巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展pdf

巴氏毕赤酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统的研究进展pdf 江苏农业科学2012年第40卷第3期 一35一 姚 晶,吴正钧,任 婧〃巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展[J]〃江苏农业科学,2012,40(3):35—38 巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展 姚晶1’。,吴正钧2,任婧1 (1〃乳业生物技术国家重点实验室,光明乳业股份有限公司技术中心,上海200436;2〃上海海洋大学食品学院,上海201306) 摘要:巴氏毕赤酵母表达系统具有优良的特性,是目前广泛应用的微生物表达系统之一,它在理论研究和实践应 用上尤其是在大规模发酵中具有重要的意义。本研究综述了巴氏毕赤酵母的生物学和遗传学特性,详细阐述了巴氏 毕赤酵母表达系统的组成以及影响外源基因表达的因素,并提出了一些提高表达量的方法。 关键词:巴氏毕赤酵母;表达系统;表达;影响因素 中图分类号:Q786 文献标志码:A 文章编号:1002—1302(2012)03—0035—04 随着分子生物学理论研究的不断深入,分子生物学技术 得到了快速发展,与此同时,构建的不同表达系统也层出不 穷。 巴氏毕赤酵母(Pwhiapastor括)是1969年由Ogata等首次 发现 的,并于20世纪80年代迅速发展为一个新兴的表达系 统 。巴 氏毕赤酵母表达系统具有优势的生物学和遗传学 特性,和大肠埃 scherwhm 希菌(E coli)、酿酒酵母(Saccharo— m，，凹s cerev西 iae)等传统表达系统一样,被广泛用于外源基因 的表达。 1巴氏毕赤酵母的特性 巴氏毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。甲基营养型酵母 1一醇氧酶;2一过氧化氢酶;3一甲醛脱氢酶;4一甲 是指一类可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的 酵母酸脱氢酶;5,二羟丙酮合成酶;6-二羟丙酮激酶; 菌,主要包括:汉逊酵母属(Hansenula)、念珠酵母属 7—1,6一二磷酸果糖醛缩酶;8一果糖一l,6〃二磷酸化(Candida)、球拟酵母属(,删掣蠡)、克勒克酵母属(K如酶; eck— 9一甲醛还原酶 em)以及毕赤酵母属(Pwhia)等。现研究证实,可作为表达 外源蛋图1 巴氏毕赤酵母中甲醇的代谢途径 白的宿主菌的主要是巴氏毕赤酵母(P〃pastoris)和多 形汉逊酵环,而GAP有1,3进入主代谢途径,用于合成其他物质。 母(H polymorpha)旧o。甲基营养型酵母的甲醇代 谢途径与甲醇从图1中可以看出,在甲醇代谢途径中,涉及到多种酶, 氧化机制非常相似,图1为甲醇在巴氏毕赤酵 母中的代谢过程睁 这些酶都是由染色体上的有关基因编码表达的。巴氏毕赤酵 1,甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能 源的培养基中生长,母染色体内含有甲醇代谢必需的关键调控酶——醇氧酶(al- 因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需 酶,如醇氧化酶(AOX)、 eohol oxidase,AOX)基因,它可以产生2种酶——A0x 1和 二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等,其 中AOX是甲醇酵母代谢途径 AOX 2。当葡萄糖、甘油或乙醇等作为碳源时,AOX几乎不表 达,中的第1个酶,它催化甲醇被氧 化为甲醛和过氧化氢,过氧化氢 进一步研究表明AOX的表达受转录水平调控,强诱导型 启动子进一步由过氧化氢酶分解成 水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶 Paox能有效控制AOX表达H1。最近有研究报道,将 顺式元件与原(FMD)和甲酸脱氢酶 (FMDH)氧化成CO:,或者在5一磷酸木酮糖 始启动子连接成新型的人工启动子,可以提高 外源蛋白的产量和(Xu5P)、二羟丙 酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP) 活性?1。此外,甲醇代谢所需的醇氧化酶 被分选到过氧化物酶和二羟 丙酮(DHAP);DHAP与GAP在1,6一二磷酸果糖醛缩酶作 (pero】【isome)体中,形成区域化:在以葡 萄糖作碳源时,菌体用下形成果糖一1,6一二磷酸(FBP);FBP又经1,5一二 磷酸果 中只有1个或几个很小的过氧化物酶体; 而在以甲醇作碳源时,糖酶去磷酸化生成Xu5P和GAP;Xu5P又一次参加循 过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积 的80,,因此,当在AOX基 因前利用同源重组方式插入外源 蛋白基因时,可获得大量表达怕 1。在构建表达菌株时,AOX 的1个或2个基因的缺失就会导致菌收稿日期:2011—05一09 株对甲醇利用能力的改 变,根据菌株的基因型可将毕赤酵母分成基金项目:国家‚973?计划(编号:2010cB735705);上海市科委课题 3种表型:(1)甲醇 快利用型菌株(Mut+),它含有AOX J基因,能(编号:09DZ2251400)。 够快速利用甲 醇作为碳源和能源,以野生型速率生长;(2)甲醇慢作者简介:姚晶(1987一),男,江苏宜兴人,硕士研究生,主要从事食 品生物技术研究。E—mail:yawin905@sina〃com。 利用型菌 株(Mut8),它虽然不含有AOX J基因,但含有AOX2基 通信作者:任 婧,博士,主要从事乳酸菌分子生物学研究。E— 因,能 缓慢利用甲醇;(3)甲醇不利用型菌株(Mut一),它与AOX J mail:叫ing@bnghtdairy(corn。 万方数据 一36一 江苏农业科学2012年第柏卷第3期 和AOX2基因同时缺失,不能在甲醇培养基中生长。 2巴氏毕赤酵母表达系统 飞 2〃1宿主菌株 巴氏毕赤酵母是DNA转化的宿主菌,该体系以巴氏毕赤 酵母缺乏组氨酸脱氢酶的营养缺陷突变株为基础。如表1所 } 示,目前用于外源基因表达的巴氏毕赤酵母菌株为Invitrogen ? 公司构建,主要有X一33、GSll5、KMTI和SMDll68等,用得 l 较多的是巴氏毕赤酵母GSll5,它们都是由原始菌株巴氏毕 , 赤酵母NRRLY一11430衍变而来的?o。SMDll68菌株为蛋 0(? 白酶缺陷型菌株,这类菌株基因组中缺失编码蛋白酶A (PeP4)和 编码蛋白酶B(prbl)的基因。蛋白酶缺陷型菌株减 弱了蛋白酶对 外源蛋白的降解作用,特别适用于分泌型表达。 GSIl5、KM71菌图2巴氏毕赤酵母表达mItpA0815一切圈谱 株均为组氨酸脱氢酶基因缺陷型菌株 (his4),培养基中必须含有裹2几种常见的巴氏毕赤酵母寰达藏体 组氨酸才能生长,利用这一特性可 以在无组氨酸的葡萄糖基础培表达载体 表达类型 标记基因 mecli—养基(minima]dextrose ttm,MD)上筛选阳性转化子。 胞内 掘‘ pP]cz 胞内^V pPIC6 胞内h,s4〃amp’ pAOSl5 裹1几种常见的巴氏毕赤酵母寰达菌株豆其基因型和表型 分泌 掘7 pPlCZcx 菌株 基因型 表型 pPIC9K 分泌抽4〃^?’ GSll5 Ah,s4 Mut+〃His— 分泌6W pPIC6a KM71 ,,h,s〃aozl::AR9〃4,d讲 Mut‘。His— aox好地保持目的蛋白的生物学活性。 1::ARG4，耐 KMTlH Mut‘ ddds4,d粥P4 Mut+〃His一〃Pep4一 SMDll68 ? 3表达的影响因素 蜊 SMDll68H Mut+,Pep4— 巴氏毕赤酵母表达系统之所以能够高效地表达外源基 2〃2表达戢体 因。与其独特的生物学和遗传学特性是分不开的。与开发最 巴氏毕赤酵母胞内没有天然质粒,表达载体需要和宿主 早最普遍应用的大肠杆菌表达系统相比,巴氏毕赤酵母表达 菌染色体进行同源重组,从而达到外源基因在宿主菌中进行 系统产量高,产物纯化简单,且生物学活性好;与最早开发的 异源表达的目的。为了达到这个目的,选择的表达载体一般 酵母类表达系统——酿酒酵母表达系统相比,它营养要求低, 为整合型载体?】。表达载体都是穿梭质粒,能够穿梭于大肠 重组子稳定性好,且含有严格的甲醇诱导表达机制的相关基 杆菌和巴氏毕赤酵母之间〃包括启动子、克隆位点、终止序列 因〃表达效率高? 。目前,已有数百种外源蛋白在巴氏毕赤 和筛选标记等,图2为InviUogen公司构建的一种商品化表达 酵母表达系统中成功表达,表3列举了几种近几年在巴氏毕 载体pA0815,它和pPIC9、pPiC9 K等表达载体一样。含有强 赤酵母表达系统中成功表达的外源蛋白。虽然巴氏毕赤酵母 诱导表达的启动子P 筛选标记基因H,s4以及整合到宿主 表达系统具有高效表达外源基因的能力,但并不是每个实验 菌染色体靶位点的3’AOX J序列;此外,pA0815还有多个插 室构建的表达系统都能够高效表达,它受影响的因素较多。如 人位点,而且可以控制目的基因的拷贝数。表2是巴氏毕赤 外源基因、分泌信号、翻译后修饰、培养条件等因素都会对其 酵母常用表达载体的信息,根据表达载体的表达方式可以分 高效表达产生影响。 为分泌型表达载体(如pPICgK)和胞内型表达载体(如 表3近几年在巴氏毕赤酵母中裹达的外蠢叠白【?一‘ pAOSl5),这2种表达载体的基因组件虽然各有特点〃但还是 具有一些共同的序列〃如这些载体都包括一个表达盒(c挣 sette)和一个多克隆位点,表达盒由900 bp的5’AOX J序列和 约300 bp的3’转录终止序列组成。 2〃3 巴氏半赤酵母表达系统的特点 巴氏毕赤酵母表达系统具有较 多优点[91:(1)营养要求 低,生长周期短,适合高密度培养,成本低廉;(2)胞内存在合 3〃1外濠基因 成过氧化酶的微体,有利于外源基因的表达,且避免了产物蛋 白 外源基因是通过表达载体整合到巴氏毕赤酵母的染色体 的损失;(3)含有甲醇诱导机制的相关基因(如强诱导性启 动子 上的,因此,其自身的结构性质是外源基因在巴氏毕赤酵母表 P〃帆),对外源基因的表达严格调控;(4)同源重组后形 成十分 达系统中高效表达的重要影响因紊。外源基因AT含量过 稳定的重组子。有利于外源基因过量表达。目的蛋白产 量较高; 高,常常导致翻译表达过程提前终止,使其不能有效表达;相 (5)拥有真核生物对产物蛋白的修饰加工功能,能更 反。GC古量过高〃特别是在mRNA 5’端翻译区,容易导致翻译 万方数据 姚 晶等:巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展 一37一 能障过高，翻译过程不III顷利进行，进一步导致表达量减少; 大影响‘24“。。另外，培养基的碳源及其浓度也对巴氏毕赤酵 另外，mRNA 5’端非翻译区序列的结构和长度也会对外源基 母表达系统有较大影响。在毕赤酵母表达体系中、，混合碳源 因的有效表达产生影响?。1 。因此，可以通过调整外源基因 流加策略被逐渐采用，甘油、山梨醇等碳源和甲醇的混合添加 的AT和GC含量，使之顺利表达。此外，选择的外源基因应 可以提高细胞活力，增强醇氧酶活力，提高毕赤酵母表达外源 尽量避免稀有密码子，尽可能含有巴氏毕赤酵母偏好的密码 蛋白效率，其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著?“， 子，这样可以提高翻译效率，从而增加表达量。1“。如人类葡 如利用山梨醇与甲醇的混合流加生产碱性果胶酶，酶活性和 萄糖脑苷脂酶基因在巴氏毕赤酵母中表达时，通过优化密码 生产强度比对照分别提高了84(6,和45(2,，实现了碱性果 子和调整GC含量，其产量分别增加了10(6、7(5倍‘1 。基因 胶酶的高效生产、2 。此外，诱导剂浓度及添加时机、方式直 剂量也会对外源基因的表达产生影响，基因剂量就是指外源 接关系到外源基因的高效表达，也关系到所产蛋白中完整蛋 基因在巴氏毕赤酵母表达系统中的拷贝数。在一般情况下， 白的含量‘ 。 表达量和基因剂量呈正相关关系;也有研究报道，一些基因的 巴氏毕赤酵母表达系统最大的一个弱点是存在降解表达 在单拷贝时可以达到最大表达，而随着拷贝数的增加，表达量 反而减少?。，这可能是随着拷贝蛋白的蛋白酶。不少学者对发酵过程中的蛋白酶进行了监 制调控的结果。数的增加而产生的负反馈机 测，Wu等认为总蛋白酶活性随着发酵过程的推移不断增 强?1;Wang等在开始用甘油培养时没有发现蛋白酶活性，而 一般来3(2分泌信号 当用甲醇诱导培养时发现，蛋白酶活性迅速上升并维持在一 说，为了更加方便获得巴氏毕赤酵母表达系统的 定水平‘3 。因此，如何控制蛋白酶的降解和表达蛋白的稳定 表达蛋白，都期望表达蛋白可列举的几种分泌型表达载体构建的表达系统，他们以分泌到环境中。如表2中所 是培养过程中须要密切关注的问题。首先，培养基组成与蛋 利用自身 白酶的产生有很大的关系，在合成培养基中，氮源的缺乏往往 的分泌信号就可以将表达分泌至胞外。而对于自身没有分泌 伴 信号的表达系统，就需要选择一些合适的分泌信号;如果选择 足的培养基上培养，随着蛋白酶活性的增加，可以在天然培养基或者氨基酸富 这样既可以避免氮源的缺乏，又可以通过 的分泌信号不合适，会导致表达蛋白分泌量的减少，甚至不分 培养基中充足的酶解底物抑制蛋白酶 泌，另外还会对目的蛋白的正常翻译产生不利影响。因此，可 。其次，培养温度也会影响表达蛋白的稳定性及的活性，获得较高的产量口“以通过优化信号肽密码子、适当地增加氨基酸和改造表达载体信号 达效率。Jahic等在研究中发现，虽然较低的温度能显著限制 诱导表肽，将表达载体改造为新的表达载体，如谢涛对 菌体的生长，但是此时蛋白酶的活性最低，同时AOX的活性 pPIC9K中d因子信号肽进行密 码子的优化改造时，人工合成 新的信号肽MS，构建了新型酵母表达载体增强，表达蛋白的产量增加了1倍日“。同样，pH值也影响着构建的2株不同植酸酶工程菌表达量就出发菌株在BMGY,pPIC9K—MS，其 值蛋白酶的活性和表达蛋白的稳定性。根据研究报道，在pH(81、1(51倍旧“。BMMY培养基中分别提高了25(5,8(o时，蛋白酶的活性最低，同时表达蛋白稳定性也 能维持在较高3(3翻译后修饰水平’3 。另外，在培养体系中加入蛋白酶抑制 剂也是控制蛋白酶降解的有巴氏毕赤酵母表达系统能进行与高等真核细胞相似的许效手段。Sinha等在培养体系中分 别加入了1 mmol,L丝氨酸蛋白酶抑制剂——1苯甲基磺酸氟、 多翻译后修饰，包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、脂类添 mmol,L的EDTA及1 mmo],L苯甲基磺酸氟和1 加、0一连接糖基化和N一连接糖基化等，通过翻译后修饰，mmol,L MEDTA的混合物，其总蛋白酶活性分别降低了78,、45,、 表达蛋白才具有生物学活性。翻译后修饰是对表达蛋白分泌 94(2,[34]( 前很复杂的加工过程，其中包括一系列酶促反应，保证修饰过 程的顺利进行是 4结语 稳定表达蛋白高水平表达的先决条件。2“。 如毕赤酵母对产物蛋白过度糖基化加工，会导致产物产量和 活性的降低，为了避免过度糖巴氏毕赤酵母表达系统作为新兴的表达系统，已经广泛基化位点、将目的蛋白质与糖苷酶共同表达、构建重基化，可以通过定向突变去除糖 地用于多种蛋白的高效表达，它既具有原核表达系统的操作组基因 简单、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具 库、改变培养基、在体内用衣霉素抑制糖基化及用酶对重组蛋 有真核表白质去糖基化等手段避免目的产物过度糖基化口“。 蛋白磷酸化等;同时它还避免了酿酒酵达系统的对外源蛋白翻译后修饰等特点，如糖基化、母的分泌效率差、表达 3(4培养条件和其他表达系 菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，在分子生物学、微生 统相似，培养条件对于巴氏毕赤酵母表达 物学等多个领域中发挥了重要的作用。随着对巴氏毕赤酵母 系统高效表达有着举足轻重的影响。在大规模生产目的蛋白 时，往往是利用发酵罐进行高密度连续培养，因此，通过对表达系统研究的不断推进，将有越来越多的外源基因在巴氏 发 毕赤酵母表达系统中成功高效表达，在分子生物学、微生物 酵条件的优化，可以达到实际的最高产量。温度、pH值、溶氧 量等因素直接或者学、医学等相关领域及工业化应用中发挥出更大的作用。间接影响菌体生长。例如巴氏毕赤酵母的 参考文献: 最佳生长温度为30?，而有报道称15?的诱导温度可以有 效提高外源蛋白的产量，另外，较低的温度可以降低蛋白酶的RP,ch,a [1]Siegei S〃Methylotroyphic yeast pastour produced in hiish cell 活力，从而增fermentation withcellforas加目的蛋白的产量;巴氏毕赤酵母的最佳生长 density hi【gh yields vehicle recombinant pH值为3,7，如果培养基的pH值and不在这个范围内，虽然对 protein production[J](Biotechnology Bioegineering,1989,34: 403—404〃 菌体生长没有很大影响，但是对蛋白的稳定性及其活力有很 万方数据 一38一 江苏农业科学2012年第40卷第3期 Fcodonbias and theJin them一 [19]Sinclair G,Choy Y〃Synonymous usage expres— [2]Cereghino L,Cregg J M。Heterologous protein expression MicrobiolinPichiasion of human ethylotrophic yeast pastoris[J]〃FEMS Rev,2000, glucocerebresidase themethylotrophic yeast,Pichia 24(1):45—66〃pastoris[J]〃Protein Expr Purif,2002,26(1):96—105〃 Mpastoris of threeforsecre— [3]Qureshi S〃利用pH和甲醇在线控制策略促进Pichia [20]Murasugi A,Tohma—Aiba Y〃Comparison signals humanof recombinantmidkine in Pichia GSll5发酵生产碱性果胶酶[D]〃无锡:江南大学,2009〃tory expression pastoris anda1〃Use of 『4]Xie J L,Zhou Q w,Du P,et [J]〃Bioscience Biotechnology Biochemistry,2001,65(10): different carbon sources in for Pichia angiostatin production cultivation of recombinant pastoris 2291—2293〃 Microb[J]〃Enzyme Technd,2005,36(2,3):210—216, [21]谢涛〃表达载体信号肽改造提高毕赤酵母植酸酶phyA基因表 Fa1〃Promoter[5]Ha〃,恤er S,Ruth C,Langenegger D ,et library designed 达量研究[D]〃雅安:四川农业大学,2006〃 Acids ATPichia for fine—tuned in of pastoris[J]〃Nucleic [22]Viilatte F,Hussein S,Bachmann T,et al。Expression gene expression level isflaskheterologous proteins in Pichia pastoris influenced by design Res,2008,36(12):e76〃 J CRand[6]Scorer A,Buckholz G,Clare J,et a1〃The intraeellular produc— [J]〃Applied Microbiology Biotechnology,2001,55(4):463 and tion secretion of HIV—I in the—465〃 envelope protein methylotrophie yeast Pichiapastoris[J]〃Gene,1993,136(1,2):111—119〃 [23]顾园,诸欣平,王少华〃毕赤酵母表达蛋白质的糖基化[J]〃生 K[7]Barr A,Hopkins S A,Sroekrishna K〃Protocol for efficient secretion 命的化学,2004,24(4):353—355〃 andof HSA from Pichia Ya1〃Inhibitiondeveloped pastoris[J]〃Pharm Eng,1992, [24]Wu D,Hao Y,Chu J,et ofdegradation aggrega— tion of recombinant human consensus interferon?-ot mutantex-- 12:48—51〃 conditions for the in Pichiawithmediumin[8]Shi X,Karkut T,Chamankhah M,et a1〃Optimal pressed pastoris complex bioreactor[J]〃 in PichiaofMicrobiolaexpression single—chain antibody(scFv)gene pastoris Appl Biotechnol,2008,80(6):1063—1071〃 recombinant a1〃Production of[25]Siren N,Weegar J,Dahlbacka J ,et [J]〃Prot Exp Pur,2003,28(2):321—330〃 HIV一1 Pichiaand a ARlevelaNef(negativofactor)protein using pastoris [9]Xiong S,Yao Q H,Peng H,et a1〃High expressionof syn— Bio? fed—batchthetie in strategy[J]〃Biotechnol Appl low—temperature gene encoding Peniophora lycii phytase methy lotrophic yeast Pichia pastoris[J]〃Appl Microbiol Biotechnol,2006,72(5):1039 chem,2006,44(Pt3):151—158〃 Acontrol of —1047〃 [26]Jahic M,Gustavsson M,Jansen K,et a1〃Analysisand M〃Methods in MolecularV01〃389 Pichiain P,ch,afed—batcha Biology protocols proteolysis of fusion protein pastor,s processes [10]Cregg J [J]〃J Biotechnol,2003,102(1):45—53〃 [M]〃2nd ed〃Totowa:Humana Press,2007:1—10〃 La1〃Maximization ofofand se—[27]Zhang W,Sinha J,Smith A,et production creted [1 1]S6mehez—Venegas J R,Navarrete A,Dinamarca J,et a1〃Cloning ofin Pichiafed——batch fermenta-- antarctica Cu,Znconstitutive expressionrecombinant proteins pastoris Deschampsia superexide dismutase inRestion[J]〃Biotechnol Pros,2005,21(2):386—393〃 Pichiap?toris[J]〃BMC Notes,2009,2:207〃 andDof (28]汪志浩,张东旭,李江华,等〃混合碳源流加对重组毕赤酵母生产 [12]Wang J,Edmoodson E〃Hi曲一level expression purification Pichia碱性果胶酶的影响[J]〃生物工程学报,2009,25(12):1955 rat monoamine oxidase A(MAO A)in pastoris:comparison with human MAO —1961〃 A[J]〃Protein Expr Purif,70(2):21l一217〃 ofsecre— andon[29]Khatri N K,Hoffmann F〃Impact methanol concentration [13]KotakeT,KitazawaK,TakataR,etal〃Molecular cloning expres- recombinant sion in Pichia oflacteusted incultures ofapastoris Irpex exo—beta一(1q)一rgalac— tanase pmtein production oxygen—limited BiotechnolPichiapastoris[J]〃Biotechnol Bioeng,2006,93(5):871—879〃 gene[J]〃Biosci Biochem,2009,73(10):2303 mero- [30]WangJ,Ngnyen V,Glen J,et a1〃Improvcdyield ofrecombinant —2309〃 surfacePichiaofthezoite protein 3(MSP3)from pastoris using chemically [14]BasantaA,G6mez—Sala B,S6nchez J,etal〃Use yeastPichia pastoris as an host for secretion of enteroeinleader- defined expression L50,a media[J]〃Biotechnol Bioeng,2005,90(7):838—847〃 DEof mouseless andfrom Enterococcas [31]Choi B,Park Y〃Enhanced production o【一amylase by two—peptide(L50A ISOB)bacteriocin infed—batchculture andEnvironmentfeeding combined nitrogen and carbon sources faecium L50[J]〃Applied Microbiology,2010,76 ofrecombinantPichiapastoris[J]。Proc Biochem,2006,41(2):390 (10):3314—3324〃 of leader—less —397〃 [15]Maresova H,Markovd Z,Valesovd R,et a1〃Heterologous expression limited fed— in Pichiaof [32]Jahic M,Wallberg F,BoHok M,et a1〃Temperature pga gene pastoris:intraceUular production for control ofinbioreactor Pichia prokaryotic enzyme[J]〃BMC Biotechnol,2010,10:7〃 batch technique preteolysis pastoris LI,Yik FforexpressionCellcultures[J]〃Microb [16]Ling Y,Ithoi M〃Optimization high—level in Pichia Fact,2003,2(1):6〃 fullrecom— secretion pastoris and purification of truncated and lengtll [33]IdirisA,TohdaH,KumagniH,etal〃Engineering ofprotein binant SAG2 offorandin Mi— onToxoplasma gond ii diagnostic use[J]〃South— yeast:strategies impact protein production[J]〃Appl crobiol eastAsian J Med PublicBiotechnol,2010,86(2):403—417〃 Trep Health,2010,41(3):507—513〃 Ba1〃Causes ofgenenumber [34]Sinha J,Plantz A,Inan M,et proteolytic degradation [17]MansurM,Cabello C,HemgmdezL,et a1〃Multiple copy insulin of secretedinenhances precursor secretioninthe yeastPichiapastoris[J]〃 recombinant proteins produced methylotrophie yeast Pichia witllovine interfeYon—T Biotechnology letters,2005,27(5):339—345〃 pastoris:case study recombinant of EGF and HIVell— [18]Clare J,Scorer C,Buckholz R,et a1〃Expression [J]〃Bioteehnol Bioeng,2005,89(1):102—112〃 Molvelope glycoprotein[J]〃Methods Biol,1998,103:209—225〃 万方数据 巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展 作者: 姚晶， 吴正钧， 任婧 作者单位: 姚晶(乳业生物技术国家重点实验室/光明乳业股份有限公司技术中心,上海200436;上海海洋大学食品学 院,上海201306)， 吴正钧(上海海洋大学食品学院,上海,201306)， 任婧(乳业生物技术国家重点实验 室/光明乳业股份有限公司技术中心,上海,200436) 刊名: 江苏农业科学 英文刊名: Jiangsu Agricultural Sciences 年，卷(期): 2012,40(3) 被引用次数: 3次 1.Siegei R S Methylotroyphic yeast Pichia pastour produced in high cell density fermentation with high cell yields as vehicle for recombinant protein production 1989 2.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(01) 3.Qureshi M S 利用pH和甲醇在线控制策略促进Pichia pastoris GSl15发酵生产碱性果胶酶 2009 4.Xie J L;Zhou Q W;Du P Use of different carbon sources in cultivation of recombinant Pichia pastoris for angiostatin production 2005(2/3) 5.Hartner F S;Ruth C;Langenegger D Promoter library designed for fine-tuned gene expression in Pichia pastoris[外 文期刊] 2008(12) 6.Scorer C A;Buckholz R G;Clare J J The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris 1993(1/2) 7.Barr K A;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 8.Shi X;Karkut T;Chamankhah M Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody(scFv) gene in Pichia pastoris 2003(02) 9.Xiong A S;Yao Q H;Peng R H High level expressionof a synthetic gene encoding Peniophora lycii phytase in methy lotrophic yeast Pichia pastoris 2006(05) 10.Cregg J M Methods in Molecular Biology Vol.389 Pichia protocols 2007 11.Sátnchez-Venegas J R;Navarrete A;Dinamarca J Cloning and constitutive expression of Deschampsia antarctica Cu/Zn superoxide dismutase in Pichia pastoris[外文期刊] 2009 12.Wang J;Edmondson D E High-level expression and purification of rat monoamine oxidase A (MAO A) in Pichia pastoris:comparison with human MAO A 13.Kotake T;Kitazawa K;Takata R Molecular cloning and expression in Pichia pastoris of a Irpex lacteus exo-beta-(1?3)-galactanase gene 2009(10) 14.Basanta A;Gómez-Sala B;Sánchez J Use of the yeast Pichia pastoris as an expression host for secretion of enteroein L50,a leaderless two-peptide (L50A and L50B) bacteriocin from Enterococcus faecium L50 2010(10) 15.Maresová H;Marková Z;Valesová R Heterologous expression of leader-less pga gene in Pichia pastoris:intracellular production of prokaryotic enzyme[外文期刊] 2010 16.Ling L Y;Ithoi I;Yik F M Optimization for high-level expression in Pichia pastoris and purification of truncated and full length recombinant SAG2 of Toxoplasma gond ii for diagnostic use 2010(03) 17.Mansur M;Cabello C;Hernández L Multiple gene copy number enhances insulin precursor secretion in the yeast Pichia pastoris 2005(05) 18.Clare J;Scorer C;Buckholz R Expression of EGF and HIV envelope glycoprotein 1998 19.Sinclair G;Choy F Y Synonymous codon usage bias and the expression of human glucocerebrosidase in