氧化钠标准溶液调节至PH为8.2，在加入10.0ml甲醛溶液，用氢氧化钠标准溶液滴定至PH9.2，同时做试剂空白试验。5 结果计算试验中氨基酸态氮的含量按下式进行计算。X=100×（V1-V2）×C×0.014×100/（5×V3）式中：X——试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每百毫升（g/100ml）；V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（ml）V2——试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）V3——试样稀释液取用量，单位为毫升（ml）C——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为莫尔每升（mol/l）0.014——与1.00ml氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=1.000mol/l]相当的氮的质量，单位为克（g）计算结果保留两位有效数字。6精密度在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第四章总酸的测定执行标准GB5009.40酱卫生标准的分析方法1原理酱油中含有多种有机酸，用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计测定终点，结果以乳酸表示。2试剂氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=0.050mol/l]3仪器酸度计、磁力搅拌器、10ml微量滴定管4 分析步骤称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸馏水50ml充分搅拌（必要时加热），移入100ml容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。吸取10.0ml上述稀释液，置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=0.050mol/l]滴定至酸度计指示pH8.2，记下消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量。称取70ml水，同时做试剂空白试验。5 结果计算试验中总酸的含量按下式进行计算。X=100×（V1-V2）×C×0.090×100/（5×V3）式中：X——试样中总酸的含量（以乳酸计），单位为克每百毫升（g/100ml）；V1——测定用试样稀释液消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（ml）V2——试剂空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）V3——试样稀释液取用量，单位为毫升（ml）C——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为莫尔每升（mol/l）0.090——与1.00ml氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=1.000mol/l]相当的乳酸的质量，单位为克（g）计算结果保留三位有效数字。6精密度在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第五章过氧化值的测定执行标准：GB/T5009.37—2003食用植物油卫生标准的分析方法1原理油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。2试剂饱和碘化钾溶液：称取14g碘化钾，加水10ml溶解，必要时微热使其溶解，冷却后贮于棕色瓶中。三氯甲烷-冰乙酸混合液：两取40ml三氯甲烷，加60ml冰乙酸，混匀。硫代硫酸钠标准滴定溶液0.0020mol/l。淀粉指示剂（10g/l）：称取可溶性淀粉0.50g，加少许水调成糊状，倒入50ml沸水中调匀，煮沸。临用时现配。3分析步骤称取2.00—3.00g混匀（必要时过滤）的试样，置于250ml碘量瓶中，加30ml三氯甲烷-冰乙酸混合液，使试样完全溶解。加入1.00ml饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5min，然后在暗处放置3min。取出加100ml水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定，至淡黄色时，加1ml淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点，取相同量三氯甲烷-冰乙酸溶液、碘化钾溶液、水，按同一方法，做试剂空白试验。4计算结果试样的过氧化值按下式进行计算。X1=(V1-V2)×C×0.1269×100/mX2=X1×78.8式中：X1——试样的过氧化值，单位为克每克（g/100g）；X2——试样的过氧化值，单位为毫克当量每千克（meq/kg）；V1——试样消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）;V2——试剂空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）；C——硫代硫酸钠标准滴定的实际浓度，单位为莫尔每升（mol/l）；m——试样质量，单位为克（g）；0.1269——与1.0ml硫代硫酸钠标准滴定溶液[c=1.000mol/l]相当的碘的质量，单位为克（g）；78.8——换算因子计算结果保留两位有效数字。5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第六章还原糖的测定执行GB/T5009.7—2008食品中还原糖的测定1试剂碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜15g及次甲基蓝0.05g溶解于1000ml蒸馏水中；碱性酒石酸铜乙液：称取酒石酸钾钠50g，氢氧化钠75g及亚铁氰化钾4g溶解于1000ml蒸馏水中；葡萄糖标准溶液：1g/l。准确称取在100℃烘箱中烘至恒重的无水葡萄糖1.0000g放入100ml烧杯中，用蒸馏水溶解后倒入1000ml容量的瓶中，用蒸馏水反复冲洗烧杯，洗液一并倒入容量瓶，加浓盐酸5ml，用蒸馏水稀释至刻度。乙酸锌溶液（219g/l）：称取21.9g乙酸锌，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml。亚铁氰化钾溶液（106g/l）：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100ml。盐酸溶液（1:1）：量取50ml盐酸，加水稀释至100ml。2样品处理样品经切碎、研磨、混合均匀后，称取2.500g～5.000g，放入250ml容量瓶中，加入蒸馏水50ml，慢慢加入5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。3操作3.1标定碱性酒石酸铜溶液取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00ml于150ml锥形瓶中，加入10ml蒸馏水，加入玻璃珠两粒，用糖滴管加入9ml左右1g/l葡萄糖标准溶液，摇均后加热（电炉应预热15min后使用），使其在2min内沸腾。沸腾30s后，以一滴/2s（空白滴定，预备滴定，正式滴定的速度均应保持一致）的速度匀速滴入1g/l葡萄糖液，至蓝紫色消失即为终点。溶液沸腾后标准糖液的耗用量应控制在0.5ml～1ml之内，否则应重做。记录沸腾前后共耗用标准糖液的毫升数。同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml（甲、乙液各5ml）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）（也可按上述方法标定4—20ml碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）来适应试样中还原糖的浓度变化）3.2试样溶液的预备滴定取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00ml于150ml锥形瓶中，加入10ml蒸馏水，加入玻璃珠两粒，摇均后加热（电炉应预热15min后使用），使其在2min内沸腾。保持沸腾以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以一滴/2s（空白滴定，预备滴定，正式滴定的速度均应保持一致）的速度匀速滴定，直至蓝色消失即为终点。记录样液消耗的体积。当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约10ml左右，结果按式（1）计算。当浓度过低时则采取直接加入10ml样品液，免去加水10ml，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10ml样液中所含还原糖的量，结果按式（2）计算。3.3试样溶液的正式滴定取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00ml于150ml锥形瓶中，加入10ml蒸馏水，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的试样溶液至锥形瓶中，使在2min内加入至沸，保持沸腾继续以1滴/2S的速度滴定，直至蓝色消失即为终点，记录样液消耗的体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积。4计算试样中还原糖的含量按（1）式进行计算：X=100m1/(m×V/250×1000)（1）式中：X——样品中还原糖的含量，g/100g；m1——碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于还原糖的质量，mg；m——试样质量，g；V——测定时平均消耗试样溶液的体积，ml；当浓度过低时试样中还原糖的含量按式（2）进行计算：X=100m2/(m×10/250×1000)（2）式中：X——样品中还原糖的含量，g/100g；m2——标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于某种还原糖的质量，mg；m——试样质量，g；还原糖含量≥10g/100g时计算结果保留三位有效数字；还原糖含量≤10g/100g时计算结果保留两位有效数字。第七章大肠菌群的检测执行标准：GB4789.3—2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱（36℃±1℃）、冰箱（2℃～5℃）、恒温水浴箱（46±1℃）、天平（感量0.1g）、均质器、振荡器、无菌吸管[1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头]、无菌锥形瓶（容量500mL）、无菌培养皿（直径90mm）、pH计或pH比色管或精密pH试纸、菌落计数器2培养基和试剂2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。2.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。2.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。2.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。2.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。2.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。2.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。第一法大肠菌群MPN计数法3检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。图1大肠菌群MPN计数法检验程序6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第二法大肠菌群平板计数法7检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。8操作步骤8.1样品的稀释按6.1进行。8.2平板计数图2大肠菌群平板计数法检验程序8.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。8.3平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。8.4证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌绿水溶液13.3mL蒸馏水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15g～18g蒸馏水1000mLpH7.4±0.1A.3.2制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷却至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。A.4磷酸盐缓冲液A.4.1成分磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500mLpH7.2A.4.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.5无菌生理盐水A.5.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.5.2制法称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.61mol/LNaOHA.6.1成分NaOH40.0g蒸馏水1000mLA.6.2制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.71mol/LHClA.7.1成分HCl90mL蒸馏水1000mLA.7.2制法移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。附录B（规范性附录）大肠菌群最可能数（MPN）检索表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表第八章菌落总数的测定执行标准：GB4789.2—2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱（36℃±1℃，30℃±1℃）、冰箱（2℃～5℃）、恒温水浴箱（46±1℃）、天平（感量为0.1g）、均质器、振荡器、无菌吸管[1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头]、无菌锥形瓶（容量250mL、500mL）、无菌培养皿（直径90mm）、pH计或pH比色管或精密pH试纸、放大镜或/和菌落计数器2培养基和试剂2.1平板计数琼脂培养基：见附录A中A.1。2.2磷酸盐缓冲液：见附录A中A.2。2.3无菌生理盐水：见附录A中A.3。3检验程序菌落总数的检验程序见图1。图1菌落总数的检验程序4操作步骤4.1样品的稀释4.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。4.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。4.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。4.1.4按6.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。4.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。4.1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46±1℃℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。4.2培养4.2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃℃培养48h±2h。水产品30±1℃℃培养72h±3h。4.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。4.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。4.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。4.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。4.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5结果与报告5.1菌落总数的计算方法5.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。5.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=∑C/[(n1+0.1n2)d]（1）式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数（CFU）232,24433,35N=∑C/[(n1+0.1n2)d]=(232+244+33+35)/{[2+(0.1×2)]×10-2}=544/0.022=24727上述数据按7.2.2数字修约后，标示为25000或2.5×1045.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。5.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。5.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.2菌落总数的报告5.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。5.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。5.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。5.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1平板计数琼脂（platecountagar，PCA）培养基A.1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.0±0.2A.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。A.2磷酸盐缓冲液A.2.1成分磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500mLpH7.2A.2.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.2磷酸盐缓冲液A.2.1成分磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500mLpH7.2A.2.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.3无菌生理盐水A.3.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.3.2制法称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。