基于OPA反应的水解度测定方法DennisPetersenPerMunkNielsen及ClausDambmann基于OPA反应的水解度（DH）测定方法1．定义：水解度（DH）的定义是被水解的肽键数的百分比。DH＝水解的肽键数＊100%＝h*100%总肽键数htothtot取决于原料的类型。h则是丝氨酸氨基毫摩数的函数。h=(serine-NH2－β)/αmmol/gprotein对于大多数食物蛋白而言，氨基酸的平均分子量是125g/mol，则htot约为8，也即每Kg蛋白约含有8摩的肽键。一些常见的蛋白质的α、β和htot值见表1。2．原理：每水解一个肽键便会释放出一个游离胺基。游离胺基与OPA（邻苯二甲醛）反应形成一种黄色络合物。可用分光光度计在340nm下测量其吸光度。3．设备:A.1容量瓶（100mL,200mL,500mL）A.2试管（10mL）B.分析天平，精确至小数点后四位C.磁力搅拌器D.分光光度计，可以在340nm下工作4．试剂:OPA试剂：A.1将7.620g四硼酸钠和200mgSDS用150mL去离子水溶解。必须在完全溶解后再加入其他试剂A.2用4mL乙醇溶解160mg邻苯二甲醛97%（OPA）并将此OPA溶液全部移入A.1，用去离子水冲洗。A.3向A.1中加入176mgDTT（99%），用去离子水冲洗。A.4定容至200mLA.5该试剂对光敏感，应在配制当日使用。丝氨酸标准样品：B.1称50mg丝氨酸（MerckArt.7769）溶于500mL去离子水（0.9516毫摩/升）B.2标准溶液可以在5℃下贮存3周。样品溶液：B.用去离子水溶解Xg样品，定容至100mL(0.25-2.5毫摩氨基氮/升）。样品中蛋白含量在80%－8%时，X为0.1g-1.0g。具体的样品参考称量值见表2。5．实验步骤:在340nm下测定吸光度值，以去离子水作参比。A.每个试管中分别加入3mLOPA。测定一个样品所需试管如下：标准4个空白4个样品2＊2个每个样品需测定两次，因此需4个试管。B.标准样品测定：向装有3mLOPA的试管中加入400uL丝氨酸标准样品，振荡混匀，精确反应2min后在340nm下测定其吸光度。在测定空白和样品之前测定两次标准样品的吸光度，在所有空白和样品测定之后再测定两次标样的吸光度，计算时取四次测定的平均值。C.空白样测定D.样品测定：向装有3mLOPA的试管中加入400uL去离子水，振荡混匀，精确反应2min后在340nm下测定其吸光度。样品测定两次取平均值。注：因为吸光度随时间会发生变化，所以应确保在精确反应2min后进行测定。参考值:标样：OD≈0.8空白：OD≈0.076．结果计算:A.h的测定SerineNH2=ODsample-ODblank*0.9516meqv/L*0.1*100L/gproteinODstand-ODblankX*P式中：SerineNH2：毫摩serineNH2/g蛋白X：样品重量P：样品中的蛋白含量0.1：样品体积转换成L则h按下式计算：h=(SerineNH2–β)/αmmol/gproteinα、β值见表1。B.计算DHDH＝h*100%htot式中不同种类的蛋白htot值见表1。表1.不同来源蛋白质的α、β及htot值蛋白αβhtot大豆0.9700.3427.8面筋1.000.408.3酪蛋白1.0390.3838.2乳清1.000.408.8明胶0.7960.45711.1肉1.000.407.6鱼1.000.408.6表2.不同蛋白含量及水解度的样品称样参考值1%蛋白8%蛋白80%蛋白预期DH%mg/100mLmg/100mLmg/100mL10120001500150158000100010020520065065254240530533033604204235296037037402720340344522402802850200025025551760220226015201901965128016016
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