啤酒发酵论文发酵工艺论文

酿酒科技 2010 年第 10 期（总第 196 期）·LIQUOR－MAKING SCIENCE ＆ TECHNOLOGY 2010 No．10(Tol．196) 酿酒酵母麦芽汁糖代谢与啤酒发酵度研究 收稿日期：2010－07－21 作者简介：王士安（1980-），男，助理研究员，博士，主要从事酵母菌资源和生理代谢研究。 通讯作者：李福利，Tel/Fax: +86-532-80662655, E-mail: lifl@qibebt.ac.cn。 王士安 1，胡 南 1，2，张坤迪 1，李福利 1 （1.中科院青岛生物能源与过程研究所，山东 青岛 266101；2.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109） 摘 要： 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖是麦芽汁中的主要可发酵糖分。测试 31株果实来源酿酒酵母菌株 和工业菌株对这些糖分的代谢能力，分析其对啤酒发酵度的影响。试验结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，所有供试菌株都能快速代谢葡萄 糖、果糖和蔗糖，都不能代谢麦芽三糖，而菌株同化和发酵麦芽糖的能力存在明显差异，差异系数分别为 39.4 %和 33.9 %；菌株的麦芽糖同化和发酵能力与真正发酵度存在强相关性，相关系数分别为 0.84和 0.80；果实来源菌株的 总体麦芽糖同化、发酵能力及真正发酵度显著低于工业菌株（P＜0.01）。选用工业菌种过程进行麦芽糖代谢鉴定是 快速筛选高发酵度菌株的有效途径。 关键词： 酿酒酵母； 低糖啤酒； 发酵度； 麦芽糖； 麦芽三糖 中图分类号：TS261.1；TS262.5；TS261.4 文献标识码：A 文章编号：1001－9286（2010）10－0044－04 低糖啤酒符合现代健康饮食趋势， 具有广阔的市场 前景。低糖啤酒 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 残留糖分低于 1.8 % (w/v)，发酵度高 于 72 %。 通过控制糖化 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 提高麦汁中可发酵糖的比 例，采用合理的发酵条件以及使用高发酵度菌株，都可以 提高啤酒发酵度[1-2]。 本研究关注菌株糖代谢对啤酒发酵 度的影响。 啤酒发酵原料麦芽汁所含的主要可发酵糖类包括麦 芽糖、麦芽三糖、葡萄糖、果糖和蔗糖，高效发酵要求这些 糖被迅速并且彻底利用 [1]。 酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）是应用最普遍的啤酒生产菌种，其麦芽三糖代 谢能力差， 啤酒发酵过程中该糖不能被有效利用是成品 啤酒残糖含量过高、真实发酵度低的主要原因之一[4]。 除 此之外，碳源同化和发酵研究发现，即使工业酿酒酵母菌 株也可能不具备同化和发酵麦芽糖和蔗糖的能力 [5]。 由 于不同菌株存在此类代谢差异， 分析不同来源酿酒酵母 菌株发酵麦芽汁糖分的能力有助于高发酵度菌株筛选。 测试了 31 株果实来源酿酒酵母菌株和工业菌株的麦芽 汁糖分代谢能力，分析其对啤酒发酵度的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 Study on the Correlations between Wort Glycometabolism by Saccharomyces cerevisiae and Beer Fermentation Degree WANG Shi-an1, HU Nan2, ZHANG Kun-di1 and LI Fu-li1 (1.Qingdao Research Institute of Bioenergy and Bioprocessing Technology of CAS, Qingdao, Shandong 266101; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China) Abstract: Glucose, fructose, sucrose, maltose, and maltotriose are the main fermentable carbohydrate in wort. In this study, wort glycometabolism by 31 Saccharomyces cerevisiae strains including fruit strains and industrial strains was observed and their effects on beer fermentation degree were investigated. The results were as follows: 1. Fast metabolism of glucose, fructose and sucrose could be achieved by all tested strains, however, the metabolism of maltotriose could be achieved by none of them, and there was significant difference in maltose assimilation and in maltose fermentation for different S.cerevisiae strains, coefficients of variation were as 39.4 % and 33.9 % respectively; 2. There was strong correlations between maltose-assimilating and maltose-fermenting capability of S.cerevisiae strains and real degree of fermentation (RDF) of beer, the correlation coefficients were 0.84 and 0.80 respectively; 3. The maltose-assimilating and maltose-fermenting capability of fruit S.cerevisiae strains was evidently weaker than that of industrial S.cerevisiae strains, besides, RDF was also lower for fruit S.cerevisiae strains (P<0.01) . The study suggested that maltose metabolism identification was an effective approach for rapid selection of proper industrial S.cerevisiae strains with high beer fermentation degree. Key words: Saccharomyces cerevisiae; low-carbohydrate beer; fermentation degree; maltose; maltotriose 44 1.1.1 菌株 供试菌株 31 株（见表 1），经核糖体基因 26S rDNA D1/D2 区序列分析鉴定， 皆为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 1.1.2 培养基 YPM培养基： 用于菌株活化， 培养基组成为 Yeast extract 1 %，Peptone 2 %，Maltose 2 %。 碳源同化测试培养基 ：YNB (Yeast nitrogen base, Difco 239210) 67 g/L和不同碳源 50 g/L配成 10倍母液， 过滤除菌， 吸取 400 μL母液加入装有 3.6 mL无菌水的 试管，制成碳源同化管[4]。 碳源发酵测试培养基： 将 0.5 %酵母提取物（Yeast extract）3.6 mL分装于试管，放入 Durham 小管，灭菌，然 后滴加 400 μL过滤除菌的 20 % 的碳源母液，制成发酵 管[4]。 啤酒发酵种子培养基：11 莓P 麦芽汁， 色度 7.4，pH 5.56，还原糖 8.5 % (w/v)，糖∶非糖 =1∶0.38。 啤酒发酵培养基：11 莓P麦芽汁， 参数同啤酒发酵种 子培养基，接种前调 pH至 5.6。 1.2 方法 1.2.1 碳源同化和发酵测试 碳源同化测试： 刮一接种环固体斜面活化的新鲜菌 体，分散于 1 mL 无菌水中，滴 40 μL 于碳源同化管中， 25℃静止培养；观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 结果 2 周，第 1 周每天观察，第 2 周隔天观察；在一张白纸上划一条宽度为 3/4 mm 的黑 线，摇动同化管，使菌体充分悬浮，将白纸贴近试管，透过 试管观察黑线， 如果黑线清晰可见， 表明无法同化该碳 源，结果记录为“－”，如果黑线模糊或者完全看不见，表 明可以同化该碳源，记录为“+”。 发酵测试：制备菌悬液、接种方法、培养方式及观察 时间同碳源同化测试， 视气 体充满 Durham 小管情况记 录结果， 无气体进入表明不 发酵该碳源，记录为“－”，有 气体进入的管按照实际充满 比例记录。 每次测试做 2 个 平行管，实验重复 1次。 1.2.2 啤酒发酵条件 接种 YPM 培养基 ，于 25℃，180 r/min， 振荡 16 h； 然后取 100μL活化菌液接入 装有 50mL麦芽汁的 250mL 三角瓶，25℃，180 r/min、振荡 48 h， 用血球计数板计酵母 细胞数， 离心做成细胞泥； 250 mL三角瓶装 200 mL麦芽汁，115℃灭菌 15 min，从 中取 5 mL麦芽汁重悬细胞泥， 吸取适量悬液接种于原 三角瓶中，使最终细胞浓度为 1×106 cells/mL/ 莓P；发酵条 件为先 11℃发酵 7 d，然后 8℃发酵 7 d。 1.2.3 啤酒指标测定 酒精度：使用生物传感仪 SBA-40C（济南）测定酒精 度，标准样品浓度 1 g/L。 真正发酵度：依据发酵液除去 CO2和酒精后测得的 残留浓度计算得到的发酵度为真正发酵度， 是描述啤酒 发酵度的指标之一，准确度高。本文以此指标反映啤酒发 酵度，首先应用密度瓶法测定试样的真正浓度，然后应用 国家标准 GB/T 4928—2008 （p14）中的公式计算真正发 酵度。 还原糖：应用 DNS 法测定啤酒还原糖，用葡萄糖溶 液做标准曲线。 2 结果与分析 2.1 碳源同化 供试菌株对麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖、果糖和蔗糖 的同化实验结果表明， 所有菌株在 24 h 内迅速利用葡 萄糖、果糖和蔗糖，结果都记录为“+”；所有菌株在 14 d 内同化麦芽三糖的结果都为 “－”， 表明都不利用该 糖； 供试菌株同化麦芽糖的能力存在明显差异 （见表 2）， 差异系数 CVA= 39.4 %，XL14-1 和 BL8 2 周内未 同化麦芽糖， 其他菌株都能同化麦芽糖， 所需时间从 24 h 到13 d不等。 2.2 碳源发酵 供试菌株对麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖、果糖和蔗糖 的发酵实验结果类似于同化实验。其结果为：所有菌株能 王士安，胡 南，张坤迪，李福利·酿酒酵母麦芽汁糖代谢与啤酒发酵度研究 45 酿酒科技 2010 年第 10 期（总第 196 期）·LIQUOR－MAKING SCIENCE ＆ TECHNOLOGY 2010 No．10(Tol．196) 快速发酵葡萄糖、 果糖和蔗糖，24 h 内气体完全充满 Durham 小管； 所有菌株在 14 d 内都不能发酵麦芽三糖 产气； 供试菌株发酵麦芽糖的能力存在明显差异 （见表 2），差异系数 CVF= 33.9 %，菌株 P10-1 在 2 周内未发酵 麦芽糖产气， 其他菌株产气充满 Durham 小管的时间从 24 h到 13 d不等。 2.3 真正发酵度 发酵样品的酒精度和真正发酵度差异明显 （见表 2）。 表 2表明，11个样品的酒精度小于 1 g/100 mL，且真 正发酵度小于 15 %；样品的最大酒精度为 4.2 g/100 mL， 最大真正发酵度为 65.3 %，而同等发酵条件下某商业纯 生啤酒菌株 LTB 发酵样品的真正发酵度只有 42 %。 DNS法测得原料麦芽汁的还原糖含量为 8.5 %， 而发酵 后的样品 SH28-1 和 XL14-1 的还原糖含量分别等于和 超过这个值，达到 8.5 %和 8.7 %，其他样品的还原糖含 量都小于 8.5 %。 2.4 真正发酵度与菌株碳源代谢 所有供试菌株都能同化和发酵葡萄糖、果糖和蔗糖， 不能同化和发酵麦芽三糖， 表明这 4种糖的代谢对所有 供试菌株真正发酵度的影响是相似的。 而供试菌株对麦 芽糖的同化和发酵能力不同， 分析其与啤酒发酵度的关 系发现， 菌株对麦芽糖的同化和发酵能力与啤酒发酵度 有很强的相关性， 相关系数分别为 rA= 0.84 和 rF= 0.80， 即同化和发酵麦芽糖耗时短的菌株其啤酒发酵度高 （见 图 1）。 2.5 菌株来源与碳源代谢 供试菌株包含 17 株果实来源菌株和 14 株工业菌 株，果实来源菌株于 2006 年分离自不同果园，工业菌株 主要与酒精饮品生产相关（见表 1）。 果实来源菌株中有 10 个发酵样品的酒精度和发酵度很低，而工业菌株只有 1个样品（AS2.24）显示了低酒精度和发酵度（见表 2）。统 计分析显示，果实来源菌株的总体麦芽糖同化、发酵能力 及啤酒发酵度显著低于工业菌株（P＜0.01）。果实来源菌 株的麦芽汁糖代谢能力与地理分布和生态来源并无密切 关联， 无论不同地理来源还是不同生态来源的菌株都可 以存在相似的麦芽汁糖代谢能力， 而且即使地理来源和 基物来源都相同的菌株也可以存在明显的麦芽糖代谢差 异，如 SH26-1 和 SH28-1, P10-1 和 P11，BL8 和 BL11C （表 1、表 2）。 3 讨论 对麦芽汁中主要可发酵糖进行同化和发酵测试，分 析影响啤酒发酵度的菌株碳源代谢因素， 探索获得高发 酵度菌株的途径。 研究结果表明，葡萄糖、果糖和蔗糖的 发酵不是影响啤酒发酵度的因素， 而占麦芽汁可发酵糖 分比例最高的麦芽糖和麦芽三糖是重要的影响因素。 有 研究报道麦芽三糖代谢对啤酒发酵度的影响[3， 6-8]。 本研 究发现， 不同酿酒酵母菌株的麦芽糖代谢能力存在明显 图 1 菌株麦芽糖代谢与啤酒发酵度的相关性 46 [14] C.W. Bamforth, A critical control point analysis for flavor stability of beer [J]. Tech.Q Master Brew Assoc Am, 2004, 41(2)：97-103. [15] S.P. Clarkson P.J., Large P.K., and C.W. Bamforth, Oxygen radicals-their influence on process performance and product quality[C]. In: Proc 22th Congr Eur Brew Conv, Oxford: IRL Press, UK, 1989， 25：267-274. [16] Bamforth C.W., Muller R.E. and Walker M.D., Oxygen and oxygen radicals in malting and brewing: a review [J]. J Am Soc Brew Chem, 1993，51(3)：79-88. [17] M. Uchida and M. Ono, Determination of hydrogen peroxide in beer and its role in beer oxidation [J]. J Am Soc Brew Chem, 1999, 57(4)：45-150. [18] Zufall C. and Th. Tyrell, The influence of heavy metal ions on beer flavor stability [J]. J Inst Brew, 2008, 114(2)：134-142. [19] Kaneda H., Kobayashi N., Furusho S., et al, Reducing activity and flavor stability of bee[J]. Tech.Q Master Brew Assoc Am, 1995(32)：90-94. 差异，并且对啤酒发酵度影响显著，这表明菌株的麦芽糖 代谢能力可以作为发酵度的表征之一， 要选择啤酒发酵 度高的生产菌株，可先测试菌株的麦芽糖代谢能力，可以 减小工作量。 对果实来源菌株和工业菌株的比较分析显示， 两类 菌株的麦芽糖代谢能力显著不同（p＜0.01），大多数果实 来源菌株不适合啤酒生产， 而工业菌株的啤酒发酵性能 较好。这可能归因于菌株的不同适应进化过程。本研究供 试工业菌株大多与酒精产生相关， 而且包含了 5 株啤酒 生产酵母，而果实来源菌株分离自果园。工业酿酒酵母菌 株往往经历了育种工作者的定向选育和较长的工业环境 适应， 而大多数果实来源菌株所处的微环境不同于工业 环境，缺乏适应过程。供试果实来源菌株中也存在少数啤 酒发酵性能较好的菌株（见表 2），但比例低，说明选择非 工业菌株用于啤酒生产， 需要对一定数量的菌株进行筛 选。 本研究中所有供试菌株都不能同化和发酵麦芽三 糖，而麦芽三糖在麦芽汁中的含量仅次于麦芽糖，通常占 可发酵糖的 15 %～20 %，提高其代谢能力有利于提高啤 酒发酵度。已报道的研究表明，酿酒酵母细胞内的麦芽糖 水解酶能有效水解麦芽三糖， 而负责其转运的透性酶亲 和力低，跨膜转运是其发酵的限速步骤[6，7， 9]。 通过基因工 程方法， 增强 AGT1透性酶的表达可以提高酿酒酵母的 麦芽三糖发酵能力[3，10]。 另外，有研究对巴斯德酿酒酵母 （Saccharomyces pastorianus）进行紫外诱变筛选，获得了 发酵度提高的突变体 [11]，用类似方法提高酿酒酵母麦芽 三糖发酵能力值得尝试。 致谢：感谢中国科学院微生物研究所白逢彦研究员赠予研究 菌株，感谢山东科技大学郑艳琳老师在数据统计分析方面的帮助。 参考文献： [1] 刘志伟.控制发酵度、稳定啤酒风格[J].酿酒科技，2006, 143 (5)：72-75. [2] 王志坚.影响啤酒发酵度因素及提高发酵度的途径[J].山东食 品发酵，2006, 140 (1)：23-26. [3] Stambuk BU, Alves SL, Hollatz C, et al. Improvement of mal- totriose fermentation by Saccharomyces cerevisiae[J]. Letters in Applied Microbiology, 2006, 43：370-376. [4] Bai FY, Jia JH. Electrophoretic karyotype comparison of the Saccharomyces cerevisiae strains with different carbon com- pound utilization patterns [J]. Mycosystema, 2000, 19：65-71. [5] Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identifica- tion of yeasts. In The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th edn, 77-100. Edited by C. P. Kurtzman & J. W. Fell [M]. Amsterdam： Elsevier, 1998. [6] Zastrow CR, Hollatz C, de Araujo PS, et al. Maltotriose fermen- tation by Saccharomyces cerevisiae[J]. J Ind Microbiol Biotec- hnol, 2001, 27：34-38. [7] Alves-Jr SL, Herberts RA, Hollatz C, et al. Maltose and mal- totriose active transport and fermentation by Saccharomyces cerevisiae reveals a determinant role for the AGT1 permease [J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74：1494-1501. [8] Donalies UEB, Nguyen HTT, Stahl U, et al. Improvement of Saccharomyces yeast strains used in brewing, wine making and baking [J]. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechno- logy, 2008, 111：67-98. [9] Day RE, Rogers PJ, Dawes IW, et al. Molecular analysis of mal- totriose transport and utilization by Saccharomyces cerevisiae [J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68：5326-5335. [10] Vidgren V, Huuskonen A, Virtanen H, et al. Improved fermen- tation performance of a lager yeast after repair of its AGT1 maltose and maltotriose transporter genes [J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75：2333-2345. [11] Blieck L, Toye G, Dumortier F, et al. Isolation and characteri- zation of brewer's yeast variants with improved fermentation performance under high-gravity conditions [J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73：815-824. ------------------------------------------------- （上接第 43页） 王士安，胡 南，张坤迪，李福利·酿酒酵母麦芽汁糖代谢与啤酒发酵度研究 47