X-Gal
X-Gal也称5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside,X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物,在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。
分子式为C14H15BrClNO6,分子量为408.63,CAS Number 7240-90-6。
X–Gal是β–半乳糖苷酶(β–galactosidase)的底物,水解后呈蓝色。基于这个特点, pUC系列载体DNA(或其他带有lacZ 基因载体DNA)以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时,如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。
使用方法:
首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存),然后在100 ml的琼脂培养基中,加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG(24 mg/ml)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体),然后转化至lacZ缺失细胞中后,涂布上述的X –Gal、IPTG、Amp平板培养基,可根据长出菌体的蓝白色,而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
注意事项:
◆培养噬菌体时,Top agar中的添加量为:50 μl/3 ml(20mg/ml)。
◆含有X-Gal的培养基4℃避光保存,须在1~2周内使用。
IPTG
中文品名: 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
商品名称: Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside
英文简称: IPTG
产品别名: Isopropyl β-D-Thiogalactoside
产品纯度: Sigma ≥99%, Merck ≥98% ,INALCO≥99%
产品性状: 白色或白色粉末,溶于水后呈清亮无色液体
分子式: C9H18O5S
分子量: 238.30
保存温度: 2-8°C冷藏保存,配制好后保存于-20°C,室温可放置一个月
主要作用:异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用
IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性,当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ 基因载体DNA)以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时,如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外,它还可以作为具有lac或tac等启动子的
表
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达载体的表达诱导物使用。
诱导原理
首先
E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I(图15-4)。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。
其次
在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
使用方法
首先把IPTG配制成24 mg/ml(100 mM)的水溶液,并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中,加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml 的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当DNA片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体),然后转化至lacZ缺失细胞中后,涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基,可根据长出菌体的蓝白色,而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
作用
诱导外源基因的表达,普遍应用于原核表达系统,使其表达量增高,产物稳定,具有易鉴定,易纯化的优点。
为什么选用IPTG作诱导物?
能诱导酶的合成,但又不被分解的分子,称为安慰诱导物(gratuitous inducer)。由于乳糖虽可诱导酶的合成,但又随之分解,产生很多复杂的动力学问题,因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。X-gal(5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷,可被β-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物,因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。为什么选用IPTG 作诱导物?某些诱导物与自然的β-半乳糖苷酶相似,且不能被酶分解,比如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,(isopropylthiogalactoside,IPTG)。不被细菌分不被细菌分解性质稳定,解性质稳定,它的浓度在实验中不会改变。复杂的动力学问题,便于研究。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送。
为什么选用IPTG作诱导物?乳糖(葡萄糖-β-1,4-D-半乳糖苷)? 半乳糖苷键中用硫代替了氧,失去了水解活性,半乳糖苷键中用硫代替了氧失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同,虽不为β-半乳糖苷酶所识的亲和力相同,IPTG虽不为半乳糖苷酶所识虽不为但它是lac基因簇十分有效的诱导物基因簇十分有效的诱导物。别,但它是基因簇十分有效的诱导物。
浙公网安备 33021202002483