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RACE技术.doc RACE技术 RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。 主要分类 一般分5-和3-RACE两种。 3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。 5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 而无需用连接酶加接头。 发展历史 经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等，1995:Schaefer，l995:Chen，1998:Bespalova等，1998:Matz等1999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及 RT-PCR技术的改进: 改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入 两个简并的核苷酸 【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而 消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。 随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进 行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于 MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。 引物设计 基因特异性引物(GSPs)应该是: 1、23,28nt 2、50,70,GC 3、Tm值?65度，Tm值?70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。 7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 8、引物GSP中的GC含量要在50,70,之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。 9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100,200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 11、验证基因特异性引物的对照: 单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合 成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5,12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。 比较与优化 目的:研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。 方法:以播娘蒿RNA为模板，先按文献 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。 结 果:未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带 依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论SMART5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化 条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。 实验步骤 cDNA第一条链的合成: 我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 注意:在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。 cDNA第二链的合成: 第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。 1、建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5,3kb之间。 2、通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。 3、按照程序进行连接反应。 4、如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine,EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。 PCR扩增 进行5’和3’的RACE,PCR扩增。 利用以下的程序进行降落PCR反应: 94度30秒 5个循环: (1)94度5秒 (2)72度4分 5个循环: (1)94度5秒 (2)70度4分钟 20,25个循环: (1)94度5秒 (2)68度4分钟 注意: 我们建议使用降落PCR反应，这就 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 GSP的Tm值?70度。 1、当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。 2、可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2,5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2,3min，对于5,10kb的条带，延伸时间增加到10min。 产物验证 1、应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。 2、有3种验证RACE产物的方法: (1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 (2)Southernblot (3)克隆并测序 3、建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 4、对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。 5、对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。 6、如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。 克隆和测序 1、可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine,EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。2、电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。 3、将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。 4、对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8,10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0,20个碱基。) 5、一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。 cDNA的获得 通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR和克隆的方法。 通过PCR的方法获得全长cDNA: 1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。 2、根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23,28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。 3、进行如下的热循环: 94度30秒 25个循环: (1)94度5秒 (2)72度2,15分钟 4、延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带，用6，2,8分钟的延伸时间。注意:如果没有条带或者条带弱，增加5个循环;或者优化PCR的条件。 5、在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 6、制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer，TBE的胶很难 制备全长的cDNA。 7、将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。 8、利用长波紫外观察cDNA(?300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。 9、利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine,EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。 10、将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。 通过克隆产生全长的cDNA: 1、如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。 2、利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。 3、在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。