tPAPAI1系统在牛卵丘卵母细胞复合体体外成熟进程中的表达（可编辑）

tPAPAI1系统在牛卵丘卵母细胞复合体体外成熟进程中的表达（可编辑） tPAPAI1系统在牛卵丘卵母细胞复合体体外成熟进程中 的表达 分类号 S828学校代码 10129U D C 11.220 学 号2009201050tPA-PAI-1 系统 在牛 卵 丘卵 母细胞 复 合体 体外 成熟 进程 中 的 表达 Expression of Tissue-Type Plasminogen Activator-Plasminogen Activator Inhibitor-1 System in Bovine Cumulus-Oocytesduring in vitro Maturation 申 请 人:关 洪敏 学科 门类 : 农 学 学科 专业 : 基 础兽 医学 研究 方向 : 动 物组 织胚 胎与 发育 生物 学 指导 教师 : 曹 贵方 教 授 李海 军 副教 授 论文 提交 日期 : 二 ?一 二年 六月摘 要 为了初步了解组织型纤溶酶原激活剂tissue-plasminogen activator,tPA、 1 型纤溶酶原激活剂抑制剂plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1和纤溶 酶原plasminogen,PLG在牛卵丘卵母细胞复合体体外成熟进程中的潜在作 用;本 文运用实时定量 RT-PCR 技术分别检测体外成熟过程中不同时间段(0 h、8 h、16 h、 24 h)、添加不同浓度卵泡刺激素follicle-stimulating hormone,FSH以及卵泡 刺 激 素 受 体 结 合 抑 制 剂 follicle-stimulating hormone receptor-binding inhibitor,FRBI-10成熟培养 16 h 后牛卵丘细胞和卵母细胞中 tPA、PAI-1 及 PLG 基因相对表达变化,观察添加不同浓度FSH成熟培养16 h后卵丘细胞膨胀程度差异, 并统计卵母细胞第一极体排出情况。 1. 卵丘卵母细胞复合体在体外成熟过程中,卵丘细胞和卵母细胞 tPA mRNA 相 对表达量,于体外成熟 16 h 显著高于 0 h 和 8 h,24 h 达到最高P0.05;而卵丘 细胞 PAI-1mRNA 相对表达量于 8 h 达到最高,显著高于 16 h 和 24 hP0.05。卵 丘细胞 PLG mRNA 相对表达量总体趋势和 tPA 类似,于 16 h 显著高于 0 h 和 8 h, 在 24 h 达到最高P0.05。卵母细胞 PAI-1 mRNA 相对表达量于 16 h 显著高于 0 h 和 8 h,达到最高,并显著高于 24 hP0.05。 2. 在添加不同浓度 FSH 0、0.01、0.1 和 1 IU/mL体外成熟 16 h 的各处理组, 卵丘细胞中 tPA mRNA 相对表达量随 FSH 添加浓度的升高而升高,当 FSH 添加浓度 1 IU/mL,卵丘细胞之间的缝隙连接较为松散且发暗。卵丘细胞中的 PAI-1 mRNA 相对 表达量在 0.01 IU/mLFSH 时高于其他各处理组;同时卵丘细胞 PLG mRNA 表达水平在 0.01 IU/mL FSH 时达到最低,于 0.1 IU/mL 和 1 IU/mL 时显著升高 P 0.05。卵 母细胞 tPA 表达变化显示出与第一极体排出率相似的趋势,即 0.01 IU/mL FSH 处理 组的 tPA mRNA 水平和第一极体排出率显著高于其他处理组P 0.05。卵母细胞中 PAI-1 mRNA 相对表达量在 0.01 IU/mL FSH 时最高,显著高于其他各 FSH 添加组P 0.05。 3. 在添加 FRBI-10 体外成熟 16 h 的各处理组,在只添加 FSH 组的卵丘细胞 tPA mRNA 相对表达量显著高于其他各处理组P 0.05;卵母细胞中 tPA mRNA 相对表达 量在只添加 FSH 组显著高于空白组P 0.05,在只添加 FSH 组,卵丘细胞和 卵母细 胞中 PAI-1 mRNA 相对表达量最高,显著高于其他各处理组P 0.05;卵丘细胞和 卵母细胞 PLG mRNA 相对表达量在只添加 FSH 组却显著低于空白组 P0.05。 综合以上研究结果,本研究认为:牛卵丘细胞中 tPA 与 PAI-1 基因的表达受 FSH 正向调节,而 PLG 基因表达却受到 FSH 的抑制;进而推测,tPA-PAI-1 系统对卵丘 细胞在体外成熟过程中的扩散并不起促进作用;在卵丘卵母细胞复合体体外成熟过 程中,tPA-PAI-1 系统可能参与对牛卵泡排卵过程的调控。同时,tPA 在卵母细胞中 的表达是否与其第一极体排出有关,需进一步实验验证。本实验结果为进一步研究 tPA-PAI-1 系统在牛卵丘卵母细胞复合体体外成熟过程中的具体作用奠定了基础。 关 键 词:tPA;牛;卵丘细胞;卵母细胞;FSH;FRBI-10 Expression of Tissue-Type Plasminogen Activator-Plasminogen Activator Inhibitor-1 System in Bovine Cumulus-Oocytes during in vitro Maturation Abstract In the present study, four experiments were conducted to investigate the potential effects of tPA, PAI-1 and PLG on bovine cumulus cells and oocytes during in vitro maturation IVM 0 h, 8 h, 16 h, 24 h. The expressions of tPA, PAI-1 and PLG were detected by relative real-time RT-PCR experiments in bovine cumulus cells and oocytes both after 0 h, 8 h, 16 h, 24 h of IVM and under different FSH concentrations after 16 h of IVM separately. Meanwhile, the degree of bovine cumulus cell expansion and first polar body extrusion in oocyte were assessed respectively1. TPA mRNA levels were higher in cumulus cells and oocytes at 16 h and 24 h than those at 0 h and 8 h of IVM significantlyP0.05. PAI-1 mRNA levels were higher in cumulus cells at 8 h than those at 16 h and 24 h of IVM significantlyP0.05. The whole trend of PAI-1 mRNA levels were similar to tPA in cumulus cells, while PAI-1 mRNA levels were the highest at 24 h in oocytes, and higher at 16 h than those at 0 h and 8 h of IVM significantlyP0.052. Among those groups that under different FSH concentrations 0, 0.01, 0.1 and 1 IU/mL after 16 h of IVM, tPA mRNA levels of cumulus cells was increased following the elevated FSH concentrations, as well as the cumulus expansion, the gap junctions of cumulus cells in 1 IU/mL FSH group was significantly looser and darker than othersPAI-1 mRNA of cumulus cells in 0.01 IU/mL FSH group was significantly higher than others P0.05. PLG mRNA levels in 0.01 IU/mL FSH group were the lowest in cumulus cells, then in 0.1 IU/mL and1 IU/mL FSH group increased dramatically P0.05. Expression of tPA showed a similar trend with the first polar body in oocytes that tPA mRNA levels of the 0.01 IU/mLFSH group and the first polar body extrusion significantly higher than the other groups P0.05.Meanwhile, PAI-1mRNA of oocytes 0.01 IU/mL FSH group significantly higher than others P0.053. Among those groups that addition of FRBI-10 to the COCs after 16 h of IVM, the expression level of tPA mRNA in cumulus cells in only addition of FSH group significantly higher than others P0.05. TPA mRNA in the oocytes in only addition of FSH group was significantly higher than the blank group P0.05. In only addition of FSH group both the expression levels of PAI-1 mRNA in cumulus cells and oocytes were significantly higher than all other groups. While in only addition of FSH group theexpression levels of PLG mRNA both in cumulus cells and oocytes were lower than the blank group dramatically P0.05Our conclusions are as followed, the expression of tPA and PAI-1 in bovine cumulus was regulated positively by FSH, while the expression of PLG was inhibited by FSHDuring in vitro maturation tPA-PAI-1 system does not play a proactive role in cumulus expansion, and the sytem could participate in bovine follicle ovulation .However, it need to be further investigated that tPA-PAI-1 system expression may be involved in first polar body excrusion of bovine oocytes. These results contribute to the further research on the specific roles of tPA-PAI-1 system in bovine COCs during IVMKey Words: TPA; Bovine; Cumulus cells; Oocytes; FSH; FRBI-10 Directed by: Prof. CAO Guifang ;Associate Prof. LI Haijun Applicant for Master degree: Guan Hongmin Histology and Developmental biologyCollege Veternary and animal science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018. China目 录 1 引言1 1.1 tPA、PAI-1 及 PLG 概述1 1.2 FRBI-10 的作用原理1 1.3 卵母细胞体内获得发育能力2 1.3.1 腔前卵泡. 2 1.3.2 有腔卵泡. 3 1.4 卵母细胞的体外成熟4 1.4.1 卵母细胞胞核成熟4 1.4.2 卵母细胞胞质成熟5 1.4.3 卵母细胞膜成熟. 6 1.5 tPA-PAI-1系统与排卵 6 1.5.1 卵泡中 tPA-PAI-1 系统. 6 1.5.2 卵巢中 tPA-PAI-1 系统. 8 1.6 研究背景和意义 8 2 材料与方法9 2.1 仪器和试剂. 9 2.2 方法. 9 2.2.1 牛 COCs 的采集和体外成熟培养 9 2.2.2 卵丘膨胀评定10 2.2.3 RNA 提取和反转录. 10 2.2.4 实时定量 PCR10 2.2.5 PCR 扩增产物特异性的确定12 2.2.6 数据统计 12 3 结果与分析. 12 3.1 PCR 产物特异性确定. 12 3.1.1 RT-PCR 结果 12 3.1.2 电泳检测 RT-PCR 产物结果 14 3.2 成熟过程中牛卵丘细胞、卵母细胞 tPA-PAI-1 系统基因表达15 3.2.1 成熟过程中卵丘细胞 tPA、PAI-1 及 PLG 基因表达 15 3.2.2 成熟过程中卵母细胞 tPA 及 PAI-1基因表达 16 3.3 添加不同浓度 FSH 成熟培养 16 h 卵丘细胞、卵母细胞 tPA-PAI-1 系统基因 表达16 3.3.1 添加不同浓度 FSH 成熟培养 16 h 卵丘细胞 tPA、PAI-1 及 PLG 基因表达16 3.3.2 添加不同浓度 FSH 成熟培养 16 h 卵母细胞 tPA、PAI-1 及 PLG 基因表达. 17 3.4 添加 FRBI-10 成熟培养 16 h 卵丘细胞、卵母细胞的 tPA-PAI-1 系 统基因表 达. 18 3.4.1 添加 FRBI-10 成熟培养 16 h 卵丘细胞 tPA、PAI-1 及 PLG 基因表达 18 3.4.2 添加 FRBI-10 成熟培养 16 h 卵母细胞的 tPA、PAI-1 及 PLG 基因表达 19 3.5 不同浓度 FSH 处理组,体外成熟培养 16 h COCs 中卵丘膨胀程度及形态 20 3.5.1 卵丘膨胀程度. 20 3.5.2 COCs 形态学变化20 3.6 不同 FSH 浓度培养 16 后卵母细胞第一极体排出情况 21 4 讨论. 22 4.1 体外成熟过程中 tPA-PAI-1 系统基因表达与排卵的关系 22 4.2 FSH 对卵丘细胞中 tPA-PAI-1 系统表达的影响23 4.3 tPA-PAI-1 系统与卵丘扩散的关系. 24 4.4 tPA-PAI-1 系统在卵丘细胞表达对卵母细胞的影响. 25 5 结论. 26 致 谢 27 参 考 文 献29 作 者 简 介37 缩 略 语 表 GC Granulasa cell 颗粒细胞 CGs Cortical Granules皮质颗粒 COCs cumulus-oocyte complexes卵丘卵母细胞复合体 PLG plasminogen 纤溶酶原 PAs plasminogen activators 纤溶酶原激活剂 TC Theca cell 卵泡膜细胞 tPA tissue-plasminogen activator 组织型纤溶酶原激活剂 uPA urokinase-type plasminogen activator 尿激酶型纤溶酶原激活剂 uPAR urokinase-type plasminogen activator receptor 尿激酶型纤溶酶 原激活剂受体 PAI-1 plasminogen activator inhibitor-1 1 型纤溶酶原激活剂抑制剂 GVBD germinal vesicle breakdown 生发泡破裂 ECM extracellular matrix 细胞外基质 MMPs matrix metalloproteinases金属基质蛋白酶 E2 Estradiol 雌二醇 FSH follicle-stimulating hormone 卵泡刺激素 FRBI-10 follicle-stimulating hormone receptor-binding inhibitor 卵泡刺激素受体结合抑制剂 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 IVM in vitro maturation 体外成熟 MI metaphase I 第一次减数分裂中期 M? metaphase ? 第二次减数分裂中期 M199 medium 199 组织培养液 199 RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction反转录聚合酶链式反应 cAMP Cyclic Adenosine 3',5'-monophhosphate环磷酸腺苷 MAKP Mitogen-activated protein kinase, 有丝分裂蛋白激酶 MPF Maturation promoting factor成熟促进因子内蒙古农 业大 学硕 士学 位论文 1 1 引言 1.1 tPA 、PAI-1 及 PLG 概述 [1] 1985 年,Huarte 等 首次发现了一类由卵母细胞产生的蛋白酶-----纤溶酶;它 是由无活性的纤溶酶原plasminogen,PLG转化而来;而组织型纤溶酶原激活剂 tissue-plasminogen activator,tPA是具有丝氨酸蛋白酶性质的纤溶酶原激活 剂,催化活性中心由组氨酸His、天冬氨酸Asp和丝氨酸ser组成的,具有广泛 水解酶活性;作为纤溶过程的关键因素,它能将大量的细胞外无活性的 PLG 转化为 [2] 有活性的纤溶酶 ,使 PLG Arg560-val561 处断裂形成由二硫键连接的双链分子纤 [3.4] 溶酶,激活其他蛋白水解酶原,如胶原酶原、基质金属蛋白酶原和弹性酶原等 , 纤溶酶主要是通过打开纤维蛋白分子的精氨酸Arg-x 和赖氨酸LyS-x 键,参与胞 [5] 外基质extracellular matrix,ECM的降解和重构 。PLG 富含于血液和其他体液 [6] [3] 中 ,而纤溶酶原激活剂也存在于许多类型细胞和体液中 ;因此,PLG 和纤溶酶原 激活剂的结合被看作是无限供给蛋白水解能力的组合。 由于 PLG 在组织和体液中具有相对较高的浓度,纤溶酶原激活剂少量的增加将 会引起胞外环境中纤溶酶的大量增加 ;PLG 和金属基质蛋白酶matrix metalloproteinases,MMPs共同作用有可能降解卵巢中所有 ECM 成分。因此,PLG 的活化调控作用可能是排卵过程关键的调节手段。 1 型纤溶酶原激活剂抑制剂plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1 属 于丝氨酸蛋白酶抑制剂基因超级家族,是纤溶酶原激活剂主要的抑制剂,能与 tPA 形成稳定的复合物,抑制纤溶酶原激活剂活性,阻碍细胞外基质和纤维蛋白降解。 从而调节细胞表面或细胞外周的局部蛋白水解作用。激活剂和抑制剂基因的特异功 能是受影响它们转录和表达的激素特异受体或因子调控的,其表达产物蛋白分泌 后,较短时间内将与其细胞表面受体或细胞表面或细胞间质结合蛋白形成复合物; 一方面可延长半衰期,另一方面可使作用强度提高 200-300 倍。纤溶酶原激活剂在 细胞间或细胞表面上的局部蛋白水解作用,受到特异抑制剂的精确调节,为了确保 局部 ECM 降解不损害临近的细胞及组织,同时能快速恢复其正常生理功能,ECM 在 细胞间形成了一个复杂的动态变化网络系统。ECM 不仅是组织结构上重要支持部分, 而且在介导细胞间的信息传导,调节细胞增殖、发育、迁移和代谢过程中是不可或 缺的;因此,由 tPA-PAI-1 系统所调控的 ECM 降解广泛影响机体的各种生理过程。 1.2 FRBI-10 的作 用 原 理 卵泡刺激素follicle-stimulating hormone,FSH是一类由前叶垂体分泌的 糖 [7.8] 蛋白激素,与卵巢主要的功能,如卵泡发育、成熟和排卵密切相关 。FSH 是由一 个共同的α-亚基组成的异源二聚体,此亚基可与其他糖蛋白激素如黄体生成素 luteinizing hormone,LH、人绒毛膜促性腺激素human chorionic gonadotropin,2 tPA-PAI-1 系统 在牛卵丘 卵母 细胞 复合 体体外成熟 进程中的 表达 hCG和促甲状腺激素thyroid stimulating hormone,TSH。β-亚基是某一物种的 [9] [10] 特定激素 。FSH 通过其受体 FSHR 发挥作用,FSHR 属于 G 蛋白偶联受体家族 ,由 695 个氨基酸残基amino acid residues,aa包含 17 个疏水的信号肽组成;349 个 aa 形成了胞外激素结合hormone binding,HB区,264 个 aa 形成了跨膜区,余 [11] 下 65 个 aa 编码短羧端胞内区 。FSH 与其受体弯曲的 HB 区凹面结合,其中包含 N [12] 端半胱氨酸Cys簇连同胞外丰富的亮氨酸Leu重复集群 。FSH 与其受体结合主 [13] [14] 要活化了各种 G 蛋白,导致 CAMP 的产生 ,借此调控类固醇合成 。 卵 泡 刺 激 素 受 体 结 合 抑 制 剂 follicle-stimulating hormone receptor-binding inhibitor,FRBI是从人卵泡液中纯化而来的一种约 57kDa 的蛋 [15] 白,具有 FSH 结合抑制活性 。而 FRBI-10 是人 FSH 受体结合抑制剂hFRBI, 57kDa 的一个片段,它具有 hFRBI 一个功能域,能够特异性地抑制 FSH 和其受体的相互作 用。利用放射性配体受体分析adioligand receptor assay,RRA证实了 FRBI-10 抑制 hFSH 与牛睾丸膜中丰富的 FSH 受体结合能力。FRBI-10 以一种浓度相关性,抑 125 制 I-hFSH 与其受体结合,并且其 ED50 为 300 mM;当浓度高达 1000 mM 时,FRBI-10 125 仍对 I-hCG 与其受体结合无影响;由此表明,FRBI-10 对 FSH 与其受体间的相互 作用是特异性的。同时,为了评测 FRBI-10 的生物活性,对大鼠支持细胞体外原代 培养物受 FSH 刺激下从雄烯二酮转化为雌二醇的效果进行了研究;结果显示,当 FRBI-10 浓度为 1000 mM 时,FSH 刺激下雌二醇合成明显受阻;相同浓度下,FRBI-10 也明显抑制了支持细胞原代培养物受 FSH 刺激下 cAMP 的积累。 [16] 研究表明,FRBI-10 抑制 FSH 与颗粒细胞的结合 。也已经观察到它可诱导实 [17] 验性动物发育卵泡的闭锁 。已经证明,FSH 在卵巢卵泡发育中起到关键性的作用, 一旦除去卵巢卵泡发育中作为关键因素的 FSH,将会导致颗粒细胞生物学功能的丧 [17] 失 。实验证实,FRBI-10 干预 FSH 与其受体结合,使其丧失或部分丧失功能导致 [19] 颗粒细胞内部凋亡和或影响类固醇合成的信号转导机制下游事件 。 1.3 卵 母 细胞 体 内 获 得 发 育能 力 对于大多数哺乳动物,卵泡中卵母细胞的生长和发育与其周围的体细胞以一 种 高度协调且相互依赖的方式进行。卵母细胞在卵泡生长期间不断获得发育能力,最 终在排卵前卵泡的最后阶段经历完整的减数分裂和细胞质成熟。卵母细胞发育能力 [20.21] 意味着一个卵母细胞有能力实现至少是植入前期成功的受精和发育 ;体内或体 [22] 外经过促性腺激素刺激的卵母细胞更加有利于受精后的胚胎发育 。 1.3.1 腔前卵泡 从卵黄囊移出,移至生殖脊时,原始生殖细胞经历着有丝分裂;随着原始生殖 细胞分化为卵原细胞,继续通过有丝分裂进行增殖,直到进入减数分裂。迄今为止, 内蒙古农 业大 学硕 士学 位论文 3 细胞周期关键结合点的信号机制尚不清楚。随着个别的卵母细胞进入第一次减数分 裂前期,它们迅速与前颗粒细胞形成原始卵泡。因为无前颗粒细胞包裹的卵母细胞 继续进行减数分裂,最终导致死亡,所以这些前颗粒细胞很可能产生导致初级卵母 [23] 细胞停滞在前期 I 双线期的信号 。原始卵泡的形成也与卵母细胞染色质的 去固缩 和减数分裂的弥漫双线期或网系期的形成有关,卵泡生长首先是原始卵泡激活为初 [24] 级卵泡,虽然初级卵泡的活化仍不清楚,然而一些信号分子,包括 kit ligand , [25] [28] anti-Mullerian hormone 和 H1FOO 可能参与此过程。 在卵母细胞生长和发育的整个过程中,卵母细胞和其周围的颗粒/卵丘颗粒细胞 之间形成了密切协作的关系,这种协作对于正常的卵泡生长和卵母细胞获得发育能 [27.28] 力都是必需的 。起初,卵丘颗粒细胞向卵母细胞提供代谢的前体,如糖类、氨 [29] 基酸类和核苷酸类,这种协作被认为是卵母细胞生长的关键 。此外,缝隙连接所 介导的卵丘细胞对卵母细胞的单向交流,被认为是实验室动物和家畜经促性腺激素 [30.31] 处理后启动卵母细胞成熟的关键 。后来发现,卵母细胞和其周围卵丘颗粒细 胞 [32.33] 之间的交流不仅仅是单向的,而是双向的 。例如,卵母细胞分泌的因子促进卵 [34] [35] [28] 丘细胞膨胀、颗粒细胞的增殖 、卵丘细胞 LH 受体的抑制 和排卵 的影响。因此, 卵母细胞生长和成熟的整个过程,卵母细胞和其周围的卵丘颗粒细胞的协作不仅对 于卵母细胞正常功能而且对于卵泡的功能都是必不可少的。 1.3.2 有 腔卵 泡 经过卵泡发育的初级和次级阶段,小鼠卵母细胞直径增加将近 3 倍,在卵泡腔 形成之前,直径达到 80μm 左右。与卵母细胞生长期相关的是获得减数分裂和发育 能力,减数分裂能力以一种循序渐进的方式获得,像鼠类卵母细胞,首先能够经历 生发泡破裂germinal vesicle breakdown,GVBD,然后进行至第一次减数分裂中 期 Metaphase I,MI,最终停滞第二次减数分裂中期 Metaphase ?,MII。获 [36.37] 得减数分裂能力之后,卵母细胞获得了发育能力,能够进行受精和受精后发 育 。 因此,卵母细胞以一种顺序方式,在减数分裂能力的获得之后,获得发育能力,整 个过程是连续的。牛实验中,观察到一个相似的过程,除了卵泡腔形成之后才有完 成减数分裂的能力;牛卵母细胞直径小于 100 μm 仍不能发生 GVBD,当牛卵母细胞 [38.39] 直径将近 100μm 时,才能达到 M? 。直径约为 1 mm 三级卵泡内的卵母细胞,直 [40] 径约为 110μm 并且能进行减数分裂 。伴随牛卵母细胞直径从 110μm 增加到 [41.42] 120μm,其所在的卵泡直径也从 6mm 增大到 10mm 左右,卵母细胞具有发育能力 。 卵母细胞超微结构和[3H]-尿嘧啶核苷结合的研究已经显示:卵泡生长期间,卵 母细胞的发育呈现一些变化。牛卵母细胞转录行为开始于次级卵泡阶段,整个三级 [43] 卵泡阶段持续增加~3mm 直径,之后减少 。小鼠卵母细胞转录行为似乎一定 程 [44] 度上受到与卵母细胞有关的颗粒细胞的调节,而且可能受到促性腺激素的影响 。4 tPA-PAI-1 系统 在牛卵丘 卵母 细胞 复合 体体外成熟 进程中的 表达 卵母细胞转录行为导致了母源 mRNA 的积累,这对于植入前期合子的直接发育是非常 重要的。纳入卵母细胞核和细胞质中放射性标记的底物,随着早期卵泡发育和增加 的卵母细胞直径而减少;随着减数分裂成熟过程不断进行,卵母细胞质的细胞器位 置持续变化。减数分裂过程中,线粒体的位置从卵母细胞外围移至细胞质更加中心 [45.46] 的部分 ;GVBD 发生时,卵母细胞细胞质内的脂滴在数量和大小上都有所增加, [39] 而高尔基体的大小却在减小 ,由于卵母细胞通过减数分裂进行到 M?,然后继续 进行到 M?,脂滴持续增加,高尔基体大小进一步减小,同时线粒体与细胞质内的 脂滴关系更加密切。此外,微管重组和皮质颗粒重新均匀分配,而且分布于卵 黄膜 [47] 下方 。 有腔卵泡阶段既有 FSH 和LH 的调节,又有其他因子的调节。对于其他因子的作 用,引起人们的极大关注,因为它在刺激细胞的增殖的同时,又可调节促性腺激素 的作用。现在这个领域所面临的挑战是确定卵巢相关因子是如何负向或正向地调节 卵泡发生、排卵和黄体生成等事件。 1.4 卵 母 细胞 的 体 外 成 熟 随着牛体外受精技术的不断改进,现阶段已广泛应用于畜牧业生产中,同时体 外受精技术在家畜生产繁育等方面的优势十分突出;作为体外受精和胚胎发育的前 提,卵母细胞体外成熟则显得日趋重要。尽管多年来在牛卵母细胞体外成熟、体外 受精等系统的优化研究方面已取得一系列突破,但是由于哺乳动物的卵母细胞成熟 的复杂性,仍有许多问题亟待解决。 卵母细胞的成熟主要涉及胞核、胞质、胞膜、卵丘细胞、透明带等发生的成熟 变化;通常情况下,人工收集到的卵母细胞大多数处于成熟期:胞核经过第一次减 数分裂浓缩期、中期M?、后期A?、末期T?和第二次减数分裂的间期而到达 中期M?。 1.4.1 卵 母细 胞 胞 核 成 熟 由于 GVBD 是减数分裂开始的标志,而第一极体排出则意味着卵母细胞已经完成 [48] 核成熟 ,因此,一般以 GVBD 和第一极体排出作为卵母细胞核成熟的依据。在整个 成熟过程,卵母细胞内的环磷酸腺苷Cyclic Adenosine 3',5'-monophhosphate, cAMP可通过相关的蛋白激酶调节卵母细胞成熟的抑制;卵母细胞内的 cAMP,源自 卵泡颗粒细胞和膜细胞内的 cAMP;通常情况下,持续高浓度的 cAMP 具有抑制 GVBD [49] [50] 的作用 ,然而受到 LH 作用后 cAMP 浓度出现高涨,却可促进 GVBD ;最近研究发 现,促性腺激素FSH/LH对卵母细胞减数分裂恢复的作用,大部分是通过增加其周 [51] 围卵丘颗粒细胞 cAMP 的生成和随后的 MAPK 活化调节的 。颗粒细胞生成的卵母细 胞成熟抑制因子oocyte maturation inhibitor,OMI,以卵丘细胞为桥梁进行调 内蒙古农 业大 学硕 士学 位论文 5 [52] 节 ;它可产生对 FSH 的抑制作用,同时也能使卵母细胞停滞于 GV 期,阻碍其成熟 进程的继续。除此之外,有丝分裂蛋白激酶mitogen-activated protein kinase, MAKP、成熟促进因子maturation promoting factor,MPF等活化作用也对卵母细 胞的减数分裂产生一定的作用。而咖啡因可促进羊卵母细胞中 MAKP 和 MPF 的生成, [53] 使核移植供体系统重编程变得更加顺利 。然而,GVBD 的机理和卵母细胞减数分裂 的信号通路仍然是个未解之谜。 1.4.2 卵 母 细 胞 胞 质成 熟 与卵母细胞胞核成熟相比,卵母细胞胞质成熟显得更为复杂。伴随着卵泡逐渐 增大,卵母细胞依次经历生长期、获能期和成熟期,其发育能力也随之增强。 当卵 泡直径增长到一定程度,其内卵母细胞直径就停止增加,进入获能期。通常情况下, 将从三级卵泡开始到 LH 峰出现前的时期,称为获能期;在获能期内,卵母细胞内的 各细胞器分布、大小及数量等都呈现极大的不同,主要包括皮质颗粒、微绒毛、卵 周隙、脂滴、内质网以及线粒体,获能期引发的这些显著不同是卵母细胞受精及早 期胚胎发育的重要前提。 1.4.2.1 皮质 颗 粒 由单层膜包被的皮质颗粒cortical granules,CGs是未受精卵母细胞的典型 结构,在卵母细胞成熟晚期单层分布于质膜下,这种单层分布为防止多精受精和胚 胎的正常发育提供了不可或缺的保障。卵母细胞胞质成熟程度,在一定程度上可通 [54] 过胞质中 CGs 的分布形态进行直接估测 ;利用激光共聚焦显微镜,可观察哺乳动 [55] 物卵母细胞体外成熟过程中 CGs 分布情况 。在绵羊和猪卵母细胞的试验中,随着 卵母细胞核成熟进程不断推进,CGs 逐渐迁移至皮质区。 1.4.2.2 皮质 区 牛卵母细胞体内成熟的超微结果显示,当卵母细胞达到 MII 时,各种细胞器完 全均匀分布于中央区,形成一个无细胞器的皮质区;而牛卵母细胞体外成熟培养后 的电镜结果表明,皮质区的细胞器虽然已经开始向中央区内移,可是大部分区域仍 [56] 有较多的细胞器和内容物 。体外成熟卵母细胞的细胞器内移相对落后,致使其超 微结构和分子结构无法更加充分的成熟,无法实现卵母细胞核质成熟更加趋于同步。 线粒体是细胞内的能量供给场所,其位置的变化将会致使卵母细胞胞质内不同区域 间 ATP水平的差异。 1.4.2.3 卵丘 细 胞 哺乳动物排卵之前,卵丘细胞受到促性腺激素作用而产生一种蛋白多糖基质,6 tPA-PAI-1 系统 在牛卵丘 卵母 细胞 复合 体体外成熟 进程中的 表达 [57] 其重要成分是透明质酸和硫酸软骨素 ,致使卵丘细胞呈现粘液化。在小鼠卵母细 胞 GVBD 前,卵丘细胞就已经开始膨胀;卵丘细胞扩散是卵母细胞成熟的前提条件, [58] 但是卵母细胞成熟并不需要卵丘细胞的完全扩散 。猪卵母细胞的核成熟率与卵丘 [59] [60] [61] 细胞的扩散程度之间相关关系并不显著 ,但是猪 和山羊 胚胎的发育能力却与 IVM 时卵丘扩散程度有关,但是卵丘扩散究竟是与卵母细胞核成熟相关,还是与胞 质成熟相关仍不清楚。在此过程中,卵母细胞需要积聚大量的 mRNA 和蛋白质,为随 后的卵母细胞成熟提供能量和物质基础,并且两者可促进减数分裂阶段 MPF 扩增, 产生许多 LH 和 hCG 用于减数分裂的调控。除此之外,有时也将透明带软化,作为卵 母细胞成熟的特征之一。 1.4.3 卵 母细 胞 膜 成 熟 卵母细胞胞膜除了可以有效防止多精受精现象发生之外,同样可以有选择地透 过一些小分子物质对卵母细胞的成熟发挥应有的调控功能。随着卵泡发育,微绒毛 变的短粗且弯曲,而卵泡发育早期微绒毛垂直插入透明带内的情况已不存在,这种 形势下的卵母细胞开始进入获能期。山羊卵母细胞 IVM 24 h 后发现,微绒毛变细且 [56] [62] 数量减少,从原来的倒伏于胞膜上变为垂直状态 ;Hyttel et al. 认为微绒毛数 [63] 量的减少以及垂直于胞膜表面是卵母细胞成熟的一个重要特征。Sezen 等 也发现 了类似的现象,卵母细胞从初级卵母细胞发育至 M?期,其微绒毛的数量逐渐增多 且长度不断增大,直到卵母细胞完全成熟后,其数量和长度则呈现减少的状态。由 此可见,卵母细胞这种状态的变化与胞膜成熟有一定的相关性,同时可能更有利于 精子头部质膜与胞膜的融合,从而影响卵母细胞的受精率。 1.5 tPA-PAI-1 系统与排卵 所谓排卵,是指突于卵巢表面的成熟卵泡发生破裂,包围有卵丘细胞的卵母细 胞随卵泡液排出的过程。 1.5.1 卵 泡中 tPA-PAI-1 系统 卵泡不同类型细胞、卵泡生长的不同阶段和排卵后不同时期破裂卵泡壁中的不 同纤溶酶原激活剂及纤溶酶原激活剂抑制剂可能具有特殊的生理学重要性。卵泡壁 破裂伴随着卵巢各类细胞一系列在生理、生化和形态上的协同变化;目前有关 tPA-PAI-1 系统在排卵中的潜在作用进行了大量研究。 给初情前小鼠注射孕马血清促性腺激素pregnant mare serum gonadotrophin, PMSG促进了卵泡生长,继续注射 hCG 则造成排卵。颗粒细胞granule cells,GCs [81] 中的 tPA 于排卵后呈现高峰,而后下降 ,由此表明了 GC 中的 tPA 与排卵存在一定 的关系。卵泡膜细胞theca cells,TCs主要产生 PAI-1,而 PAI-1 也受促性腺激 内蒙古农 业大 学硕 士学 位论文 7 [64.65] 素调节 。当受到促性腺激素的刺激后,GC 中的 tPA 和 TC 中的 PAI-1 基因相互协 作引发 GC 中的 tPA 活性于排卵前呈现高峰;与此同时,TC 中的 PAI-1 活性出现两 [66] 次高峰,以局限排卵前后大量的tPA对周边其他卵泡可能造成的损害 ,tPA和PAI-l 的协同表达和协作促使排卵卵泡形成局部定向的蛋白水解流,因此这对卵泡定向破 [67] 裂起不可或缺的调节作用。Tsafriri 等 向大鼠卵巢内局部注射 tPA 抗体或纤溶酶 抗体,结果显示两者皆可显著抑制 hCG 造成的排卵,从而得知,tPA 对大鼠排卵起 着最为直接的作用。刘以训等进行猕猴排卵周期中 tPA 和 PAI-1 的活性研究中,通 [80] 过注射 PMSG 促进卵泡生长,之后使用 hCG 引发排卵 ;结果显示与大鼠实验一致; 据此提出,tPA 和 PAI-l 在卵巢不同细胞中的协同表达可诱发排卵。tPA 与 PAI-1 协同表达调控卵泡破裂的机制如图所示。图 1 tPA-PAI-1 系统 参与排 卵的可 能途径引自 刘以训 ,1998 Fig.1 The possible ways of ovulation that tPA-PAI-1 system involved inLiu Y-X ,1998 [68] 大鼠颗粒细胞中纤溶酶原激活剂的分泌在排卵前有一个升高 ,在猪排卵前 卵 [69] 泡中,tPA 是中最主要的纤溶酶原激活剂 ;牛排卵前卵泡中 tPA mRNA 表达随促性 腺激素峰增加,并且其主要位于卵泡颗粒层,促性腺激素峰后的 24 h 内,即排卵期 [70] [71] 的膜层才观察到极低水平的表达 ,而小鼠卵泡内膜层产生少量 tPA mRNA ;对于 牛卵丘卵母细胞复合体cumulus-oocyte complexes,COCs 中 tPA 基因水平上的 少见报道,并且 tPA 在 COCs 体外成熟过程中扮演着何种角色更是值得探讨。 [72] 研究表明,tPA 介导的蛋白水解作用,可直接诱导卵母细胞凋亡的发生 。在8 tPA-PAI-1 系统 在牛卵丘 卵母 细胞 复合 体体外成熟 进程中的 表达 [73] [74] 许多中途闭锁的卵泡中,其卵母细胞 tPA 呈现高表达 。严军丽等 也发现在闭锁 卵泡中,卵母细胞中 tPA 的含量与活性很高,而健康卵泡的卵母细胞则 tPA 的含量 和活性很低,并推测卵母细胞 tPA 的表达可能是卵泡发生闭锁的一个重要 诱因。根 据以上分析,或许可以作出以下推测:在一个已经解除了体内“淘汰机制”的体外 成熟环境中,鉴于其对卵母细胞凋亡的明显诱发作用,tPA 可能不参与卵母细胞的 成熟进程。但相矛盾的是,研究发现 tPA 还具有促进卵母细胞成熟的功能。离体实 [75] 验观察到小鼠初级卵母细胞中只含有微量 tPA 。但在进行减数分裂过程中,tPA [1] [76] 含量与活性逐渐增加,并最终在排卵前达到高峰 。刘以训等 发现小鼠 tPA 活性 于排卵前后达到高峰,由此推测 tPA 可能促进卵母细胞成熟和卵丘细胞膨胀。Mark [77] 等 实验表明,增加的纤溶酶原激活剂和纤溶酶活性在牛卵泡破裂机制方面起重要 作用。综上所述,tPA 可能在 COCs 体外成熟过程中的功能是诱发凋亡,还是促进成 熟,仍然需要更多的实验来支持验证。 1.5.2 卵 巢中 tPA-PAI-1 系统 [78] 前人研究表明,卵巢不同类型细胞中 tPA 表达可能受到促性腺激素类的调控 。 [79] 例如,大鼠卵巢颗粒细胞和膜细胞中 tPA mRNA 被上调 ;青春期前恒河猴经注射孕 马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)和 hCG 处理后, [80] 可诱发排卵,并发现颗粒细胞中的 tPA 于排卵前达到高峰,之后完全消失 。Dow [70] 等 通过在牛体内注射促性腺激素释放激素gonadotropin-releasing hormone, GnRH后间隔特定时间收集排卵前卵泡检测 tPA mRNA 表达变化,发现它与促性腺激 素峰呈时间和空间相关性;尽管有关 PA 系统在排卵过程中的潜在作用已经进行了大 量的研究,但是排卵前期 tPA-PAI-1 系统具有种属和细胞特异性调控,而且牛 COCs 中 tPA、PAI-1 及 PLG 基因的表达是否受到 FSH 的调节还未见报道。 1.6 研 究 背景 和 意 义体内发育成熟与体外成熟的卵母细胞发育能力 有很大差别,如取自体内成熟卵 [81] 泡的牛卵母细胞有 60%~80%能发育到囊胚期 ,而体外成熟培养的卵母细胞只有 [82] [83] 25%~40% 。造成此现象的原因十分复杂,如卵母细胞的质量 、体外成熟培养体 [84] 系 等,因此,阐明哺乳动物卵母细胞成熟机制对于提高体外成熟培养的卵母细胞 发育能力至关重要,进而对改进家畜、野生动物和人类临床应用的辅助繁殖技术具 有重要的实践意义。近年来,tPA-PAI-1 系统作为调节卵母细胞成熟和凋亡的重要 因子引起关注,本文拟探讨 t