【word】 罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究

【word】 罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究 罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究 山地农业生物29(5):419,423,2010 JournalofMountainAgricultureandBiology 罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究术 徐国瑞,刘济明,闫国华,李敏进,何绪,徐雪娇 (贵州大学林学院,贵州贵阳550025) 摘要:研究了直接浸提法与Arllon法从罗旬小米核桃叶片中提取叶绿素的效率,并比较了两种方法的优劣.结 果表明:用丙酮,乙醇浸提法提取叶绿素的效率比丙酮,乙醇Arnoll法高,以乙醇与丙酮体积比1:l的混合溶液为 浸提剂时,叶绿素浸提效率最高;分别在温度5O?,料液比l:50,浸提5h的条件下浸提效果最好;在温度为5O?, 液料比为1:40的条件下提取6.5h,叶绿素的提取效率最高,且3个主要因素对浸提结果影响次序依次为:浸提温 度>浸提时同>浸提料液比. 关键词:罗句小米核桃;叶绿素;提取方法;正交试验 中图分类号:Q94-336文献标识码:A文章编号:1008—0457(2010)05-o419—05 QuantificationMethodsofChlorophyllfromJuglansregiaL.f.1uodianen~e XUGuo—rui,LIUJi—ming’,YANGuo—hna,LIMin-jin,HEXu,XUX~e-j iao(CollegeofForestry,Guizhou University,GuiyangGuizhou550025,China) Abstract:r0optimizetheextractionefficiencyofchlorophyllfromJug/a,~re6SaL.f.1uodianenseIauetXu. thedirectextractionmethodandAI’nonmethodwerecomparedinthepresentwork.111eresultsshowedthat theextractionefficiencyofacetone—ethanolmethodwasbetterthanthatofA nionmethod.nIemostefficient exlmctionofchlorophy1]wasobtainedfromthesolutionofethanolandacetonewhenthevolumeratiois1:1. Thebestextractionconditionswere50?,1:50ofsofidtoliquidratio,and5hof extraction.However, 50~C,l:40ofsolidtoliquidratio,and6.5hofextractiongavethehighestyield.eorderofthreemnln flactofsaffectingextractionwereasfo? OWS:extractiontemperature>extractiontime>extractionliquidratio. Keywords:Juglansregi~L. ,luodianenseIjuetXu;Chlorophyll;extractionmethods;Orthogonaltest 叶绿素是植物叶片进行光合作用最重要的物质之一,其素含量是反 映植物光合作用能力的重要指标. 针对叶绿素含量测定,国内外进行了诸多相关的研究:1941年 Mackinney提出用丙酮法提取叶绿素uJ,其 观点于1949年被Anion解释和推导,并作为Arnon法在世界广泛应用至今J.该方法提取叶绿素步骤繁 琐,工作量大,且在提取过程中易损失样品,叶绿素受光氧化而引起测量误差J.因此,有人对此方法进行 修改,但由于提取不完全,效率低和提取液不稳定而未广泛采用;Hiscox&Israelstan用二甲基亚砜 (DMSO)直接浸提植物叶片叶绿素J,省略了Arnon法研磨和去渣的步骤,但需要在65?下浸提,叶绿素 会受到一定程度的破坏.对不同配比的丙酮,乙醇和水的混合液的浸提效果的研究证明了利用混合液进 行叶绿素浸提的可行性.洪法水等研究表明,丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应…,且两者 在等摩尔混合时提取效果最好;而彭运生和刘恩以及刘绚霞等研究认为,丙酮乙醇(2:1)混合液浸提叶绿 素效果较好川. 收稿日期:2010—0r7—27:修回日期:2010—09-23 基金项目:”十一五国家科技支撑 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 课题(2006BAC01A09—2) 作者简介:徐国瑞(1986一),男,河北邢台人,硕士研究生.研究方向:保护生物学. }通讯作者:刘济明,博士,教授,硕士生导师.研究方向:植物生态学.E—marl:kars10623@163.corn 420山地农业生物2010钷 罗甸小米核~.(JuglansregiaL.fluodialwnseLiuetXu)生长于贵州喀斯特地区罗甸县董王乡,生境 特殊,分布分散,具有”缝合线浅,壳薄(手捏即开),能取整米,果仁饱满,颜色浅,无涩味,风昧香,口感好, 营养丰富,出仁率高,出油率高”等特点.罗甸小米核桃的叶绿素含量测定是展开光合生理等相关研究的 基础.本文在前人研究基础上,进一步探讨罗甸小米核桃叶绿素含量测定各方法的优劣及快速测定的步 骤,为其叶绿素含量批量样品测定提供依据. 1材料与方法 1.1材料 于贵州省罗甸县董王乡采集罗甸小米核桃种子,将其种在贵州大学林学院苗圃内,待核桃长成幼树 时,均匀采集核桃叶片作为试验材料. 1.2浸提法与Amon法比较 80%丙酮浸提法;95%乙醇浸提法;丙酮,乙醇和水的体积比4.5:4.5:1溶液浸提法;无水丙酮与无水 乙醇等体积混合浸提法.与Arnon法进行比较,选出对罗甸小米核桃叶绿素浸提最为充分的方法. 1.3混合液法 将乙醇和乙醇+丙酮按以下体积比例混 合:0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9和1,最终找 出二者最佳混合比例. 1.4单因素试验和正交试验 选取影响提取叶绿素浸提效率的3个主要因素液料比(g/mL),浸提温度(oC)及浸提时间(h),根据 这3个因素进行单因素试验和正交设计试验.单因素试验设计如下: A.在温度为5OqC和料液比为1:50的情况下,研究不同时间梯度对叶绿素浸提量的影响. B.在浸提温度为5O?和浸提时问为5h的情况下,研究不同料液比梯度对叶绿素浸提量的影响. C.在浸提时问为5h和浸提料液比为1:50的情况下,研究不同温度梯度对叶绿素浸提量的影响. 单因素试验确定这3个因素的最优值,根据最优值确定出3个因素的梯度范围,设计3因素3水平正 交试验,见表1. 1.5叶绿素含量计算方法 取待测液,在紫外分光光度计上分别测定其 在663nm,645Bin处的吸光值,按Arnon 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计 算叶绿素a和叶绿素b的含量及叶绿素总量: C=(12.71×』4663—2.59xA645)xv/(1000x,) = (22_88×645—4.67×663)XW(1000x 表1正交试验选用的因素与水平 Tab.1Factorsandlevelsselectedinorthogonaltest C=C.+C6=(20.29645—8.04xA663)XV/(1000xW) 式中,A和4”分别为相应波长下的吸光度值,为提取液的体积(mL),W为叶片鲜重(g),叶绿素含 量单位为.,g/g. 1.6数据统计分析 重复试验采用Excel软件求标准误差并绘图,正交试验数据采用SPSS软件进行方差检验. 2结果与分析 2.1浸提液法与Amon法比较试验 从表2可以看出,运用Amon过滤法所测定的叶绿素含量与其他方法相比差别很大,主要原因可能是 Arnon法测定叶绿素含量时需要过滤,过滤过程造成了叶绿素含量的部分损失.Amon离心法相对于 Amon过滤法效率稍高.浸提法测定叶绿素含量的效率排序依次为:80%丙酮浸提法<95%乙醇浸提法< 三混液浸提法<双混液浸提法. 第5期徐国瑞,等:罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究421 2.2乙醇丙酮混合液法浸提试验 从图1可以看出,开始时随着乙醇在混合液中比例的增大,协同作用随之增大,乙醇与丙酮的比例达 到1:1时含量达到最大;随后继续往丙酮中加入乙醇,协同作用开始 变小.可见,当乙醇与丙酮的比例达 到1:1时,对罗甸小米核桃叶绿素的浸提最充分. 2.3单因素试验 通过不同配比协同作用试验表明,当无水乙醇与无水丙酮比例为1:1时浸提量最大,所以,单因素试 验采用上述溶液为试验浸提溶液.在叶绿素浸提相关文献中,提出了浸提温度,浸提时间和浸提料液比这 3个对叶绿素浸提影响最主要的因素?.本试验选择的时间梯度是2,7h,温度梯度是30,70~C,料 液比梯度是1:10,1:20,1:30,1:50,1:70,1:90. 从图2可以看出,在相同浸提温度和浸提料液比的情况下,当浸提时间从2h增加到5h时,罗甸小米 核桃叶绿素含量逐渐升高,并在5h时达到最大,然后随着浸提时间继续增加,叶绿素含量则不断下降.这 说明叶绿素最适浸提时间为5h,不足或超过5h,叶绿素的提取是不充分的.这是由于在浸提开始后,叶 绿素有一个由组织向外扩散的过程,因此提取出的叶绿素不断增加.当浸提时间为5h时,组织中叶绿素 向提取溶剂的扩散作用达到平衡,溶液中叶绿素含量达到最高.浸提时间超过5h后,溶液中叶绿素含量 开始下降.其可能原因是随着浸提时间的增长,罗甸小米核桃叶绿素暴漏在光线下的时间也就越长,对光 的不稳定性造成叶绿素含量不断下降. \ 警一 鲫 扣 搦 强 亡 乙醇:(乙醇+丙酮) 图l乙醇丙酮混合液的协同作用 Fig.1Synergisticeffectofethanol acetonemixture 凹 蒯 如 囊 古 浸提时间段(h) 图2不同时间梯度下叶绿素含量变化趋势 Fig.2Changeofchlorophyllcontentunder differentextractiontime 从图3可以看出,在相同浸提温度和浸提时问的情况下,罗甸小米核 桃叶绿素含量基本随料液比的减 少而上升,当料液比达到1:50时含量达到最大,随后再减小料液比,叶绿素含量不再增加,说明当浸提料 液比是1:50时,叶绿素浸提最为充分. 从图4可以看出,在相同浸提温度和浸提时间的情况下,当温度从30?升高到50~C时,叶绿素含量不 断上升,并在5O?时达到最大;当温度继续上升,超过5O时,叶绿素含量则随温度的上升而下降.这是 因为叶绿素在高温下不稳定,容易分解,从而造成提取液中叶绿素含量的下降,说明当浸提温度是50qC 时,叶绿素浸提最为充分. 422山地农业生物2010年 S 率} 钽 谶 嚣 士 图3不同料液比梯度下叶绿素含量变化趋势 Fig.3ChaJlgeofchlorophyllcontent underdifferentextractionliqllidratio 盘f 缸 畿 嚣 图4不同温度梯度下叶绿素含量变化趋势 Fig.4Changeofchlorophyllcontent underdifferentextractiontemperature 2.4正交试验 由表3可以看出,3个主要因素对罗甸小米核桃叶绿素浸提影响程度是:浸提温度>浸提时间>浸提 料液比.由表4可以看出,浸提温度(P<<O.05)和时间(P<<0.05)对罗甸小米核桃叶绿素提取达到 了极显着水平,而料液tg(p=0.169>>0.05)的影响则不显着.由方差检验的结果可知,浸提温度和浸 提时间是影响罗甸小米核桃叶绿素提取量的最主要因素,料液比的影响较小.因此,叶绿素含量测定的最 优 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 为:浸提温度5O?,浸提时间6.5h,浸提料液比1:4O. 表3正交试验结果 Tab.3Resultoforthogonaltest 表4正交试验方差分析 Tab.4Thevarianceanalysisoforthogonaltest 注:因变量为叶绿素总量,R2=0.942(调整后的=0.906) 第5期徐国瑞,等:罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究423 3结论与讨论 3.1试验结果显示:当丙酮和乙醇以1:l混合时对罗甸小米核桃叶片叶绿素的浸提效率最高.对同一种 有机溶剂而言,在不同外部条件(浸提时间,料液比,浸提温度)下,所得的浸提效率是不同的;单因素试验 结果表明,在比例为1:1的丙酮乙醇混合溶液中,温度5O?,料液比1:50,浸提5h,浸提效果最好;正交试 验结果表明,3个因素的影响效果大小排序为:浸提温度>浸提时间>浸提料液比,罗甸小米核桃叶绿素 浸提的最佳方案是在乙醇与丙酮体积比为1:1的混合溶液中浸提,浸提时间是6.5h,浸提温度50?,浸提 料液比是1:40. 3.2本试验针对罗甸小米核桃叶绿素用不同方法进行提取,结果表明,乙醇丙酮混合浸提的浸提效率高 于混合液法,这与陈福明和陈顺伟的混合液测定叶绿素含量的相关表述不一致,而与张宪政用丙酮一乙 醇混合法得出的结论一致.在丙酮乙醇最优配比的问题上,本试验结果表明,当丙酮和乙醇的体积比为 1:1时浸提效率最高,这与彭运生和刘恩所提出的丙酮与乙醇比例为2:1的最优浸提液的比例不一致, 而与唐小俊等在对苦瓜叶绿素含量浸提时所用的方法一致.此外,还有人提出等摩尔比混合液浸 提.总体而言,对植物叶绿素最优浸提液的比例没有统一的标准,相同 比例对不同植物的浸提效果不 同,不同比例对同一植物的浸提效果也不同. 参考文献: [1]MACKINNEYG.Absorptionoflightbychlorophyllsolutions[J].BiolCh em,1941,140:315—322. 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