多壁碳纳米管负载Fe3O4磁性纳米粒子表面吸附增强过氧化酶的催化活性

October 物理化学学~E(Wuli Huaxue Xuebao、 Acta P ．一Chim．Sin．2011，27(10)，2469—2477 2469 [Article] www．whxb．pku．edu．cn 多壁碳纳米管负载Fe3O4磁性纳米粒子表面吸附增强过氧化酶的 催化活性 高云燕 李海霞’ 欧植泽 郝 平’ 李 嫣 杨国强。 ( 西北工业大学理学院，空间应用物理与化学教育部重点实验室，西安 710072； 中国科学院理化技术研究所， 光化学转换与功能材料重点实验室，北京 100190； 中国科学院化学研究所，光化学重点实验室，北京 100190) 摘要： 采用共沉淀法制备了Fe。o 磁性纳米粒子，将其负载于氨基吡啶修饰多壁碳纳米管(MWCNT-AP)J~，得 到具有良好的分散性和超顺磁性的Fe。OJMWCNT-AP复合物．通过傅里叶变换红#~(FT-IR)光谱、X射线衍射 (XRD)gll磁滞回线测量等方法对Fe。0 ／MWCNT-AP复合物进行了表征．扫描电镜(TEM)结果表明：Fe。O 磁性 纳米粒子多集中于碳纳米管MWCNT-AP的端部，形成的复合物在极性溶剂中具有良好的分散性和超顺磁性： 辣根过氧化酶(HRP)可通过物理作用吸附于 Fe。O ／MWCNT-AP复合物表面．酸性条件下(pH 4．0)，Fe。O4， MWCNT-AP复合物使HRP的最大反应速率( 。 )提高了3倍． 关键词： 碳纳米管； 磁性纳米粒子； 过氧化酶： 纳米复合物： 超顺磁性 中图分类号： 0648 Enhancing the Catalytic Activity of Peroxidase by Adsorption onto Fe304 Magnetic Nanoparticle／MuItiwalled Carbon Nanotube Composite Su ces GAO Yun—Yan’’ LI Hai—Xia’ OU Zhi—Ze’t HAO Ping’ LI Yi YANG Guo·Qiang。 LMinistry ofEducation Key Laboratory ofSpace,Applied PhySics and Chemistry,School ofScience,Northwestern Polytechnical University,Xi'an 710072，P R．China； 2Key Laboratory ofPhotochemical Conversion and Optoelectronic Materials，Technical Institute ofPhysics and Chem~try,Chinese Academy ofSciences，Beijing 10019~P R．China； Key Laboratory of Photochemistry,Institute ofChem~try,Chinese Academy ofSciences，Beijing 100190，尸R．China) Abstract： Fe304 magnetic nanOparticIes were prepared by CO．precipitation and supposed on the surface of aminopyridine—grafted multiwalled carbon nanotubes(MWCNT-AP)，affording a superparamagnetic Fe3O4，MWCNT_AP composite with good dispersity．The Fe3O4／MWCNT-AP composites were characterized by Fourier transform infrared (FT-IR)spectroscopy，X．ray diffraction (XRD)，and hysteresis curve measurements，Transmission electron microscopy (TEM1 experimental results suggest that the Fe3O4 nanODartjcIes are mainly adsorbed on the tips of the MW CNT-AP UV-Vis absorption and fluorescence results demonstrate that horseradish peroxidase(HRP)can be physically adsorbed onto the surfaces of the Fe3O4，MWCN T_AP composite．Under acidic conditions(pH 4．0)，the maximum reaction rate(vm )value of the H RP increases 3-foId after interaction with Fe3O4／MW CNT-AP Received：April l0，2011；Revised：June29，2011；Published onWeb：August 11，2011． ’Corresponding authors．GAO Yun—Yan，Email：gaoyunyan@nwpu．edu．cn．OU Zhi—Ze，Email：ouzhize@nwpu．edu cn；Tel：+86—29—8843 1677． The project was supported by the National Natural Science Foundation ofChina(21073143)，Chunhui Project from the Ministry ofEducation of China(Z2009-t一71002，Z2009—1-71006)，and NoRhwestem Polytechnical University Foundation for Fundamental Research，China(JC200822， JC20100239)． 国家自然科学基金(21073143)，教育部春晖 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 基金(Z2009．1—71002，Z2009—1—71006)及西北工业大学基础研究基金(JC200822，JC20100239) 资助项目 (C)Editorial office ofActa Physico．Chimica Sinica 247O ActaPhys．一Chim． n．2011 VO1．27 Key Words： Carbon nanotube； Magnetic nanoparticle； Peroxidase； Nanocomposite Superparamagnetic property 1 引 言 磁性纳米粒子是一种新型纳米功能材料，具有 良好的生物相容性和特殊的磁性能，能与细胞、酶、 蛋白质及核酸等生物分子作用，在多种生物医学领 域具有潜在的应用前景． 磁性纳米颗粒表面负载 过氧化酶得到的复合材料既具有磁性纳米颗粒的 优点，又具有酶的催化活性，可用于生物催化和生 物分离． 过氧化酶具有价格低廉、易于提取、适用 范围广的特点，作为催化剂在酶联免疫技术和组织 化学技术等领域具有广泛用途． 过氧化酶负载于 具有合适粒径和磁性能的磁性纳米粒子表面后，其 催化活性可大幅增强． 将磁性纳米粒子与HRP抗体 进行共价连接，能够提高检测灵敏度． 由于Fe O 磁 性纳米粒子磁偶极问的相互吸引作用，导致纳米颗 粒极易团聚，对纳米颗粒进行表面修饰，可改善磁 性纳米粒子的分散性及其胶体溶液的稳定性，并引 入新的功能． 碳纳米管作为一种新型的吸附材料，具有比表 面积大、吸附容量大的优点，将磁性纳米粒子负载 于碳纳米管表面或填充于碳纳米管内部，可以制备 出具有特殊性能的纳米复合材料．“ 通过层层 自 组装或液相共沉淀方法制备的Fe O 磁性纳米粒 子／碳纳米管复合材料具有超顺磁性、分散性良好 的优点， 可应用于有机染料吸附、模拟氧化酶催 化氧化酚类化合物、气体吸附等领域．” 近年来，将 生物酶负载于纳米粒子／碳纳米管表面，形成的纳米 复合材料具有良好生物活性，引起了人们的广泛关 注． 碳纳米管和磁性纳米粒子都对生物酶具有很 好的吸附作用ff3,24但是磁性纳米粒子／碳纳米管复合 物与酶的相互作用及其对酶催化活性的影响的研 究还较少．。 氨基吡啶修饰碳纳米管(MWCNT-AP)在水溶液 中具有良好的分散性，可吸附HRP及其底物，能有效 提高HRP的催化活性． 本文采用共沉淀法合成了 Fe O4磁性纳米粒子，以MWCNT-AP作为载体，制备 得到了Fe，O ／MWCNT-AP纳米复合物．研究 了在 HRP最佳活性条件下fDH 4．O 。 Fe，O ／MWCNT-AP 纳米复合物与HRP的相互作用及其对HRP催化活 性的影响． 2 实验部分 2．1 主要试剂和仪器 2．氨基吡啶修饰多壁碳纳米管为实验室自制， 按照文献合成． 辣根过氧化酶购 自Sigma公司，美 国；氯化铁(FeCI，·6H：01、亚硫酸钠(Na~SO )、氯化钠 (NaC1)、25％氨水fNH，·H 0)、3，3 ，5，5 一四甲基联苯胺 (TMB)、磷酸氢二钠fNaH PO )、柠檬酸、过氧化氢 (H O )、无水乙醇均为国药集团化学试剂有限公司 分析纯试剂，使用前未经进一步处理．所有有机溶 剂均经过无水处理，使用前重蒸．水溶液采用二次 蒸馏水配制，所用缓冲溶液均为柠檬酸．磷酸缓冲溶 液(0．1 mol·L一，pH 4．0)． HRP溶液的浓度通过紫外一可见吸收光谱仪检 测其在 403 nm处的吸收来求得fs 9．4×10 L· tool～·cm H O：的浓度通过紫外一可见吸收光谱 仪检测其在240 ilm处的吸收求得(＆ 。=43．6 L·tool～· cm一 、． 所用仪器：Hitachi U．3010紫外一可见吸收光谱 仪，日本；Broker傅里叶红外光谱仪，美国：H一800扫 描电镜，日本；Bio．Tek Synergy HT型多功能酶标 仪，美国：PANalytical x’Pert PRO X射线衍射仪，荷 兰：MPMS．XL．7型超导量子干涉磁测量系统，美国． 2．2 磁性纳米粒子及碳管负载磁性纳米粒子复合 物的制备 采用共沉淀方法制各Fe 0 磁性纳米粒子．”称 取 12．98 g FeCI ·6H o(o．048 mo1)溶解于100 mL二 次蒸馏水 中，转入 500 mL三 口烧瓶中．将 2．O2 g Na SO，(0．016 too1)溶解于50 mL二次蒸馏水中，转 入滴液漏斗中：在N 保护和快速磁力搅拌条件下， 缓慢滴加到三口烧瓶中，溶液逐渐由红褐色变为黄 色．待Na2SO 滴加完毕、将40 mL 15％氨水溶液迅速 加入反应液中，快速升温至60。c，反应 1 h，生成大 量黑色Fe，0 粒子．停止加热，N。保护和室温条件下 继续搅拌2 h．在永久磁场中磁分离生成的Fe 0 粒 子，先后用无水乙醇、NaCl溶液和二次蒸馏水洗涤 数次，直至溶液呈中性．最后置于二次蒸馏水中待 用(0．5％，w)． 将之前制备的MWCNT-AP溶于重蒸的DMF 溶液中待用(O．1％，w)．分别取 1 mL Fe。O 磁性纳米 粒子(0．5％，w)和 MWCNT-AP(0．1％，w)溶液均匀混 No．10 高云燕等：多壁碳纳米管负载Fe，O 磁性纳米粒子表面吸附增强过氧化酶的催化活性 2471 合，室温静置2 h以上，即得 Fe，OdMWCNT-AP复 合物． 2．3 Fe。O4，MWCN1_-AP复合物的紫外-可见吸收 光谱测定 将 Fe，O ／MWCNT-AP复合物样品在缓冲溶液 中超声分散20 min，测定 280—700 nm范围内的紫外 可见吸收光谱．然后在比色皿的底部放置一块钕铁 硼永久磁铁，测定不同静置时间条件下外加磁场对 Fe，O ／MWCNT-AP吸收光谱的影响． 2。4 Fe。O4，MWCNT_AP复合物与HRP相互作用 的紫外．可见吸收光谱测定 在 10 mL容量瓶 中依 次加入 1．4 mL HRP的柠 檬酸．磷酸缓冲溶液(50 gmol·L )，100 gL Fe 0 ／ MWCNT-AP复合物的水溶液(Fe O 与MWCNT-AP 的质量比为5：l，[Fe O ]=1．25 g·L，[MWCNT-AP]= 0．25 g·L )，用柠檬酸一磷酸缓冲溶液定容至 10 mL 后摇匀，室温静置3 h．采用 1 cm石英比色皿，测定 溶液在200—700 nm波长范围内的紫外．可见吸收 光谱． 2．5 Fe。04，MWCNT．AP复合物与HRP相互作用 的荧光光谱测定 在 10 mL容量瓶中依次加入0．2 mL的HRP溶 液(50 gmol·L )，1 2—96 Fe O ／MWCNT-AP复合 物 的水 溶液([Fe，O ]=1．25 g·L～，[MWCNT-AP]= 0．25 g·L )，用柠檬酸．磷酸缓冲溶液定容至 10 mL 后摇匀，室温静置3 h．采用 l cm比色皿，以295 nm 为激发波长，扫描305—550 nm波长范围内的荧光光 谱，激发和发射狭缝宽度均为10 Bin． 2．6 过氧化酶(HRP)的酶反应动力学参数测定 在过氧化氢存在的条件下，HRP催化氧化TMB 的反应为双底物反应．HRP首先与H 0：反应生成氧 化态为+5的HRP中间体，该中间体能与TMB反应， 得到两个电子后被还原成HRP．而TMB则氧化成为 具有醌式结构的偶联氧化产物(TMBox)(图1)．本实 验采用TMB作为色原底物，根据TMB偶联产物的 颜色变化测定HRP的反应动力学参数． 在96孔板 中依次加入 50 TMB溶液(1．5 mmol-L )，5O 不同浓度的H 0 溶液，使H O 在150 gL反应体系中 的浓度分别为5，10，15，20，25，30，40 gmol·L一，最 后加入 50 gL HRP溶液(3 nmol·L。。)，混匀后，于室温 条件 (25。C)下利用 酶标仪测 定各 反应体系在 650 nm处的吸光度．根据TMB的联苯胺氧化产物在 650 nm处的吸光度 的变化 =3．0×10 L·mol～· cm )，弛可以计算出不同H O 浓度条件下的反应速 率 根据米氏方程(公式(1))，采用Lineweaver-Burk 双倒数作图法可计算出HRP的最大反应速率(v ) 及表观米氏常数( )值． ： + 上 r1、 1， [[-I202]‘v v 根据实验要求，TMB的吸附实验条件为TMB(1．5 mmol·L )分别与Fe O 磁性纳米颗粒(7．5 gg·mL )、 MWCNT-AP(1．5 gg·mL )或 Fe，O ／MWCNT-AP复 合物(Fe O 为7．5 lag·mL一，MWCNT-AP为 1．5 g· mL )共混，室温避光静置 3 h后，用于酶反应活性 测定． 3 结果与讨论 3．1 红外光谱分析 共沉淀方法是制备Fe 0 磁性纳米粒子的经典 方法之一，选用 NH，·H O等碱 性沉淀 剂进行共沉 淀，通过控制工艺条件，可得到性能优 良的磁性 Fe O 纳米粒子．琊 其反应方程式(公式(2，3))为： S0j一+2Fe +H2O--+2Fe +SOi一+2H (2) 2Fe +Fe +8OH一一Fe O +4H：O (3) Fe O 磁性纳米粒子的红外特征吸收光谱为Fe一0 键的特征吸收峰(559 cm )和羟摹OH伸缩振动吸收 峰(3415 cm )(图2(a))，与文献结果。。。致． MWCNT- AP的红外吸收光谱的特征吸收峰为C=O伸缩振 动吸收峰(1627 cm 、一NH的弯曲振动峰(1573 cm )及N—H的伸缩振动峰(3329 cm )(图2(b))．而 MWCNT-AP负载Fe，O 磁性纳米粒子后，既可观察 到Fe，O 颗粒中Fe一0键的特征吸收峰(559 cm )， 还可明显观察MWCNT-AP结构中的C=O特征峰 在(1628 cm )(图2(c))， 同时羟基OH伸缩振动吸收 TMB TMBox 图1 HRP酶催化氧化TMB的反应 Fig．1 Catalytic oxidation of3，3 ，5，5'-tetramethylbenzidine frMB)in the presence ofHRP 2472 Aeta PhyS．一Chim．Sm．2011 VO1．27 4000 3500 3000 2500 2000 1 500 1 000 500 图2 (a)Fe3o。磁性纳米粒子，(b)MWCNT-AP和(c)Fe O,J MWCNT-AP复合物的红外光谱图 Fig．2 FT-IR spectra of(a)MWCNT-AP,(b)Fe~O# nanoparticles，and(c)Fe3OJMWCNT-AP composite 峰(3421 C1TI )较单独的MWCNT-AP和Fe O 发生位 移，由此可以说明Fe，O 磁性纳米粒子已经成功负载 在 MWCNT-AP上． 3．2 透射电镜分析 将少量Fe，O 磁性纳米粒子或 Fe OJMWCNT- AP复合物样品在无水乙醇中超声分散30 min．取少 量分散液滴在铜网上，静置、自然晾干后，进行透射 电镜分析．Fe O 磁性纳米粒子的形貌如图3Ca)所 示，可以看出化学共沉淀方法制备的Fe o 纳米粒子 主要为球形结构，具有团聚现象．" 对比高分辨率 的TEM图(图3fb))，可以看到TEM图像中磁性纳米 粒子的粒径分布均匀，直径约为5—10 nm． 图4(a]为Fe，0 ／MWCNT-AP复合物的TEM图． 高分辨TEM图(图4(b))说明Fe O 磁性纳米粒子主 要负载于MWCNT-AP的端部，且粒子形貌完整，大 小较为均匀，分散性明显改善．这可能是MWCNT- AP的化学修饰基团主要位于端部，端部的--COOH 和氨基毗啶基团与Fe，0 纳米粒子具有较强的配 位相互作用或氢键相互作用，从而使得 Fe 0 在 MWCNT-AP端部的分布较多． 对比未经负载磁 性纳米粒子的碳纳米管TEM图(图4(c))，说明负载 磁性纳米粒子后，氨基修饰碳纳米管之间的簇集也 受到了抑制． 利用能量色散X射线能量散射谱仪(EDS)对负 载Fe，04／MWCNT_AP复合物进行了x射线成分分 析，得到EDS谱(图5)．可以看出谱图中存在Fe、C和 O三种元素，进一步表明Fe 0 磁性纳米粒子己成功 地负载于碳纳米管表面． 图3 F o 磁性纳米粒子的(a)透射电镜扫描图及(b)高分辨透射电镜扫描图 Fig．3 (a)TEM images and Co)high—res0lution TEM images of Fe~O+nanoparticles 图4 Fe3OcrMWCNT-AP复合物的(a)透射电镜扫描图、(b)高分辨透射电镜扫描图和(c)MWCNT-AP的透射电镜扫描图 Fig·4 (a)TEM images，(b)high—resolution TEM images of Fe3OdMW CNT-AP composite and(c)TEM images of M W CNT-AP ( ( No．10 高云燕等：多壁碳纳米管负载Fe O 磁性纳米粒子表面吸附增强过氧化酶的催化活性 2473 800 6OO 0 400 200 I e =e ：u L Cu Cu ．k l ／KeY 图5 Fe。O ／MWCNT-AP复合物的能量散射谱(EDS) Fig．5 Energy dispersive spectrum (EDS)of Fe302 MW CNT-AP composite 3．3 X射线衍射(XRD)分析 图6(a)中MWCNT-AP在 20=26．4。处的宽衍射 峰对应于MWCNT-AP晶面的Bragg石墨晶型特征 峰． 在Fe 0 磁性纳米粒子的XRD图谱主要有五个 特征衍射峰，分别位于 30．2。、35．6。、43．3。、57．4。及 62．8。，属于立方晶系Fe O 的特征衍射峰(图6(b))． 在XRD图谱 中未能检测到 ．Fe O 的特征峰(2 = 53．7。，68．2。)， 说明制备的铁氧化物主要为具有磁 性的Fe O ．Fe O ／MWCNT-AP复合物表现出明显的 Fe O 磁性纳米粒子的特征衍射峰(图6(c))，表明碳 纳米管的存在没有影响Fe 0 磁性纳米粒子的晶体 结构．同时Fe O ／MWCNT-AP复合物中未能检测到 碳纳米管的特征衍射峰，可能是与磁性纳米粒子作 用后碳纳米管之间的簇集受到了抑制， 与图4(b)的 透射电镜结果相符． 3．4 磁性能分析 图7显示了在室温下 Fe 0 磁性纳米粒子和 10 20 3O 40 50 60 0 80 20，(。) 图6 (a)MWCNT-AP，(b)Fe，o．磁性纳米粒子和 (c)Fe，04，MWCNT-AP复合物的XRD谱图 Fig．6 XRD pa~erns of(a)MWCNT-AP,(b)Fe3o4 nanoparticles，and(c)Fe30 WCNT-AP composite ～ 0 E 《 一 、 H／(kAm 1 图7 Fe 0 磁性纳米粒子和Fe O ／MWCNT-AP复合物的磁 滞回线 Fig．7 M agnetic hysteresis loop of Fe3o4 nanoparticles and Fe3o4／lⅥW CNrr．AP composite Fe O ／MWCNT-AP复合物的磁滞回线，二者均无剩 磁和矫顽力，表现为超顺磁性． 其中Fe O 磁性纳米 粒子的饱和磁化强度 )值为68．8 A·ITI ·kg～，而 Fe OdMWCNT-AP复合物的饱和磁化强度( 1值为 62．6 A ·m2~kg～ ． 对 Fe，O ／MWCNT-AP复合物的缓冲溶液施加 外加磁场后，Fe 04／MWCNT_AP复合物在紫外．可见 吸收光区的吸收随着外加磁场施加时间的延长而 逐渐降低(图8)．图8中的插图显示，施加外加磁场 10 min后，Fe O ／MWCNT-AP复合物主要位 于比色 皿底部，其上清液接近无色，比相同浓度条件下的 MWCNT-AP溶液颜色要浅得多．而外加磁场对 MWCNT-AP溶液的吸收光谱没有影响，这进一步 ，nm 图8 施加外加磁 场0 min(a)，5 min(b)，10 min(c)后 Fe Od MwCNT_AP紫外．可见吸收光谱 Fig．8 UV—ViS spectra of Fe3o4，M W CNT_AP with external magneticfieldfor 0min(a)，5min(b)，10min(c) ：absorbance；[Fe3O4]=l2．5 gg·mL～，[MWCNT-AP]=2．5 g·mL～． Inset images：(1)MWCNT-AP；(2)Fe3o ／MWCNT-AP complex without external magenetic field；(3)Fe3O4／MWCNT-AP complex with external magenetic field for 10 min 2474 Acta Phys．一Chim．S衲．2011 VO1．27 图9 (a】HRP(点线)，Fe，O ／MWCNT-AP复合物(虚线)及Fe。O~~IWCNT-AP复合物与HRP混合溶液(实线)在柠檬酸一磷酸缓 冲溶液中(pH：4．0)的紫外一可见吸收光谱；(b)Fe O4／MwcNT-Ap复合物与HRP相互作用的吸收谱 Fig．9 (a)Absorption spectra of native HRP(dotted line)，Fe3O4／MWCNT-AP composite(dashed line)，and the mixture solution of F白0 4，】ⅥW CNT-APcomposite and HRP(solid line)in 0．1 tool·L～citric acid·PBS buffer(pH--4．O)； (b1 absorption spectra for the interaction between HRP and Fe304，MW CNT_AP [HRP]=7 lamol·L ，[MWCNT-AP]=2．5 lag·mL～，[Fe3O 】=12．5 lag·mL 说明在缓冲溶液中Fe 0 与MWCNT-AP能形成稳 定的复合物．” 3．5 Fe。O4『MWCNT_AP复合物与HRP相互作用 的光谱 利用紫外一可见吸收光谱研究了pH=4．0时HRP 与Fe。OdMWCNT-AP复合物之间的相互作用f图9)． HRP在648、498、403和275 nm处共有4个吸收峰， 其中648、498、403 nm的吸收峰分别为血红素卟啉 环的o【带、 带和)r带(Soret带)的吸收； 275 am处的 吸收峰可归属为HRP中酪氨酸(Tyr)~l色氨酸(Tip) 残基的吸收(图 9(a))．加入Fe，O~ WCNT-AP后， HRP保持了相关的吸收峰，且未发现峰位有红移或 蓝移现象． 根据公式f4)可以得到HRP与Fe O ／MWCNT- AP相互作用的紫外一可见吸收浓度 )差． A,4= HRP，MwcNT ．AP，Fe1od一 HRP一 o wCNT—AP(4) 从Fe，O4／MWCNT-AP与HRP相互作用的紫外一可见 吸收差谱(图9fb))可以看出，HRP在270—300nm区 间存在明显的负吸收峰，即存在减色效应，这可能 是由于Fe，O 与HRP结合后，改变 了色氨酸 、酪氨酸 等芳香环氨基酸残基的疏水环境． 也说明Fe O ／ MWCNT-AP与HRP在基态条件下具有较强的相互 作用． 色氨酸的荧光强度和荧光发射峰峰位对所处 环境极性非常敏感．采用295 nln选择性激发色氨酸 时，HRP在柠檬酸一磷酸缓冲溶液中的荧光发射峰位 于384 nm(图10)，与中性环境条件下色氨酸的荧光 发射峰(342 nm)相比明显红移， 这可能是酸性条件 下蛋白质的构象变化所引起． 加入Fe，O ／MWCNT- AP复合物溶液后，HRP的色氨酸荧光发射峰逐渐 蓝移，且强度升高．当Fe，O 和MWCNT-AP的浓度 分别达到 1．2 gg·mL 和0．24 g·mL 时，其荧光峰 蓝移至370 rim，且荧光强度提高了2．8倍．色氨酸荧 光峰蓝移和荧光强度升高，说明色氨酸所处蛋白质 微环境的疏水性增加，极性降低． 上述结果表明， 加入F白O4／MwcNT-AP复合物对HRP构象有较大 的影响． 3．6 对HRP酶反应动力学的影响 Fe 0 磁性纳米粒子表面能够吸附HRP,且能够 大幅促进HRP的酶催化活性． 本文利用化学共沉淀 法合成的Fe，0 磁性纳米粒子及其Fe O4／MWCNT- AP复合物与HRP具有较强的相互作用．利用TMB 图10 加入Fe30,／MWCNT-AP复合物对HRP(1 pmDJ· L )荧光光谱的影响 Fig．10 Fluorescence spectra changes of HRP f1 pmol· L )upon addi~on of Fe3O4／1VIWCNT-AP complex A =295 am 一3 一、苦lsc坐芒一8 LJ 。协 JJo nJ．| No．10 高云燕等：多壁碳纳米管负载Fe O 磁性纳米粒子表面吸附增强过氧化酶的催化活性 2475 t／s 【H2O2 ／(L‘pmol。。) 图II MWCNT-AP(0．5 pg·mL )、Fe o (2．5}‘g·mL )和Fe，ot，MWCNT_AP存在条件下HRP的(a)反应动力学曲线和(b) Lineweaver-Burke曲线 Fig．11 (a)Kinetic curves ofthe reaction and(b)Lineweaver-Burke plots ofHRPin the absence or in the presence ofFe3O4 (2．5 Pg·mL )，MWCNT-AP(0．5 Pg·mL )or Fe，OjlVlWCNT-AP pH=4．0 表1 Fe O 磁性纳米粒子，MWCNT-AP及Fe，O ／MWCNT-AP复合物存在条件下HRP的动力学参数 Table 1 Ki netic parameters of HRP in the presence of Fe304 nanoparticles，MW CNT-AP or Fe304／MW CNT-AP composite TMB is incubated with MW CNT-AP before use． TMB is incubated with Fe304 nanoparticles before use． TMB is incubated with Fe3O ／MWCNT-AP composite before use．【UPd'l=1 nmol·L ，【TMB]：0．5 nunol·L～，[Fe O 】：2．5 gg·mL～，[MWCNT-AP]=0．5 Bg·mL～，pH=4．0 显色反应进行 了一系列动力学实验，定量研究了 MWCNT-AP、Fe O 及 Fe OdMWCNT-AP复合物对 HRP催化能力的影响． 在一定H。0：浓度(25 pmol·L 1条件下，MWCNT- AP、Fe O 及Fe。O ／MWCNT-AP复合物对HRP催化 氧化 TMB的反应速率具有不同的影响(图 l1(a))， 其中Fe，0 及Fe，04／MwCN AP复合物均表现出增 强HRP催化活性的特点．以反应速率的倒数v 对 H 0 浓度的倒数[H：o：] 作图(图l1(b))，结果具有 良 好的线性关系 >0．99)，说 明HRP在酸性条件下 (pH 4．01催化氧化 TMB的过程严格遵守米氏方程． 根据公式(1)可分别计算 出Fe，O 、MWCNT-AP或 Fe，O ／MWCNT-AP复合物存在条件下的HRP酶动 力学参数f表 1)．加入Fe，O 、MWCNT-AP或Fe 02 MWCNT-AP复合物后，HRP的 和 同时发生变 化，说明这些纳米材料的加入改变了HRP的空间构 象，从而影响酶的生物活性． 。 但是HRP的催化效 率和底物专一性常数 ／ 在加入纳米材料前后变 化不大，表明加入纳米材料的加入可以改变化学反 应的速率，而对酶催化反应的平衡点影响不大． 文献 报道，在酸性条件pH=4．0时HRP表现出 最佳的催化活性，此时HRP的最大反应速率 为 7．98×10一 tool·L一 ·S一 ，是 pH=7．0时 v (2．003×10一 tool·L～·S )的3．9倍．相同实验条件下，将TMB预 先吸附于MWCNT-AP表面后 反应的 比在pH 7．0条件时 (5．328x10～tool·L～·S-1)有所下降，可 能是HRP与纳米材料作用后其最佳pH范围发生了 改变． 而将TMB预先吸附于Fe 0 磁性纳米粒子和 Fe，O ／MWCNT-AP复合物表面后，反应的vm 分别 提高了0．53和3倍．文献报道Fe 0 磁性纳米粒子在 高浓度H：o 条件下能模拟HRP酶的生物活性， 但 在我们的实验条件下，即低浓度H 0 条件下，Fe，0 磁性纳米粒子未表现出催化 H O：氧化TMB活性． 说明HRP的活性增强主要来源于HRP与Fe O 磁性 纳米粒子或Fe 0 ／MWCN AP复合物的相互作用． 天然酶独特的高催化活性源 自于它们能够把 底物吸附到其活性中心周围，并就近反应． Fe，o 磁 性纳米粒子与HRP及其底物TMB具有较强相互作 用，可增强 HRP的催化活性． 同时HRP的酶催化 反应过程中，色原底物TMB氧化产物的生成涉及到 自由基对的结合，磁性纳米粒子等外加磁场对 自由 基对的结合速率有较大影响，可进一步提高HRP催 2476 Acta ehys．一Chim．Sin．2011 Vo1．27 化活性． 碳纳米管所具有较大的比表面积更有 利于TMB的吸附，而且碳纳米管负载Fe。O 磁性纳 米粒子后改善了Fe，0 磁性纳米粒子的分散性，能够 吸附更多的TMB到HRP血红素辅基的边缘；结合 MWCNT-AP优良的电子转移能力，从而促进HRP 进一步氧化TMB． 因此碳纳米管负载Fe，O 磁性 纳米粒子形成的复合物Fe，OdMWCNT-AP对HRP 的催化活性影响比单独的Fe 0 磁性纳米粒子要大 很多． 4 结 论 采用共沉淀法制各了Fe 0 磁性纳米粒子，将 Fe O 磁性纳米粒子负载于MWCNT-AP得到分散性 良好的Fe O4／MWCNT-AP复合物，所得到的纳米粒 子具有 良好的超顺磁性．红外及XRD光谱结果表 明，Fe 0 磁性纳米粒子负载于碳纳米管表面．透射 电镜结果进一步表明，Fe，O 磁性纳米粒子多集中于 碳纳米管MWCNT-AP的端部．紫外一可见吸收光谱 说明辣根过氧化酶(HRP)能够与Fe，o 磁性纳米粒 子及Fe OdMWCNT-AP复合物发生相互作用，荧光 光谱结果进一步表明Fe 0 ／MWCNT-AP复合物对 HRP的构象具有较大影响．酶动力学实验结果表明 pH=4．0时，Fe30 磁性纳米粒子及Fe，O4／MWCNT-AP 复合物能使HRP的酶催化反应最大速率( )显著 提高． References (1) Scarberry,K．E．；Dickerson，E．B．；McDonald，J．F；Zhang，Z．J． Am．Chem．Soc．2008，130，10258． (2) Mornet，S．；Vassetlr,S．；Grasset，F；Duguet，E． Mater Chem 2004，14，2161． (3) Polyak，B．；Fishbein，I．；Chorny,M．；Alfefiev,I．；Williams，D．； Yellen，B．；Friedman，G．；Levy，R．J．Proc．Nat．Acad．Sci． ＆ A．2008，105，698． (4) Yang，H．H．；Zhang,S．Q．；Chen，X．L．；Zhuang，Z．X．；Xu，J．G．； Wang,X．R．Anal Chem．2004，76,I316． (5) H A．G．；Yee，G．T．；Lin， B． Am．Chem．Soc．2005，127， 】2486． (6) Tsang，S．C．；Caps，V；Paraskevas，I．；Chadwick，D．；Thompsett． Angew．Chem．Int．Edit．2004，43，5645． (7)Allen，B．L．；Kotehey,G．P-；Chen，Y|；Yanamala，N．V K．； Klein—Seetharaman，J．；Kagan，V E．；Star,A． Am ． Chem．Soc． 2009，131，17194． (8) Yu，X．；Munge，B．；Patel，V；Jensen，G．；Bhirde，A．；Gong，J D．； Kim，S．N．；Gillespie ， J．；Gutkind，J．S．；Papadimitrakopoulos， F；Rusling J．F Am．Chem．Soc．2006，128，11199 ． (9) Chalkias，N．G ；Kahawong，P；Giannelis，E．E 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