FITC标记蛋白

FITC标记蛋白FITC标记蛋白基本原理：蛋白质分子的赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC发生亲核反应，形成硫脲连接而共价结合，形成的偶联物的稳定性很好。该偶联反应在pH 9.8条件下进行。试剂及仪器：待偶联蛋白质，PBS，FITC，叠氮钠，碳酸氢钠缓冲液：25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3缓冲液pH9.8 (新鲜配制录) 电磁搅拌器铝铂操作步骤：用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；...

FITC标记蛋白基本原理：蛋白质分子的赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC发生亲核反应，形成硫脲连接而共价结合，形成的偶联物的稳定性很好。该偶联反应在pH 9.8条件下进行。试剂及仪器：待偶联蛋白质，PBS，FITC，叠氮钠，碳酸氢钠缓冲液：25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3缓冲液pH9.8 (新鲜配制录) 电磁搅拌器铝铂操作步骤：用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光，4℃搅拌过夜；上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。其间至少更换PBS液三次，直致480nm 的吸收为零；加入0.5g/L 的叠氮钠。此后，结合物在4℃避光保存，或分装后在－2０℃冻存。荧光偶联质量的检测：用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定：取结合物液0.2ml，加PBS 2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，查 FITC标志曲线得其浓度μg/ml值，按IgG的消光系数（mg/ml约A280 1.2）,可计算其F/P值，即每mg抗体所标记的μgFITC的比值，可以此鉴定及比较各批标记物的质量。实验要点及说明：偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）； FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为0.3－1.0； FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰。

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