gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, June 25; 24(6): 1010-1015 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved Received: January 15, 2008; Accepted: March 12, 2008 Supported by: the National 973 Program of China (No. 2003CB716000). Corresponding author: Lin Xu. E-mail: xulin@njut.edu.cn 国家 973 项目(No. 2003CB716000) 资助。 研究 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母 刘红梅, 许琳, 严明, 来灿钢, 欧阳平凯 南京工业大学制药与生命科学学院, 材料化学 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 国家重点实验室, 南京 210009 摘 要: 利用全转录工程（gTME）方法将全局转录因子 spt15 随机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接到 表达载体 pYX212 上, 醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母 YPH499 中, 经特定的培养基初筛获得高效利用木糖并 共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株。对获得的重组菌株进行了初步研究, 该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木 糖和葡萄糖。在 30oC, 200 r/min, 发酵 96 h 时, 50 g/L 木糖和葡萄糖的利用率为 94.0%和 98.9%, 乙醇产率为 32.4%和 31.6%, 原始菌株乙醇产率为 44.3%; 当木糖和葡萄糖以质量比 1:1 混合发酵时, 木糖和葡萄糖利用率分别为 91.7%和 85.9%, 乙醇产率为 26%。木糖醇的含量极低。 关键词 : 全转录工程（gTME） , 重组酵母菌 , 木糖 , 共发酵 gTME for Construction of Recombinant Yeast Co-fermenting Xylose and Glucose Hongmei Liu, Lin Xu, Ming Yan, Cangang Lai, and Pingkai Ouyang State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Life Science and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China Abstract: Global transcription machinery engineering (gTME) was employed to engineer xylose metabolism. Mutation of the transcription factor gene Spt15 was introduced by error-prone PCR, followed by screening on media using xylose as the sole carbon source. One recombinant strain growing well on such media was chosen for further research. This strain showed modest growth rates in the media containing 50 g/L xylose or glucose at the condition of 30oC, 200 r/min, 96 h, 94.0% and 98.9% of xylose and glucose were consumed, with the ethanol yield were 32.4% and 31.6%, respectively. The control strain had the ethanol yield of 44.3% under the glucose concentration of 50 g/L. When the carbon source was 50 g/L glucose/xylose (1:1), the utilization ratio of xylose and glucose was 91.7% and 85.9%, with the ethanol yield was 26%. Xylose was eventually exhausted. Concentration of the by-product xylitol was very low. Keywords: global transcription machinery engineering (gTME), recombinant yeast, xylose, co-ferment 以生物质为原料制取的工业乙醇, 作为一种清 洁的可再生能源, 是替代石油等化石燃料的必然趋 势, 已被纳入许多国家的发展战略规划。传统的生 物乙醇生产主要以粮食发酵为主, 世界粮食紧缺现 象严重限制了原料来源。木质纤维素是世界上最为 丰富的生物质资源, 量最大、价最廉, 每年的总产量 刘红梅等: gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母 1011 Journals.im.ac.cn 约占所有生物质资源的 50%。木质纤维素的水解产 物中,单糖的组成是葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖 和阿拉伯糖 [1], 其中约 2/3 为六碳糖 , 1/3 为五碳 糖[2]。充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产 乙醇, 能使乙醇的产量在原有基础上增加 25%。 酿酒酵母(S. cerevisiae)是真核微生物, 细胞壁 厚、固醇含量高, 对乙醇及木质纤维素水解物中毒 性因子的耐受性较高[3]; 能在低 pH、严格厌氧条件 下快速发酵葡萄糖生产乙醇, 副产物少; 不易被细 菌和病毒污染, 且相关工业技术成熟。酿酒酵母全 基因组测序已完成 [4], 是迄今为止研究最透彻的真 核微生物, 可利用生物信息学的方法和手段, 以及 日趋完善的分子生物学技术, 对其进行基因操作和 代谢网络的重构。是乙醇发酵的研究重点和首要目 标微生物。 酿酒酵母拥有可以代谢木糖的各种酶, 但是天然酿酒酵母几乎不表达关键酶, 因此不能有 效利用木糖发酵生产乙醇。 近年来, 国内外许多研究者都致力于构建能代 谢五碳糖和六碳糖的高效产乙醇的基因重组菌。思 路包括两方面: 一类是将酿酒酵母与其它可代谢木 糖的酵母进行细胞融合 [5], 筛选出可以代谢木糖的 融合子; 另一类是利用基因工程手段转化携带木糖 外源基因的质粒到酿酒酵母当中, 从而获得一种可 以以混合糖为原料产乙醇的基因工程菌。但是获得 的重组菌仅是在受体菌株中过量表达或删除与木糖 代谢有关的少数几个关键酶基因 ,造成了细胞的糖 代谢流失衡 ,因此构建得到的重组菌株也未能投入 商业化生产。 因而我们认为这些单基因或几个基因的改造 , 某种的基因缺失或者扩增, 只是改变了细胞的局部 元件, 或是重新设计调节了细胞网络代谢产物的平 衡系统, 而这些人为的改变在细胞自身的代谢调节 下往往不能达到人们所期望的结果, 并没有解决木 糖代谢途径中的复杂问题。因此可以在酵母菌木糖 代谢途径的基因组层面上定向进化或同时改变多个 相关基因群, 使细胞在整体水平上适应木糖的代谢 或利用。 全 局 转 录 机 制 工 程 (Global transcription machinery engineering, gTME)技术正是通过基因工 程方法改造全局转录调控因子使整个转录调控过程 发生变化从而改变或提高目标基因的转录及表 达[6]。gTME 方法特别能够操纵大肠杆菌的σ因子和 在酿酒酵母中的 TFIID 组分引起转录子多基因的重 排。TFII D 由 TBP(TATA 结合蛋白)和十几种 TBP 相关因子(TAF)构成[7]。转录因子 spt15 属于转录起 始复合物部分, 是一种 TATA 结合蛋白, 与 RNA 聚 合酶Ⅱ及十几种基本转录因子结合后可以转录在基 因组中占据绝大多数的 mRNA 基因, 它的突变使相 关基因过量表达, 在表型上提高了酵母对乙醇耐受 能力。 首次利用 gTME 方法将全局转录因子 spt15 随 机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接 到含有强启动子 TPI 的表达载体 pYX212上, 醋酸 锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母 YPH499 中, 经 过特定的培养基初筛获得需要的细胞表型, 得到高 效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组 菌株。并对获得的重组菌株进行了初步研究。该重 组菌的构建为后续对该菌的进一步重组构建和改良 奠定了良好的基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和载体 大肠杆菌 Escherichia coli DH5α, 酿 酒 酵 母 宿 主 菌 株 为 Saccharomyces cerevisiae YPH499、 BY4742(购自美国 Stratagene 公司), 酵母表达载体 pYX212由本实验室保存。 1.1.2 培养基和培养条件 大肠杆菌 E. coli用LB培养基培养, 添加 50 µg/mL 氨苄青霉素。酿酒酵母用 YPAD 培养基培养, 以木 糖为唯一碳源筛选酵母转化子。 基本培养基(YPAD) g/L: 酵母粉 10, 蛋白胨 20, 葡萄糖 20, 腺嘌呤硫酸盐（L-ademine hemisulfat salt）0.075。筛选培养基 g/L: 不含氨基酸酵母氮源 (YNB)6.7, 必需氨基酸混合物(缺尿嘧啶)1.3, 木糖 20, 琼脂粉 20。 发酵培养基 g/L: 胰蛋白胨 20, 酵母粉 10, 不同 浓度的木糖和木糖、葡萄糖的混合糖(质量比为 1:1)。 1.1.3 试剂 实验所用限制性内切酶购自 NEB 公司 , pGEM-T vector System1 为 Promega公司生产, 基因 组 DNA 提取试剂盒为北京天根公司生产, 胶回收 1012 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2008 Vol.24 No.6 Journals.im.ac.cn 试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq 聚合酶、T4连接酶 为上海申能博彩公司生产 , 氨苄抗生素、 dNTP Mixture、 dTTP 为上海生工生物工程公司生产 , GenemorphII Random Mutagenesis Kit 为 美 国 Stratagene 公司生产。基因序列的测定由英骏 (Invitrogen)生物有限公司完成。其它试剂为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯。 1.2 实验方法 1.2.1 酿酒酵母 S. cerevisiae BY4742 基因组的提取 采用北京天根公司基因组DNA 提取试剂盒提取。 1.2.2 目的基因 spt15 的扩增及其易错 PCR 基因 库建立 根据公开的 spt15序列信息设计 PCR 引物[8]。 引物如下 : SPT15_Sense: 5′-TCGAGTGCTAGCAAA ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG-3′和 SPT15_ Anti: 5′-CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTC ACTTAGCACA-3′。 以获得的 spt15基因为模板进行不同 spt15浓度 的易错 PCR(GenemorphII Random Mutagenesis Kit)。 1.2.3 表达载体的 T载体 pYX212-T构建 平末端加 T法[9]。EcoR V酶切 pYX212成平末 端利用高效 Taq 酶加 dTTP 72oC 温浴连接 45 min, TaKaRa胶回收试剂盒回收纯化质粒 DNA带; T4连 接酶16oC自连, 试剂盒回收线性DNA,得到pYX212-T 并估计其浓度。 1.2.4 目的基因与表达载体的连接、酿酒酵母转化 及阳性转化子的筛选 将 spt15基因易错 PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶 电泳分离回收, 分别直接与 pYX212-T 16oC 连接, 将连接产物醋酸锂法 [10]转化入酿酒酵母 YPH499, YNB(不含尿嘧啶)木糖培养基筛选得到白色菌落转 化子, 接种到 YPX 液体培养基中培养, 经过镜检 和菌落 PCR, 菌落 PCR 由 1.0%的琼脂糖凝胶电泳 鉴定。 1.3 重组酿酒酵母YPH499-3发酵实验及结果分析 获得的阳性重组子酿酒酵母 YPH499-3 接种于 20 mL YNB(不含尿嘧啶)木糖培养基, 30oC, 200 r/min 活化 24 h。将活化的种子液按 10%(V/V)的接种量分 别接种于含 100 mL 发酵培养基的 500 mL三角瓶 中。将菌液适当稀释后在 600 nm下测定吸光度值, 选择在对数生长期的菌株分别接种到 100 mL 50 g/L 木糖、100 g/L木糖、150 g/L木糖、50 g/L葡萄糖、 100 g/L葡萄糖、150 g/L葡萄糖、50 g/L混合糖、100 g/L 混合糖、150 g/L混合糖发酵培养基中, 30oC 200 r/min 厌氧发酵, 测定乙醇含量和残糖量。 发酵液样品经 0.45 µm 醋酸纤维滤膜过滤, 木 糖、木糖醇、葡萄糖浓度用高效液相色谱测定。 DIONEX(Ultimate 3000)高效液相色谱仪 , 检测器 Shodex RI-101, Chromeleon version 6.80工作站, 色 谱柱为 Lichrospher-NH2柱(江苏汉邦科技有限公司) 色谱条件 : 柱温 30oC, 流动相为乙腈 : 水 =80: 20(V/V), 流速为 1.0 mL/min。 乙醇检测: 血乙醇试剂盒(长春汇力生物技术有 限公司), 采用两点速率法。 菌体浓度用 OD600测定, 1 OD600=0.367 g干菌体 /L(木糖), 0.410 g干菌体/L(葡萄糖), 0.355 g干菌体 /L(混合糖)。 2 结果与讨论 2.1 spt15 基因的克隆及其易错 PCR 基因库建立 以 S. cerevisiae BY4742的基因组 DNA为模板, 利用设计的引物进行 PCR 反应, PCR产物电泳检测 在 0.75 kb 左右有一明显条带(图 1), 且非特异性扩 增不明显。 图 1 spt15 基因的克隆 Fig. 1 PCR products of spt15 gene 1: PCR products; M: DNA marker DL2000 将 PCR产物经纯化回收后和克隆载体 pGM-T连 接, 连接产物转化大肠杆菌 E. coli DH5α,利用蓝白斑 筛选出阳性转化子, 提取的质粒用Nco I和 Nol I双酶 切, 电泳验证酶切产物和 PCR产物基本相同(图 2)。 刘红梅等: gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母 1013 Journals.im.ac.cn 质粒测序结果表明得到的 spt15 序列正确, 和基因库 中基因序列同源性 100%, 蛋白质同源性 100%。 图 2 Nco I & Not I 酶切 pGM-T-spt1 Fig. 2 Identification of pGM-T-spt15 by digested with Nco I and Not I 1: pGM-T-spt15 digested with Nco I and Not I; M: DNA marker DL2000 利用 GenemorphII Random Mutagenesis Kit 以 spt15为模板进行易错 PCR,经电泳验证易错 PCR产 物与 PCR产物基本相同(图 3)。 图 3 不同 spt15 浓度的易错 PCR Fig. 3 Error-prone PCR with different spt15 concentrations 1~16: Error-prone PCR products with different spt15 concentration; M: DL2000 marker 2.2 重组酵母表达载体 pYX212-spt15 的构建和 重组酿酒酵母筛选 在重组质粒 pGM-spt15上经 PCR扩增, 琼脂糖 凝胶电泳回收纯化。利用 T4DNA连接酶将 spt15 基 因和 pYX212-T连接, 构建出带有 spt15的重组载体 pYX212-spt15。pYX212-spt15 转化入不能利用木糖 的酿酒酵母 YPH499, YNB(不含尿嘧啶)木糖培养基 筛选。得到能够在木糖为唯一碳源的培养基上生长 的重组酿酒酵母 YPH499-3(图 4)。 2.3 重组酿酒酵母发酵产物的检测 2.3.1 不同糖浓度对 YPH499-3生长的影响 YPH499-3在 50 g/L、100 g/L、150 g/L的木糖、 葡萄糖和两者的混合糖(质量比木糖: 葡萄糖为 1:1) 的培养基上均达到较高生长速率, 随着糖浓度增加 相应 OD 值有所降低, 存在着一定的底物抑制现象, 木糖和葡萄糖同时利用, 共利用率较高(图 5)。 图 4 筛选出的重组菌落 Fig. 4 Colony on the screening plate 图 5 YPH499-3 在不同浓度木糖和葡萄糖培养基上(a)以 及不同浓度混合糖培养上(b)的时间进程 Fig. 5 Time courses of YPH499-3 in the ferment media with different concentrations of xylose and glucose (a), and different concentrations of mixed sugar 2.3.2 不同浓度木糖、葡萄糖对 YPH499-3的影响 在发酵 96 h时测得糖的利用率为: 94.0%(50 g/L 木糖), 90.0%(100 g/L 木糖),82.0%(150 g/L 木糖), 98.9%(50 g/L 葡萄糖 ), 97.1%(100 g/L 葡萄糖 ), 95.9%(150 g/L葡萄糖), 91.7%(50 g/L混合糖中的木 1014 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2008 Vol.24 No.6 Journals.im.ac.cn 糖), 85.9%(50 g/L混合糖中的葡萄糖), 80.8%(100 g/L 混合糖中的木糖), 90.3%(100 g/L 混合糖中的葡萄 糖), 92.0%(150 g/L混合糖中的木糖), 92.1%(150 g/L 混合糖中的葡萄糖), 其木糖和葡萄糖利用率均达到 80%以上(结果见图 6、7)。而木糖醇产量很少(发酵 96 h, 只有 10%木糖、15%木糖检测到木糖醇, 含量 分别为: 2.81 g/L、2.45 g/L)。 图 6 YPH499-3 在不同糖浓度培养基中的利用 Fig. 6 Utilization of xylose and glucose in ferment media of different sugar concentrations by YPH499-3 图 7 YPH499-3 在不同混合糖浓度培养基中的利用 Fig. 7 Utilization of xylose and glucose in ferment media of different mixed sugar concentrations by YPH499-3 2.3.3 YPH499-3厌氧发酵乙醇产量 原始菌株 YPH499 和重组菌株 YPH499-3 在 50 g/L的葡萄糖、木糖和混合糖(木糖和葡萄糖质量 比为 1:1)培养基, 30oC 200 r/min的条件下发酵 96 h 后得到的结果如表 1 所示, 相对于出发菌 YPH499, 重组菌 YPH499-3 能很好地利用木糖产乙醇, 且其 产乙醇量高于同期条件下的葡萄糖和混合糖, 这与 文献报道的不太一致, 也揭示了本重组菌的代谢途 径发生了很大的变化, 正在进一步研究中。 表 1 重组菌与对照菌株相同条件下的产醇比较 Table 1 Comparison of the ethanol yield with the recombinant yeast and control yeast Strain Carbon source /(g/L) Ethanol mass concentration /(g/L) Ethanol Yield/% YPH499 50(glucose) 22.15 44.3 YPH499-3 50(glucose) 15.8 31.6 YPH499-3 50(xylose) 16.2 32.4 YPH499-3 50(mixed sugar) 13.0 26.0 3 讨论 基因表达调控发生在遗传信息传递过程的各个 水平上。而转录调控是基因表达调控中最重要的一 个环节, 也是当前研究的重点。gTME的方法能改变 主要蛋白质在整个转录子的产生和调控, 这样就产 生了在转录水平多样性的一种新类型, 即通过对于 转录蛋白应答的变更, 使得整个转录子产生大的扰 动。此方法允许改变许多末端基因的表达, 同时也 能很容易连回到单转录蛋白。MIT研究小组 06年报 告已经成功利用 gTME 方法突变转录因子 spt15 转 化入酿酒酵母, 从而增加酵母对乙醇和葡萄糖的耐 受能力, 提高了生物乙醇生产的速度和效率。目前 全局转录机制工程技术应用于酿酒酵母中木糖代谢 途径中的研究仍属空白, 国内外尚未见报道。 本研究首次利用 gTME 方法得到高效利用木糖 并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株 YPH499-3。并对获得的重组菌株进行了初步研究。 通过检测该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木糖 和葡萄糖。50 g/L木糖利用率达到 94.2%, 50 g/L葡 萄糖利用率 94.8%, 当木糖和葡萄糖以质量比 1:1混 合发酵时 , 木糖和葡萄糖利用率分别为 91.7%和 85.9%, 并且木糖醇含量很少。构建出的重组酿酒酵 母能发酵木糖和共发酵木糖和葡萄糖产乙醇。该重 组菌的构建为后续对该菌的进一步重组构建和改良 奠定了良好的基础。 利用 gTME 技术构建和改良酵母菌, 提高它们 对木糖的发酵能力在理论上是可行的, 并且已经构 建出的重组菌株, 提高了其在厌氧条件下共发酵木 糖和葡萄糖产乙醇的能力, 这些成果为生物质原料 生物转化制取乙醇奠定了一定的理论基础。但是 , 目前所获得的重组菌株距离实际的商业化生产还有 相当大的差距, 生物质水解液的己糖、戊糖同步厌 刘红梅等: gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母 1015 Journals.im.ac.cn 氧乙醇发酵技术仍然在进一步研究中。因此, 进一 步利用微生物的木糖代谢机制 ,构建性能更加优良 的共发酵菌株, 提高其乙醇的生产性能,增强菌株对 发酵抑制剂的耐受力, 从而降低生产成本, 对植物 纤维原料生物转化生产乙醇具有重要的意义。 REFERENCES [1] Nigam JN. 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GFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGFGF 《生物工程学报》英文版简介 为了加快期刊的国际化进程, 扩大国际交流, 本刊与国际知名的爱思唯尔出版公司(Elsevier)达成 协议 离婚协议模板下载合伙人协议 下载渠道分销协议免费下载敬业协议下载授课协议下载 ,合作出版英 文电子版《Chinese Journal of Biotechnology》, 该刊与中文版同步, 月刊。出版后置于爱思唯尔庞大的 ScienceDirect网 络出版平台上, 我刊网址: http://www.sciencedirect.com/science/journal/18722075。 爱思唯尔是国际著名的出版公司, 《Cell》等知名杂志便出自该公司。ScienceDirect是爱思唯尔建立的世界上最全 面的服务于多学科研究型图书馆的电子数据库。研究人员通过它能在线访问超过 1800种期刊和 400万篇电子版全文。 《生物工程学报》英文版借助这个庞大而成熟的平台, 将可以大大地提高文章的浏览量, 扩大期刊及作者在国内外的影 响, 提高文章的被引频次。同时, 出版英文电子版将可克服与国外文字沟通的障碍, 使作者的科研成果能在第一时间内 为国际同行所了解。 我刊的栏目有综述、 研究报告 水源地可行性研究报告美术课题研究中期报告师生关系的个案研究养羊可行性研究报告可行性研究报告诊所 、研究简报和技术与方法等, 范围包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、 发酵工程、生化工程、代谢工程、组织工程、生物制药、生物芯片、生物反应器及生物信息学等, 涉及生物技术各个领 域, 非常欢迎广大科研人员踊跃投稿。直接投英文稿件而被录用的, 也将同时发表在中文印刷版上。我刊将增加英文稿 件的刊出量, 并邀请国外专家对录用英文稿件进行英文润色, 部分优质稿件将参考专家意见予以优先发表。英文版不再 另收版面费。 具体做法是: 每期从中文版中精选出5~10篇稿件译成英文, 凡具备以下条件之一者即可入选: 1. 在理论方面有新发现或 新见解。2. 在应用方面取得新进展, 达到新水平。3. 在技术方面建立新方法或改进已有的方法。选中后通知作者译成英文, 经 编辑部审核送爱思唯尔出版公司进行文字加工, 再返回作者进行内容确证。 投稿时请注意以下事项: 1. 稿件撰写时, 应力求叙述清楚, 避免语法错误和用词不当。2. 突出创新点,用具体材料、 数据加以说明与论证。3. 加强图表注释, 使读者在不读正文的情况下能正确理解图表的涵义。 欲了解更详细的信息，请关注我们网页的更新或联络编辑部: 电话: 010-64807509; 传真: 010-64807327; E-mail: cjb@im.ac.cn