多肽净电荷数及等电点的计算

Vol_l6 1 9 9 5年 9月 高 等 学 校 化 学 学 报 CHEM ICAI JOURNAL 0F CHINESE UNIVERSITIE5 No．9 14644 1466 [研究简报] z 一 ，牟 多肽净电荷数及等电点的计算 l； 许 旭 ' __ - -● ●_ _ _一 t中国药科大学药物分析敖研宣，膏京．210009) 罗国安V 林炳承 ‘ 。 ’ 。 - 。 - 。 一 (清华大学化学系) (中国科学院大连化学橱理研究所) 考察多肽在毛细管区带电泳(CZE)中的迁移时，必须知道其在分析条件下的净电荷数． Skoog等“ 发表 的计算多肽 等电点的 Pascal程序为考 察多肽在 CZE中 的迁 移创造 了条 件 ]．但是 ．该程序在计算某些小肽的等 电点时会出现分母为零而无法计算的现象，而且 将其直接用于计算净电荷数也是值得讨论的．文献 仅讨论了pH 2．5时的实验结果．本文 通过对多肽净电荷数的修正．得到 一个可以同时计算多肽等电点和不同 pH下净电荷数的计 算机程序．使计算出的净电荷数与实际值更接近．为进一步研究多肽在CZE中的迁移奠定了 基础． 1 理论基础 多肽的净电荷数实际上是 一个统计值 ，它指的是该物质的所有离子所带有正负电荷 (正 负整数)的算术平均值．由于多肽的各种离子形态处于迅速的离解平衡中．这个统计值可 、 看成是多肽的“表观”电荷数 ，是其在电场中迁移的动力 ，在研究区带电泳的迁移规律时具有 重赛意义．根据酸碱平衡理论 ，可得到不同 pH条件下多肚净电荷数的计算方法[1]．而净 电荷 数为零时所对应的 pH即为该多肽等电点． 2 结果与讨论 文献 编写的计算多肽等电点的程序采用了线性插值法．这对于含可解离基团较多的多 肽(净电荷致一pH关系曲线较平缓)可能是适宜的，但一般来说，用计算法求等电点主要用来 计算较小的肽(或蛋白质)．对于这些肽 ，特别是其中可解离基团较少的肚，其 pH与净 电荷 数的关系衄线呈阶梯状(类似多元酸和多元碱)．这样，有时就会出现两次计算净电荷数相等 而使计算下一个点的净电荷数时出现分母为零的情况 ，影响程序的运行． 为避免这一问题，我们采用一种逐步搜索法 ，即在 pHI 14范围内每隔一定步长(IpH) 计算其净电荷数 ，得到净电荷数最小的 pH．后，在 pH．士1范围内每隔 O．1 pH计算其净电荷 数，得到新的净电荷数最小时的pH ，此后再在 pH 士O．1范围内每隔 0．01 pH计算其净电荷 数．则得到最小净电荷数所对应的 pH。，此值即为所求等电点 pJ．因为净 电荷一pH关系曲线 收稿目j蝈 1 994—09—16．售改稿收剜日期：1 995—05—29 硅景』、t#炳承．第一作者：许 旭 ，男．30岁．博士研究生 国家自播科学基金赞助课题． 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 一 是单调下降的 ，这种方法肯定能求出唯一的结果． 文献 利用自由氨基酸的离解常数作为欲计算多肽中氨基酸残基可解基团的离解常数． 这在计算等电点时可能问题不大，但在计算净电荷时就得讨论 了．已知，在多肽中氨基酸残 基可解离基 团与 自由氨基酸的可解离基团所处环境不 同，其大小也不一样．肽中末端 a— COOH的 p 值比自由氪基酸中的略大，而末端 a-NH：的 pK 值 比自由氨基酸中的略小，R 基的 pJl，值差别不大 这样在计算等电点时末端基团引入的误差相互抵消．所以对结果的 影响不明显．但在计算净电荷时．特别是近离等电点的净电荷数时其误差就 比较 明显了．其 结果是在低 pH时计算的负电荷数偏大而使得到的净电荷数偏小，而在高 pH值时计算得到 的正电荷数偏大则使得到的净电荷数偏大． 根据文献 中提供的数据(表 1中 p ：)，在蛋白质中，可解基团 a—NH：的 pK：为 7．6～ 8．4，n—COOH的 p 为 3．0～3．2．在 肽中，一般 口一COOH的 pK 也在 3．0以上 ，且肽链变 长时，pK 00w有增加的趋势．显然，这时以自由氨基酸的pK 值来计算肽的净电荷数会产生 较大误差．由表 1，可按下式估算肽中 pK：： a-COOH：pK：一3．0+ (3．2— 3．0)[pK F)一 1．7]／(2．4— 1．7) tt-NH2：pK =7．6+ (8．4— 7．6)[p矗 (F 一 8．8]／(10．8— 8．8) 式中 pKk~ )和 pK 分别为自由氨基酸中的 a—COOH和 a—NH 的 p ．对于其它可解 离基团则取表 1提供数据区间的中值-表 1中斜线后为实际所取的中值及由此算得的净电荷 数．显然，在pH=2．5时，除 Asp外，主要误差来源是 pK 一，与表 1比较，此处所取的 pK 值应比自由氨基酸的离解常数(pK {=1．7～2．4)更接近于实际值．即用修正的离解 常数计算多肽净电荷产生的误差较文献【 的方法小． Treble 1 I~．asvdmtlon coastant(pK'．)[ and net charge ealeulatetl of dtssoelmble group in am ine aeld(Ah)aml gro teia(P) * The pK．of the amino acid is about di*aociable group at side chaim 以此修正的数据为基础-编制一个计算等电点(逐步搜索法 )和净 电荷数的程序．为检验 该程序的正确性，采用已知多肽及氨基酸的离解常数 计算它们的等电点与实际值完全相 符，说明程序本身在计算等电点时是没有问题的．用修正的离解常数算得的等电点也与实际 等电点基本相符．这部分内容已纳入毛细管电泳教学软件中 ． 从文献 还可看出，在不同的肽中，同一种氨基酸残基的 pK．删 一般是不同的．显然， 在 同一种肽中同一种可解离基团的两个 (或多个 )基团由于其所处环境不同也会有不同的 p ，所以，想用一套离解常数来计算所有肽的等电点和净电荷数而不产生误差是不可能的， 一 1465 维普资讯 http://www.cqvip.com 只能采用一套带入误差较小的数据，希望在误差不大情况下计算出可以接受的净电荷数． 我们根据以上所得的计算净电荷数的程序．用 IBM—PC 286计算机 ，计算出样品肽的净 电荷数，结合肽的分子量及其在实际 CZE中的迁移率，考察一些肽的迁移 ．与用氪基酸的离 解常数 计算的净电荷致比较，结果明显优于后者 ．并可用于多肽迁移时间的预测 ． 参 考 文 献 Skoog R ，W lchman A．I Trends in Analytica]Chemistry，1986·5(4)：82 Compton B．J．I J．0f Chromatography．1991，559I 357 Ga*B．，Vacik J．，Ze]enaky 1．}J．of Chromatography，1991，5‘5l 225 Compton B．J．．O’GrBdy E．A i A~ lytical Chemlst=y．i991．‘3I 2597 CamUlexl P．．Oka G．N．．Southan C． aL i Analytica]Biochemistry·1991，198I 36 Y~ uyukl Kurosu．Yasuyo s矗to．M aa~aaki SendaI Analytical Scie~ ·1991，7(Supplement)t Z73 Rickard E．C．，strohl M ．M ．，N hen R．G．i Am Lyfi~ l Biochemlst=y， 1991．197I197 XU Xu(许 越1i Thesm of Maste~hip．Chin Phamarceutical Universlry(中国药科大学硕士毕业论文 )，Nalljing， l993 SI-[ENTong(沈 同)，WANG Jlng-Yan(=P幢昔)I 帆hcmbtry(PartA．2rd Ed．1(生物化学，上册 ．第二舨)，Ad— vaneed Educatlon preu ．1990I 12{92‘113 I 197 10 L1N Bing-Cheng(柞炳承)，SH1 Wei(麓 伟)，XU Xu(1弁 ／ml“aL I Software ofCompute：-Asshstant Teaching口n CapiLlary Elecl~-ophoresis(Version 2．01，Datian·1994 Calculation on Isoelectric Point and Net Charge of Peptide XU Xu (Department Pharmaceutical Analysis．China Pharmacewical University．Nanfing．210009) LUO Guo—An LIN Bing—Cheng· (Departmeat Chemistry．Tsing—h=a University) (Da~an Institute Chemical Physics) Abstract This paper shows a improved method using successive search method and adjusted dissociation constant for calculating isoelectric point and net charge at a certain pH of pep— tide。the result calculated is closed to the real value and is useful to study migration of pep— tide in Capillary Zone Electropho resis(CZE)． Keywords Capillary gone electrophorisis，Pegtide，Net charge，Iso electric point (Ed，：U 。S) 维普资讯 http://www.cqvip.com