草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与鉴定

园 艺 学 报 2011，38（9）：1657–1666 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com 收稿日期：2011–03–28；修回日期：2011–08–16 基金项目：国家自然科学基金项目（30872029）；北京市自然科学基金重点项目（6071001）；北京市自然科学基金项目（6092007）；北 京市教委重点项目（KZ201010020016）；北京市教委平台建设项目；北京市属高校人才强教深化计划项目（PHR20090516，PHR200906134） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：glshi@126.com；wyn1951@126.com） 草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与鉴定 汪雪静 1，卜春亚 1，靳永胜 1，梁 为 1，仝宝生 2，师光禄 1,*，王有年 1,* （１北京农学院，农业部都市农业（北方）重点开放实验室，北京 102206；2内蒙古永业生物技术有限责任公司，呼 和浩特 010010） 摘 要：采用平板对峙法，从分离自土壤的 436 株细菌菌株中筛选对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum）具有拮抗作用的细菌，得到了 3 株稳定性好，具有较高拮抗活性的菌株 w-25、 w-79 和 w-181。拮抗菌 w-25 对尖孢镰刀菌的抑菌带达到 11.0 mm，w-79 和 w-181 的抑菌带分别达到 5.4 和 6.4 mm。此外，3 株拮抗菌对草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、草莓红中柱致病菌（Fragria ananassa） 和草莓胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等具有很强的拮抗作用。经过对 3 株菌株形态观察、 理化分析和分子鉴定，认为 w-25 可能为荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens），w-181 和 w-79 可能为 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 3 株拮抗菌对致病菌生长有较好的抑制作用，显微观察发现拮 抗菌代谢产物会破坏致病菌菌丝形态，电镜观察发现致病菌细胞器溶解，细胞内液泡变大。 关键词：草莓根腐病菌；拮抗作用；细菌；芽孢杆菌；假单胞菌 中图分类号：S 668.4；S 436 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）09-1657-10 Identification and Inhibitory Effects of Antagonistic Bacteria Against Strawberry Root Rot（Fusarium oxysporum） WANG Xue-jing1，BU Chun-ya1，JIN Yong-sheng1，LIANG Wei1，TONG Bao-sheng2，SHI Guang-lu1,*， and WANG You-nian1,* （1Beijing University of Agriculture，Key Laboratory of Urban Agriculture‘North’，Beijing 102206，China；2Inner Mongolia Yongye Biotechnology Co.，Ltd.，Huhhot 010010，China） Abstract：In order to screen antagonistic bacteria against Fusarium root rot of strawberry，totally 436 bacterial strains were isolated from strawberry rhizosphere soils. Three strains（w-25，w-79，w-181）were found to have high antifungi activities to Fusarium root rot of strawberry using five-point confrontation method，with inhibition zone of 11.0，5.4 and 6.4 mm，respectively. In addition，the three antagonistic bacteria on strawberry botrytis（Botrytis cinerea），strawberry red column pathogens（Fragria ananassa） and strawberry gum spore anthrax（Colletotrichum gloeosporioides）have high antagonistic effect. According to their physiological and biochemical characters as well as 16S rDNA sequences，w-25 was probablely identified as Pseudomonas fluorescens，and w-181 and w-79 were probablely identified as Bacillus subtilis. Antagonistic bacteria（w-25，w-79 and w-181）can inhibit the mycelium growth. Their metabolic products treatment can lead fungi mycelium abnormality，bioplasm condensed and cellular 1658 园 艺 学 报 38 卷 vacuole increased，which was observed using light microscope and transmission electron microscopy. Key words：strawberry root rot；antagonistic activity；bacteria；Bacillus sp.；Pseudomonas migula 草莓根腐病是草莓根部的重要病害，特别是在多年种植草莓的重茬地块，严重时可危及整个草 莓园区。该病的发生具有逐年上升趋势，已成为草莓产业发展的主要障碍之一。2012 年世界草莓大 会将在北京市昌平区举行，这对北京乃至我国草莓事业的发展均是一个机遇。目前北京市有草莓日 光温室和大棚近 5 000 个，2012 年可达到近 2 万个。随着草莓事业的兴起，草莓的重茬病害越来越 突出，尤其是草莓根腐病，致病菌复杂多样，难以防治。 世界范围内草莓主产区已报道的根腐病病原物达 20 种之多，是一种较难防治的土传病害（赵 秀娟 等，2006）。在国外，松崎正文门和铃井孝仁门（1980）分离根部、叶柄基部结果认为草莓疫 病是引起根腐的主要病害，其病原物为 Phytophthora nicotianae var. parasitica。Mass（1988）认为引 起草莓根部枯死主要以 Rhizoctonia solani、Fusarium wilt、Pythium sp.为主。其他报道的致病菌有： 丝核菌属 Rhizoctonia（Lamondia & Martin，1989）、镰刀菌属 Fusarium（Martin，1988）和腐霉菌属 Pythium（Maas，1988）等。在国内，有研究者进行调查研究后得出结论，引起草莓根腐病的病原菌 除以上报道的以外，还包括国外未见报道的拟盘多毛孢属 Pestalotiopsis sp.、三毛孢属 Robillarda sp.、 枝顶孢属 Acremonium sp.（朱杰华 等，1994）和草莓疫霉菌 Phytophthora fragariae Hickman（张艳 秋 等，2003）等。 目前生产上对草莓根腐病主要以化学防治为主，但用药比较混乱（王中武 等，2009）。化学药 剂的频繁使用导致病菌产生抗药性，而且农药残留现象比较严重。草莓根腐病是草莓重茬病的重要 发生病菌之一，其发生主要是由于土壤微生态环境恶化造成的（甄文超，2003），因此，从调控土壤 微生态环境入手，通过有针对性地研制土壤微生态调节剂来解决草莓根腐病，是一种很有前前途的 控制措施。 本研究中以北京地区多见的尖孢镰刀菌根腐病致病菌作为靶标真菌进行拮抗菌的筛选与鉴定， 以服务京郊日光温室的草莓生产为目标，进行草莓根腐病生防菌的研究，筛选拮抗活性较高的菌株， 为进一步开发应用提供理论依据。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 供试靶标真菌 本试验于 2009 年 1 月—2010 年 10 月进行。 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）分离自草莓种植基地，经过柯氏法则和分子鉴定等方法确 证，现保存在北京都市农业重点实验室。另外，桃褐腐病菌（Monilinia fruticola）、辣椒炭疽病菌 （Colletotrichum acutatum）、黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉 米青枯病菌（Pythium inflatum）、棉花红腐病菌（Fusarium moniliforme）、草莓红中柱致病菌（Fragria ananassa）和草莓胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等供试病原真菌由北京农学院植物 病理学实验室提供。 1.2 培养基及主要试剂 PSA 培养基：马铃薯 200 g，蔗糖 14 g，琼脂 10 g，蒸馏水 1 000 mL。LB 培养基（程丽芬 等， 2000）：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，琼脂 10 g，蒸馏水 1 000 mL。所用分子生物学 9 期 汪雪静等：草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与鉴定 1659 试剂盒购买于 TaKaRa 公司，配制参考文献（萨姆布鲁克和拉塞尔，2002）进行。 1.3 土壤细菌的分离纯化与拮抗细菌的筛选 土样采自小汤山草莓种植基地。在种植草莓 3 年以上的日光温室里，采集与根腐病发病植株相 邻的正常植株的根际土壤。 平板稀释法。称取采集的土样每份 10 g，放入含有 100 mL 无菌水的 250 mL 三角瓶中，于摇床 上振荡 30 min。用无菌水将土壤溶液逐步稀释，取 3 个浓度梯度 10-3、10-4 和 10-5 的稀释液各 100 μL， 在 LB 培养基上涂板，平板置于 37 ℃培养箱中培养（刘立志 等，2004）。待菌落长出后，根据其培 养特征的不同，挑取平板中占优势的单菌落，通过划线法进行分离、纯化。将所得的菌株保存在 –80 ℃冰箱中（甘油密封）。 采用传统的 5 点对峙法进行初筛，取 PSA 平板复壮后的草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌菌饼（直 径 = 8 mm）接种在 PSA（直径 = 90 mm）平板中央，然后在距离菌饼中心 3 cm 处点种待筛选的细 菌，以不接种细菌作为对照（宋玉红，2006）。置于 27 ℃培养箱中培养，直到对照长满整个平板为 止，筛选出对致病菌有明显拮抗作用的细菌菌株。重复上述步骤 3 次，进行复筛，得到具有较好的 抑菌活性的菌株。 1.4 拮抗菌株抑真菌活性测定 于 PSA 平板中心接种尖孢镰刀致病真菌菌饼（直径 = 8 mm），27 ℃培养 2 d 后，在平板上距离 菌饼中心 3 cm 处划线接种待复筛菌株。继续置 27 ℃培养观察，直到对照的致病菌菌丝长满平板为 止，测量抑菌带并计算抑菌率。每个拮抗菌株重复 3 次（赵秀娟，2007），以只接种致病菌菌饼不点 种拮抗菌作为对照。 抑菌率（%）=（对照菌落直径–处理菌落直径）/对照菌落直径 × 100；抑菌带：病菌菌丝边 缘到细菌菌落边缘的距离。 经复筛确认对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌具有较高活性的拮抗菌进行广谱性试验。采用划线 对峙法，分别以桃褐腐病菌、辣椒炭疽病菌、黄瓜灰霉病菌、草莓灰霉病菌、玉米青枯病菌、棉花 红腐病菌、草莓红中柱致病菌和草莓胶孢炭疽病菌等作为供试病原真菌，每种供试真菌重复 3 次， 测量抑菌带。 1.5 拮抗菌鉴定 1.5.1 形态和生理生化测定 分别对拮抗菌进行形态学和生理生化特征等测定（东秀珠和蔡妙英，2001）。 1.5.2 拮抗细菌 16S rRNA 基因的 PCR 扩增、序列测定与分析 PCR 所用正向引物为 27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物为 1492R：GGTTACGTTAC GACTT（Lane，1991）。DNA Marker 由北京普博欣生物科技有限责任公司提供，PCR 试剂盒购买 于 Biomiga。PCR 反应程序为：95 ℃ 5 min，30 个循环（95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s），72 ℃ 10 min。50 μL PCR 反应体系为：正反向引物各 1.5 μL，5 μL 10 × buffer，4 μL DNTP，1 μL Taq 酶， 35 μL 无菌水，2 μL 菌液。PCR 产物切胶回收纯化后送北京基诺莱普生物技术有限公司（Genolab Biotech Co.，Ltd）测序。 将所得的 16S rRNA 基因序列用 BLAST 软件与 GenBank 数据库进行相似性比对，采用 ClustalX 1.81 程序包将测得的序列与标准菌株片段进行比对，运用 MEGA4.1 软件采用 Neighbor Joining 方法 构建系统发育树。 1660 园 艺 学 报 38 卷 1.6 抑菌机理的初探 1.6.1 拮抗细菌代谢产物的抑菌活性测定 拮抗菌上清液的制备：拮抗菌株用 LB 液体培养基，37 ℃，160 r · min-1，振荡培养 48 h 后， 12 000 r · min-1，4 ℃离心 20 min，弃沉淀，随后取上清用 0.22 μm 的微孔过滤器过滤，得到上清 液。 碟片法：配制尖孢镰刀病原菌的孢子悬浮液，用血球计数法调整孢子浓度到 106 个 · mL-1，吸 取孢子悬液 200 μL，均匀涂板，用镊子取 1 个无菌滤纸碟片（直径 = 10 mm），吸取 20 μL 拮抗菌 的上清液，放置平板中央（刘西莉，2004）。每个菌株重复 3 次，以只蘸取 LB 液体培养基作为对 照。 牛津杯法：用牛津杯取代滤纸片，在牛津杯中加入 200 μL 的拮抗菌上清液，以牛津杯中只加入 LB 液体培养基为对照（刘西莉，2004）。置于 27 ℃培养，直至对照病原菌长满整个平板，每个处 理重复 3 次。 1.6.2 拮抗细菌对草莓根腐病菌菌丝形态影响的观察 用牙签挑取如 1.4 节得到的与拮抗菌对峙培养的供试尖孢镰刀真菌边缘处菌丝，取少许菌丝均 匀涂片，镜检。观察拮抗菌株对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌菌丝形态的影响。 1.6.3 拮抗细菌对草莓根腐病菌超微结构影响的观察 取如 1.4节得到的与拮抗菌对峙培养的供试尖孢镰刀真菌边缘处菌丝，用 2%戊二醛固定 2 ~ 4 h， 然后用 0.1 mol · L-1 的磷酸缓冲液清洗，再用 1%锇酸固定 2 h，用重蒸水冲洗，直至无锇酸气味后， 用乙醇系列梯度（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）逐级脱水（每级 5 ~ 10 min），包埋 液包埋后分别按如下程序进行聚合，（37 ℃ 12 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 18 h），待样品块凝固后取出， 用修块机修块，半薄切片定位后进行超薄切片，经铀、铅双染后用 H-7500 透射电镜观察细胞超微 结构。 2 结果与分析 2.1 拮抗细菌菌株的筛选及拮抗效果 从分离出的 436 株土壤细菌菌株中经 5 点对峙法初筛和复筛，筛选出 3 株对草莓根腐病菌—— 尖孢镰刀菌有较强拮抗活性且稳定性好的菌株，这 3 株菌株分别命名为 w-25、w-79 和 w-181。 划线对峙法中这 3 株菌株对草莓根腐病菌的拮抗效果如表 1、图 1 和图 2 所示。其中，w-25 菌 株抑菌效果最好，抑菌带宽度达到 11 mm 左右，而 w-79 和 w-181 菌株的抑菌带宽度分别为 5.4 和 6.4 mm。 表 1 3 株拮抗菌对草莓根腐病菌的拮抗效果（对峙培养 7 d） Table 1 Inhibitory effects of the three bacterial strains（culture 7 days） 注：同一列中不同小写字母表明差异性显著，P = 0.05。 Note：Different small letters in the same column indicated significant difference at P = 0.05. 拮抗菌株 Bacterial strain 抑菌带/mm Bacteriostasis zone 抑菌率/% Inhibiting rate w-25 11.0 ± 0.2 a 76.2 ± 3.6 a w-79 5.4 ± 0.3 c 57.3 ± 2.5 b w-181 6.4 ± 0.4 b 59.0 ± 1.0 b 9 期 汪雪静等：草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与鉴定 1661 图 1 3 株拮抗菌对镰刀菌的拮抗效果图（对峙培养 5 d） A：对照；B：w-25；C：w-79；D：w-181。 Fig. 1 Antagonistic effect of the three bacterial strains（culture 5 days） A：Control；B：w-25；C：w-79；D：w-181. 图 2 是 3 株拮抗菌株抑制草莓根腐病菌生长随培养时间增加的动态变化图，进一步动态说明这 3 株菌株能较好的抑制草莓根腐病菌的生长。 图 2 3 株拮抗菌抑菌率的动态趋势 Fig. 2 Dynamic changing of inhibiting rate of the three bacterial strains 2.2 拮抗菌菌株对 8 种病原真菌的抑制作用 w-25、w-79 和 w-181 菌株不仅对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌具有很好的抑制作用，同时对供 试的其他 8 种植物病原真菌也有很好的抑菌活性（表 2）。 表 2 3 株拮抗菌对 8 种病原真菌的抑菌作用测定结果 Table 2 Widespread use of the three bacterial strains 注：同一列中不同小写字母表明差异性显著，P = 0.05。 Note：Different small letters in the same column indicated significant difference at P = 0.05. 抑菌带/mm Bacteriostasis zone 拮抗 菌株 Bacterial strain 桃褐腐病菌 Monilinia fruticola 辣椒炭疽病菌 Colletotrichum acutatum 黄瓜灰霉病菌 Botrytis cinerea 草莓灰霉病菌 B. cinerea 棉花红腐病 Fusarium moniliforme 玉米青枯病 菌 Pythium inflatum 石楠拟盘多毛孢 Pestalotiopsis photiniae 草莓胶孢炭疽病 菌 Colletotrichum gloeosporioides w-25 8.4 ± 0.4 b 3.5 ± 0.2 a 3.6 ± 0.5 c 5.5 ± 1.2 ab 7.1 ± 0.3 b 5.0 ± 1.4 ab 8.9 ± 1.7 a 5.0 ± 0.7 ab w-79 5.2 ± 0.8 c 4.1 ± 1.0 a 7.6 ± 0.4 a 4.9 ± 0.3 a 9.3 ± 1.0 a 3.3 ± 0.4 b 3.5 ± 0.6 b 4.0 ± 1.2 b w-181 10.8 ± 0.5 a 3.9 ± 0.6 a 4.8 ± 0.5 b 6.7 ± 0.3 a 4.8 ± 0.6 c 5.9 ± 0.3 a 4.8 ± 1.3 b 6.9 ± 0.6 a 1662 园 艺 学 报 38 卷 2.3 拮抗菌株的形态和生理生化鉴定及 16S rDNA 基因序列分析 根据检索表及检测结果初步鉴定 w-25 可能属于荧光假单胞菌，w-79 和 w-181 属于枯草芽孢杆 菌（表 3 和表 4）。 将测得的 16S rDNA 序列与 GenBank 中已知序列进行同源性比较，运用 MEGA4.1 软件采用 Bootstrap Test of Phylogeny-Neighbor Joining 方法构建系统发育树，w-25 菌株与荧光假单胞菌 16S rDNA 序列相似性达 99%，w-79 和 w-181 菌株与枯草芽孢杆菌 16S rDNA 序列相似度最高，相似性 达 99%。w-25、w-79 和 w-181 菌株 16S rDNA 序列 GenBank 登录号分别为 HQ731027、HQ731028 和 HQ391902。系统发育树图谱见图 3。 表 3 拮抗菌的菌落形态及特征 Table 3 Morphological identification 表 4 生理生化鉴定 Table 4 Physiological-biochemical identification 注：“+”表示阳性，“–”表示阴性，“ND”表示暂无测定。 Note：“+”means positive reaction；“–”mesns negtive reaction；“ND”means no identify. 菌株 Bacterial strain 菌落形状 Colonies shape 边缘 Edge 颜色 Color 表面光滑凸起与否 Surface is smooth and bump or not w-25 圆形 Round 较整齐 Shipshape 初始为乳白色后为红褐色 After the initial red-brown to creamy white 表面湿润稍凸起不透明 Raised slightly opaque surface wet w-79 圆形 Round 较整齐 Shipshape 初始为乳白色后淡红色 After the initial pink to creamy white 表面光滑干燥紧贴表面生长无凸起 Close to the surface，dry and smooth without bulging w-181 圆形 Round 不整齐 Irregular 白色 White 表面光滑干燥紧贴表层生长，生长力很强 Close to the surface growth，dry and smooth and growing very strong 特征 Characteristic w-25 w-79 w-181 荧光假单孢菌 Pseudomonas fluorescens 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 革兰氏染色 Gram stain – + + – + V-P 测定 V-P test – + + – + 芽孢染色 Gemma stain – + + – + 类脂粒颗粒 PHB – – – – ND 生长温度 Growth temperature：4 ℃ + – – + – 生长温度 Growth temperature：41 ℃ – + + – + 氧化酶 Oxidase + – – + ND 接触酶 Catalase + + + + + 葡萄糖和果聚糖产生 Glucose and fructose production – – – – – 硝酸盐还原 Nitrate deoxidization + + + + ++ 乙酰胺 Ethanamide + + + ND ND 丙二酸盐利用 Malonate utilize test – – – ND – 淀粉水解 Amylum hydrolysis – + + – + 明胶液化 Gelatin experiment + + + + + 精氨酸双水解 Arginine dihydrolase + + + + ND 荧光色素 Fluorochrome test + – – + ND 脓青素的产生 Pusastaxanthin production test – + – – ND 绿针菌素的产生 Chlororaphin production test + – – – ND 耐盐性（NaCl） Growth with NaCl：2% + + + ND + 耐盐性（NaCl） Growth with NaCl：5% – + + ND + 耐盐性（NaCl） Growth with NaCl：7% – + + ND + 耐盐性（NaCl） Growth with NaCl：10% – + + ND + 卵黄卵磷脂酶 Lecithin hydrolysis ND – – ND – 厌氧生长 Anaerobic growth – – – – – 9 期 汪雪静等：草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与鉴定 1663 图 3 基于 16S rDNA 序列同源性分析 3 株拮抗菌的系统发育树 树枝上的数字表示 Bootstrap 验证中该树枝可信度的百分比。 Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence The number of branches said the percentage of the credibility in bootstrap validation. 2.4 抑菌机理初探 2.4.1 拮抗细菌代谢产物的抑菌活性 从表 5 可见，w-25、w-79 和 w-181 菌株代谢产物对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌有较好的抑制 作用，特别是 w-25 和 w-79 菌株的抑菌活性较高。由碟片和牛津杯试验结果推断 w-25、w-79 和 w-181 菌株代谢产物对植物病原真菌生长有较好的抑制作用。 表 5 3 株拮抗菌的牛津杯和碟片试验 Table 5 The oxford cup test and paper disc method of the three bacterial strains 注：同一列中不同小写字母表明差异性显著，P = 0.05。 Note：Different small letters in the same column indicated significant difference at P = 0.05. 2.4.2 w-25、w-79 和 w-181 菌株对草莓根腐病菌菌丝形态的影响 普通显微镜观察 w-25、w-79 与 w-181 菌株和草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌对峙培养后病菌菌 丝形态的变化，可见草莓根腐病菌菌丝生长受到严重影响，菌丝细胞壁溶解，菌丝畸形，断裂，呈 无规则结构（图 4）。 2.4.3 拮抗菌株对草莓根腐病菌细胞超微结构的影响 对照组各细胞器轮廓清晰可见，细胞内线粒体丰富，而 w-25、w-79 和 w-181 菌株和草莓根腐 病菌—尖孢镰刀菌对峙培养后，尖孢镰刀菌的原生质浓缩，细胞器溶解消失，细胞内出现大量液泡 （图 5）。 拮抗菌 Bacterial strain 碟片抑菌圈（直径/mm） Paper disc method 牛津杯抑菌圈（直径/mm） Oxford cup test w-25 28.79 ± 0.83 b 8.28 ± 0.40 b w-79 32.92 ± 1.28 a 12.54 ± 0.25 a w-181 17.45 ± 0.49 c 6.37 ± 0.50 c 1664 园 艺 学 报 38 卷 图 4 拮抗菌对病原菌菌丝体的破坏作用 A：对照，菌丝隔清晰可见，菌丝边缘光滑；B：w-25，菌丝畸形； C：w-79；D：w-181；C、D 菌丝均变成畸形。 Fig. 4 The effect of inhibiting the mycelium antagonistic bacteria destroyed the pathogen mycelium A means normal；B，C，D means monstrosity of w-25，w-79 and w-181. 图 5 拮抗菌对病原菌细胞的破坏作用 Fig. 5 The effect of bacterial strain damaging pathogen cell 3 讨论 拮抗细菌 w-25 经形态观察、生理生化分析以及 16S rDNA 序列测定，其分类地位可能为荧光假 单胞菌。近些年荧光假单胞菌是生防菌研究中最热门细菌之一。本研究中 w-25 菌株表现出很高的 抑菌活性，在与草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌对峙培养中，其抑菌带可达到 11.0 mm，抑菌率达到 了 76.2%，对其生长有很好的抑制效果。碟片试验中一般来说抑菌圈的直径达到 10 mm 就说明其具 有较好的抑制作用，而 w-25 对草莓根腐病菌的抑菌圈直径达到了 28.79 mm，对病菌孢子萌发有显 著的抑制作用。此外，菌株 w-25 对供试的其他 8 种病原真菌包括草莓炭疽病、草莓灰霉病和草莓 黄萎病等都有较好的抑制作用。说明 w-25 的菌体和代谢产物具有较广的抑菌谱和抑菌活性。 w-79 与 w-181 菌株经鉴定可能为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilies）。目前，对草莓根腐病的生 防菌研究所涉及的芽孢杆菌种类不少，主要集中在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilies）、多粘芽孢杆菌 （Bacillus polymyxa）、地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenformis）、乳芽孢杆菌（Lactobacillus sp.）等（Akutsu et al.，1993；齐爱勇 等，2006）。芽孢杆菌是公认的抗逆性强、抗菌谱广泛的菌种，其中枯草芽孢 杆菌是近些年生防菌研究最多的。孙瑶等（2006）筛选到对棉花黄萎病菌具有拮抗活性的枯草芽孢 9 期 汪雪静等：草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与鉴定 1665 杆菌。w-79 和 w-181 这两株拮抗菌，不仅对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌的拮抗活性很高（在碟片 试验中抑菌圈直径均在 15 mm 以上），而且表现出了很好的广谱性。 此外，本研究中还对 w-25、w-79 和 w-181 菌株的抑菌机理作了初步探讨，发现这 3 株拮抗菌 对草莓根腐病菌——尖孢镰刀菌的菌丝生长和孢子萌发都有较好的抑制作用。经过普通显微镜和透 射电镜观察，发现这 3 株菌株分泌物会引起致病菌菌丝细胞壁溶解，菌丝畸形、断裂、呈无规则结 构，细胞内液泡扩大。徐淑华等（2005）报道拮抗菌会引起草莓根腐石楠拟盘多毛孢菌菌丝畸形、 原生质浓缩、菌丝破裂，本试验观察到的与之基本一致。w-25、w-79 和 w-181 菌株代谢产物破坏致 病菌菌丝形态和亚细胞结构也进一步佐证了它们具较强的抑菌活力。拮抗菌株的抑菌机理还有待进 一步研究阐明。 References Akutsu K，Hirata A，Yamamoto M. 1993. 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