梁平柚鼠李糖基转移酶基因Cm12RhaT的克隆及表达分析

梁平柚鼠李糖基转移酶基因Cm12RhaT的克隆及表达 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 梁平柚鼠李糖基转移酶基因Cm12RhaT的克隆及表达分 析 独创性声明 学位论文 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目:鎏垩抽鼠奎糖基缝整酶基固鱼互绁垦互的壶隆拯麦达盆 盘 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中了特别 标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中 作了明确说明并表示衷心感谢。 签字日期:如年么月,日 学位论文作者:秽彳 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定, 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文 被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院筹可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:协保密,口保 密期限至 年 月止。 导师签名:警掩 学位论文作毒签名:我昂 签字日期:“. 签字日期: 年月.厂日 上,许多月.日 四四四 \ 本实验由教育部新教师基金“基于基因发掘柑桔苦 味相关功能标记,国家自然基金“介导的化 修饰对腊梅花发育和抗寒性调控途径的探索’’项目资助。目录 摘要..?. 第章文献综述??. .柚类.资源的研究概况。 ..柚类资源栽培历史与品种分布??. ..柚类的生物、生态学性状?。 ..柚的起源与演化??. ..柚的多样性研究??. .柚皮苷的研究进展?. ..柚皮苷在柚中的生物合成途径??. ..柚皮苷在柑橘果实中的含量及分布. ..柚皮苷的生物活性?. ..柚皮苷的应用.. .鼠李糖基转移酶基因的研究进展第章引言? .研究背景.研究的目的和意义? .研究的技术路线?.. 第章梁平柚,拙肠丁基因的克隆与序列分析??。 .实验材料?。 ..植物材料??. ..菌株和载体? ..主要试剂..主要仪器设备 ..自配的主要试剂.实验方法?. ..引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ..梁平柚叶片的提取?. ..梁平柚叶片的提取及第一链的合成. .. .基因的获得.. 。披妇基因的生物信息学分析 .结果与分析. ..梁平柚,放而基因编码框全长的克隆??。 ..梁平柚,基因序列特征. .. .基因编码蛋白的同源比对.. 。与具有糖基转移基团的基因的氨基酸聚类分析??. .. .基因编码蛋白的结构特征第章梁平柚。基因原核表达载体的构建及目的蛋 白的融合表达.. .实验材料和试剂..实验材料..主要试剂..主要设备..自配的主要试剂.实 验方法?.. ..梁平柚,基因原核表达载体的构建?.. ..目的融合蛋白的诱导表达?.. .电泳检测目的融合蛋白的表达?...? ..表达体系的优化...? ..融合蛋白的的分离纯化与复性?...?~ ..鼠李糖基转移酶酶学性质测定与分析...?. .结果与分析? ..梁平柚,基因原核表达载体的构建?。 .. .在的表达.. ..表达体系的优化?.. ..重组融合蛋白的分离、纯化与复性. .鼠李糖基转移酶的融合蛋白的酶学性质测定与分析??. 第章鼠李糖基转移酶基因,的基因表达分析??. .实验材料?. ..植物材料..主要仪器?.. ..主要试剂?.. .实验方法?.. ..实验材料的采集?。 ..总提取及第一链合成 . ,砌表达特性分析. ..实时荧光定量引物设计?. ..实时荧光定量引物的特异性检测?. ..定量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品制备?一 .. ,表达的荧光定量分析.. .结果与分析? ..总.提取. .. ,表达特性分析?. .. ,放表达的荧光定量分析.. 第章讨论。 .关于,尺砌基因的原核表达 .鼠李糖基转移酶基因,的基因表达分析第章总结? .结论??. .. ,基因片段的克隆与编码蛋白的特性分析.. .. ,基因的原核表达??。 .. ,基因的表达分析??. .本文新意?. .后续工作?. 参考文献??. 缩略词表致射?. 在校期间发表的文章和参与的项目摘要 的克 梁平柚鼠李糖基转移酶基因 隆及表达分析 硕士研究生: 张军 细胞生物学专业 指导教师: 李名扬教授 摘 要 柚 .又名抛、文旦等,是芸香科柑桔属 植物。已证实柑橘苦味来自两方面的作用,黄酮类化合物中的柚皮苷和柠檬苦素 类化合物。柚皮苷、柠檬苦素在柚果实中均有较高的含量【】,柚皮苷是柚中主要的 黄烷酮,具有降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇动脉粥样硬化的主要致 病因素水平的作用【。在食品工业上,柚皮苷既可作为天然色素、风味改良剂和 苦味剂用于食品、饮料的生产,又可作为合成高甜度、无毒、低能量的新型甜味 剂二氢柚苷查尔酮和新橙皮苷查尔酮的原料【】。柚皮苷的应用将越来越广泛。在植 物次生代谢物合成途径中关键酶的分离及其基因的克隆是植物次生代谢酶 促反应 机制研究的基础,而特定植物次生代谢物合成与积累量取决于其合成途径中的限 速酶,它们在植物次生代谢物生物合成途径中往往位于代谢支路分叉口或途径的 下游【。鼠李糖基转移酶作为柑橘中最主要的苦味物质柚皮苷合成过程中的关键酶 近年来受到广泛的关注。 本研究在前人研究的基础上,从梁平柚中扩增出了一个鼠李糖基转移酶基因 .。构建了,基因的原核表达载体,研究的主要结果如下: .鼠李糖基转移酶基因,的扩增及编码蛋白性质分析 根据公布的鼠李糖基转移酶基因的序列,设计并合成 特异性引物。以梁平柚成年树幼叶为材料,通过和.方法扩增到鼠李糖 基转移酶乃基因,的序列和序列登录号为: 。长,推测的编码蛋白,包含个氨基酸,理论 分子量为.。进一步分析可知其有个磷酸化位点,没有信号肽。, 蛋白二级结构由螺旋,.%,延伸链,.%,随机卷 曲 ,.%组成。在上对其保守结构域分析发现,瑾 因编码的蛋白质属于 超家族。 .,基因原核表达载体的构建及表达体系的优化两南大学硕士学何论文 将,瑾因克隆到原核表达载体,构建了该基因的融合表 达载体.,转化到大肠杆菌中,经最优条件,和 .?.诱导表达获得大小约为的目的融合蛋白,对融合蛋白进行 可溶性分析发现该融合蛋白以包涵体形式存在。 .,蛋白质的分离纯化、复性与活性检测 重组蛋白以包涵体的形式存在,以的尿素溶解包涵体,按公司的蛋 白纯化系统操作指南进行分离纯化并稍做改进,通过透析复性,分离纯化得 到了 较高浓度..。和纯度为%的融合蛋白。利用柚果皮和叶片中的天然物质 测定酶活性,得到的数据不能够计算出酶活力,但能看出叶片中的柚皮苷含 量比 果实中的高。 .,瑾因表达分析 利用实时荧光定量检测梁平柚的,基因以及其它. 种柑橘品种温州蜜 .、费米耐劳.、沙田柚 .、血橙 ..的同源基因在不同时期的表达。定量分析表明该基因在梁平柚叶 片的表达量显著比高于果实。从开花后天到天,该基因的表达量总体上随 着果实的成熟而逐渐降低。其同源基因在其它品种中也呈波动性表达模式。 个品 种都有表达且表达趋势基本一致。 关键词:鼠李糖基转移酶;,基因;原核表达;苦味;基因表达 ? . : : : ....】 .. 行 . ., . ,,., . . . . , . . ,, .., . : .口 两南大学硕学位论文 . . 嬲. , ,. , ., , . , 仃 .%, .%, %. . . ,口丁,. .,? . ’. . . . , 谢.. .%. .~. ., ? , . . . .., .. .. 。.’ ,. . .:;, ; ;; 第章文献综述 第章文献综述 .柚类 .资源的研究概况 柚 .属于芸香科柑橘属的一个基本种。果形硕大,果 肉晶莹脆嫩、风味独特、甘甜清香【们,维生素含量为柑橘类之冠,且耐储藏运 输,有天然罐头之美称~,深受人们喜爱,也是医学界公认的最有食疗作用的水 果之一,是柑橘家族中的后起之秀。柚为我国重要的栽培植物种质资源,经济价值 高,近年来国内外的开发利用方兴未艾。目前对柚研究的侧重点主要有一下几个 方面:柚的起源、柚种质资源分析、品质分析、生物学特性、果实发育规律探讨, 有关生理性病害如柚的外裂、枯水粒化、囊瓣开裂及药理学等方面研究的深度及 广度还十分有刚’引。 ..柚类资源栽培历史与品种分布 我国是柚类人工栽培最早的国家,夏书《禹贡》就有“扬州??厥包橘柚锡 贡’’的记载;《吕氏春秋》有“果之美者,云梦之柚之说,证明柚的栽培至少有 三千多年的历史。柚在我国各柑桔产区均有分布,根据地理、气候和品种类型的 自然组合,中国柚类形成三个中,产区【】】,即东南沿海柚产区,主要省市为福 建、浙江、台湾,以瑁溪蜜柚、玉环柚、四季柚、晚白柚为代表品种;华南柚产 区,主要省市为广东及广西,以沙田柚及其芽变后代为代表品种;西南及长 江流域柚产区,主要省市为四川、重庆、湖南、贵州、云南、江西、湖北等, 代表品种有通贤柚、脆香甜柚、五布红心柚、东试早柚、龙都早香柚、龙安柚、 真龙柚、垫江白柚、梁平柚、安江香柚、龙回早熟柚、信木柚、沙田柚及其芽变 类型。田中长曾提出可将柚分为内陆性柚和海洋性柚两大系统,内陆性 柚较原始,海洋性柚则为较进化类群【。中国内陆性柚分布于秦岭、长江中游以 南、南岭以北的四川、湖北、湖南、江西、广西以及云贵地区;海洋性柚分布于 浙江、福建、广东沿海和台湾?】。我国柚类的主要分布如表。 ..柚类的生物、生态学性状 柚又名“抛、栾、文旦【 ,是芸香科柑橘属植物。原产于亚洲,亚热带常 绿乔木【】。喜温暖湿润气候,生长快,叶大枝粗,花、叶、果、种子均较其他柑桔 类为大,叶为单身复叶,高~:嫩枝、幼叶、幼果披柔毛,小枝具针刺,有 时无:叶较大,长约,叶柄有宽翼叶成倒心形;翼叶发达,花为总状花序 或穗状花序,花瓣呈白色,单生或为总状花序;雄蕊为.:子房呈圆形,花柱 为圆柱形,柱头膨大;果实较大,球形、梨形或为圆锥形,直径约.:果实 为柑果类型,果大,球形、扁圆锥形或梨形,直径;果皮较厚,平滑或粗糙,西南 大学硕七学:论文 黄色;幼叶、嫩梢、幼果表面常被茸毛。囊瓣瓣,肾形;种子从无到多达 颗以上,单胚,有棱皱:花期为春季.月,月上中旬开始第一次生理 ,果期为秋季.月:品种间除成 落果,月上中旬开始第二次生理落果【 熟期有所差异外,其它物候期基本一致。 ..柚的起源与演化 年美国植物分类学家将柚确立为一个生物学“种。尽管有人 对柚的种的地位提出异议【】,研究指出,真正的柑桔亚属有个基本种,即 枸橼 、柚.和宽皮柑桔.,这个结论得到越来越 多研究的支持。对于柚的起源,张太平【】等研究认为,大翼橙类为柚的祖先。 朱立 武【】根据叶片中可溶性蛋白质的谱带相似性,推黜宁大翼橙柚橙橘 柑这样的柑橘属种类的演化进程。方德秋【 】等通过同工酶研究的结果, 初步总结 出了柑橘三属植物的演化图,并指出了柑橘属植物有五个“基因源,分别为大 翼 橙类、枸橼、宜昌橙类、柚类及桔类;大翼橙类为最原始的类型,而部分柑类、 葡萄柚及甜橙是较为进化的类型,后生柑橘类种质资源丰富,其主要原因是源内 部的不断演化,同时也由于源和源之间的杂交形成的。 柚的起源地至今还众说纷纭,归纳众家之说主要有个,即起源于东南亚、 中国南部或印度北部,但由于都未能找到大面积的野生柚类,缺乏佐证,仍未有 定论。张太平等对柚的遗传多样性研究还表明,四和广东为我国柚类遗传多样 性的两大中心,另外福建、广西、浙江、湖南为柚类遗传多样性的主要地区【】。 ..柚的多样性研究 遗传多样性在广义上是指种内或种间表现在分子、细胞、个体个水平的遗 传变异度,狭义上则主要是指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度。因此, 对遗传多样性的研究可分为形态、细胞、酶和分子个方面【】。中国是柚类起 源中心和遗传多样性分布中心之一,据不完全统计,全国柚类品种系在个以 上【。 近年来,、、、、等分子标记技术在柚类遗 传多样性研究中得到应用。张太平【】等用筛选的对随机引物对沙田柚的个 系列样品进行了分子标记分析并结合聚类分析,认定广西沙田柚、梅州金 柚为沙田柚的无性繁殖系,软枝系沙田柚、沙田柚早熟单株为沙田柚的芽变后代, 梅花早柚、菊花心沙田柚、冬瓜圈沙田柚、段氏柚、垫江沙田柚、古老钱沙田柚 为沙田柚的实生变异品系。彭瑜,苏智先【 】等结合形态学标记和分子标记对柚类 品种进行了遗传多样性评价,揭示了柚类品种间丰富的遗传多样性,表明利用叶 片形态学性状和分子标记都能很好地进行柚类品种分类,而利用叶片形态学 第章文献综述 性状进行分类的方法更是填补了传统柚类形态学分类的空白。龚桂芝等【】利用 和分析了枳属种质遗传多样性及其与近缘属植物亲缘关系。刘勇【】等 结合和分子标记,评估份柚类种质资源及近缘种分子系统关系, 探讨国内外柚品种间的遗传距离与亲缘关系,为中国柚类种质资源收集保存、分 类鉴定、合理开发利用与品种选育提供科学的理论依据。庞晓明【】等利用胞质基 因组区特定区域的、.和等标记技术对沙田柚、葡萄柚个柚 类及近缘种类进行了研究,得出了柚类作为现代三个栽培种的基本观点,葡萄柚 为柚与甜橙的杂种。 柚类核型存在对称性不同的类型。如魏文娜报道的对称性较强的柚核型【】 以 及梁国鲁报道的较不对称柚核型四】。赖钟雄【】等核型分析的结果显示, 福建柚品 种的核型对称性是处在梁国鲁报道的较不对称的柚类核型以及段映池【】等 报道的 对称性较强的柚类核型的一系列的过渡类型。 表.我国柚类主要品种及其分布 .. 两南大学硕十学位论文 品种名 原产地 品种名 原产地 分布区 分布区 江西南康 江西南康 村头柚 江西南康 江西南康 毛橘红柚 湖南黔阳 湖南黔阳 安江糯米柚 湖南黔阳 湖南黔阳 红庙红心柚 湖南黔阳 段氏柚 重庆 四川、重庆、江 安江石榴柚 湖南黔阳 四川东部 津等地 夔府红心柚 四川万县、 早禾柚 广西桂林 广西桂林 涪陵、江津 江西樟树 江西樟树 蓬溪柚 四川蓬溪 四川各地 金沙号柚 大湖号 广东大埔 广东大埔 罗定无核柚 广东罗定 广东罗定 特早熟柚 砧板柚 广西容县 广西、广东 大马八斤柚 四川石棉 四石棉 白芽柚 广东梅县 广东 广东南海 广东南海 白宫早柚 广东梅县 广东梅县 丝线柚 西双版纳 西双版纳 化州橘红柚 广东化州 广东化州、 东试早柚 广西玉林 横碛甜柚 湖北枝城 湖北枝城 新都柚 四川新都 四川新都 通贤柚 四川内江 四内江 红柚 湖南零陵 湖南零陵 桂花柚 福建章平 福建章平 湖北秭归 西双版纳 西双版纳 秭归甜柚 湖北秭归 曼赛龙柚 湖南大庸 祁东香甜柚 湖南祁东 湖南祁东 菊花心柚 湖南大庸 福建吉田 常山胡柚 浙江常山 浙江常山 湖滨蜜柚 福建古田 小甜柚 云南西双版纳 西双版纳 酸柚 广东、广西、 广东、广西、四 彭县暹罗柚 四川彭县 四川彭县 四川、湖南、 、湖南、云南 沙菊柚 湖南大庸 湖南大庸 云南 .柚皮苷的研究进展 柚皮苷为芸香科柑橘属植物次生代谢产物。柚皮苷广泛应用在医学、食品科 学、化学等领域。在食品工业上,柚皮苷可作为天然色素、风味改良剂和苦味剂 用于食品、饮料的生产【。在医药工业上,柚皮苷可用于生产防治心脑血管疾病及 消炎药物。此外,柚皮苷还能用于制备多种高附加值的有机物,如鼠李糖、柠檬 素、酸性偶氮染料和其他植物染色剂以及具有更高活性和药用价值的半合成黄酮 类化合物【 。它们所具有的一系列生物活性功能引起了医药和食品工作者的兴趣。 而我国是一个柚子生产大国,具有丰富的柚皮苷资源,因此大力开发利用柚皮苷, 前景广阔。 第章文献综述 ..柚皮苷在柚中的生物合成途径 三分子丙二酰辅酶和一分子香豆酰辅酶由查尔酮合酶催化反应生成查尔 酮柚皮素,查尔酮异构酶催化将查尔酮柚皮素转化为柚皮素,在柑橘中黄烷酮在 位点糖基化形成黄烷酮...葡糖苷,黄烷酮...葡糖苷进一步糖基化,在,鼠李 糖基转移酶的作用下生成无苦味的柚皮芸香苷,在,鼠李糖基转移酶的作用下生 成有苦味的柚皮苷,如图.所示。 一川‖ 一。妒洲 鲥叼科翻拍?蛔即喇?:黝鱼皇’刖【;翻越簋岫 图.柚皮苷的生物合成途径 ...柚皮苷在柑橘果实中的含量及分布 柚皮苷,全称为柚皮素..一新橙皮糖苷,主要存在于柚 、葡萄柚 及其变种的果皮及 矛酸橙 果实中,它是引起柑橘苦味的原因之一。柚皮苷是葡萄柚和普通柚的主要苦味物 质和特征性黄酮类化合物,分别占葡萄柚和普通柚中二氢黄酮总量的?.%和 %。普通柚果中柚皮苷含量明显低于葡萄柚,前者仅为后者的.%【】,柚 皮苷在上述果实组织中的分布不均匀,其中果皮中柚皮苷的含量大约占全果柚皮 苷含量的%,而在中果皮中含量最高,果汁中含量最低,中果皮中柚皮苷的含量 是果汁的.倍【。柚皮苷在不同时期的果实中的含量随着果实从形成到成熟而 逐渐下降,幼嫩果实中的柚皮苷含量极高,随着果实的膨大,柚皮苷的含量直线西南大学硕十学位论文 下降成熟期时略有减少,在储藏期时稍微有点增长。这明显是由于营养物质 在储 藏过程中被消耗,导致干重下降,从而使得其含量增高。 ..柚皮苷的生物活性 抗氧化的作用 许多研究表明,柚皮苷具有多方面的生物活性,. 等【】通过比较 柚皮苷与普罗布考的抗氧化作用研究柚皮苷的抗氧化作用,结果表明 柚皮苷能够降低肝细胞线粒体中过氧化氢的含量,增加超氧化物歧化酶 和过氧化氢酶在肝脏中的活性,进一步研究发现柚皮苷还能诱导 抗氧化酶基因的表达。柚皮苷的抗氧化作用主要与其对、.、 和的作用有关【】。这种氧化作用可以降低铁离子对细胞的氧 化作用【如。 降血脂的作用 柚皮苷还有降血脂【,降血胆固醇【】的功能;.等发现柚皮苷能够 增加乙醛还原酶、乙醛脱氢酶活性、降低肝中甘油三酯及血液和肝 脏中总胆固醇的含量,增加高密度脂蛋白胆固醇.的含量,增加.与 总胆固醇的比例,并同时降低致动脉硬化指数,促进胆固醇从血浆到肝脏 的转运和胆汁分泌排泄、抑制向或的转化,所以柚皮苷可以降 低动脉硬化和冠心病的几率【。 抗焦虑和镇静作用 】等研究了黄酮类对中枢神经系统的作用,发现柚皮苷 小鼠给药/可以显著增强戊硫代巴比妥钠引起小鼠睡眠的时间,降低小 鼠穿过小洞的次数和在管道中跑动的距离。提示其有一定的镇静、安神作用。 抗肿瘤作用 柚皮苷对杂环胺类物质、.甲基.,,,四氢.咔啉..羧酸和.甲基..硝基.. 亚硝基胍的致突变性具有抑制作用【一】;通过抑制参与致癌物活化作用的 细胞色 素异构体的活性来发挥抗癌作用,能抑制亚硝胺、黄曲霉毒素及其他致癌物 的致癌作用,对乳腺癌、肺癌等肿瘤有一定预防作用【舶; 锄锄【】等研究发现,柚皮苷元能减少致癌剂诱发的大 鼠胃癌发生率。日本东北药科大学学者等【对该方面进行了比较系统的 研究,研究的化学因素包括阿拉伯糖苷胞核嘧啶引起的氧化细胞凋亡,过氧 化氢 引起的细胞凋亡,脂多糖引起的小鼠休克和降低含氮氧化物产生的作用等, 其机 制包括抗氧化作用和抑制基因的活性。 同时也有学者】报道柚皮苷可以在不影响香烟中致癌物质代谢的情况 第章文献综述 下其代谢产物水平不变,显著抑制对链的破坏。同时,由 于.胡萝素会增强对链破坏作用,柚皮苷可以降低这种副作用。另 有报道柚皮苷可以降低肿瘤坏死因子的释放,从而降低脂多糖对肝脏的损 伤【】。 抗菌作用 柚皮苷可以抑制青霉菌生长半径浓度,抑制率%,并通过显微观察 发现其能够抑制青霉菌孢子的形成【】。对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志 贺氏 菌、埃氏大肠杆菌及某些真菌有抑制作用【.】 对内分泌系统的作用 通过抑制胰腺细胞因氧化而导致的凋亡,调控脂肪酸、胆固醇和葡萄糖代 谢酶的表达水平及活性,柚皮苷可以促进肝脏内糖的分解,降低肝糖浓度,从而 达到对早期糖尿病和并发症的防护作用【,。 提高其它药物的生物利用度 柚皮苷可通过抑制肠道内或肝微粒体内细胞色素的活性以及与 肠道内.糖蛋白发生相互作用等多种途径影响某些药物在人体内的代谢过程、改 变某些药物在人体内的吸收速度和吸收量、提高或降低药物的生物利用率、增强 或降低这些药物的疗效及毒副作用等,促进一些药物在人体内的吸收和代谢 ,, ..柚皮苷的应用 在医学中的应用 柚皮苷显示出多种生物学活性和药理作用。广州中医药大学苏玲等【】报道柚 皮苷具有降低胆固醇的作用。覃青云【】等通过一系列的药理实验表明含有柚皮苷 的牙膏具有较好的消炎、止血作用。同时柚皮苷在牙膏中的稳定性研究表明 柚皮 苷作为功效成分加入牙膏中质量是稳定可控的。 在化学中的应用 柚皮苷还作为一种重要的原料广泛应用在化学合成中,福建师范大学黄丽梅 等【,以中药柚皮苷为印迹分子,壳聚糖为膜材料,通过硫酸交联在水相中制备 分子印迹壳聚糖膜。此外柚皮苷【】还可以水解成柚苷配基...葡糖苷、柚 皮素、鼠李糖、葡萄糖等重要生物医药化工中间体。 :。..在食品科学中的应用 柚皮苷可作为天然抗氧化剂广泛应用于食品科学中。贾冬英【】等:采用二苯 代苦味肼基自由基法和硫代巴比妥酸法对种柚皮苷一金属配合物 的抗氧化活性进行了测定,结果显示,以柚皮苷.铁配合物的抗氧化作用最大,它两南大学硕十学位:论文 有望作为一种新型抗氧化剂应用于油脂中,也可作为一种功能性食品基料,用于 特殊功能性食品的生产,使人体在摄入抗氧化剂的同时,也得到微量元素铁的补 充。李赤翎【】等研究表明,随着猪肉储藏时间的延长,柚皮苷能够很明显的改变 猪肉的亮度和黄度,对猪肉红度的影响先下降后回升,综合考虑,选择/的柚 皮苷作为猪肉等动物肉作为天然抗氧化剂和防腐保鲜剂效果比较显著。 .鼠李糖基转移酶基因的研究进展 柑橘的苦味严重影响着柑橘鲜食以及加工产品的品质,柑橘苦味形成方面的 研究始于世纪年代。已证实柑橘苦味来自两方面的作用,黄酮类化合物中 的柚皮苷和柠檬苦素类化合物【。柠檬苦素类化合物它是由无苦味的柠檬碱. ,在柠檬苦素环内酯水解酶 环内酯 的作用下生成的,并且在酸性条件和果实受到生理损伤时,使水 解酶的作用得到加划】。柚皮苷是柚、酸橙、葡萄柚中的主要苦味物质,也是 柑橘果汁中主要苦味物质之一,其含量高低影响果汁色泽、口味和稳定性 【。.】证明葡萄柚无细胞提取物中和活性以 及在苦橙细胞培养中研究和,地活性。 .从葡萄柚 中纯化出酶进行了酶的同质性和酶底物专一性研究, .【】 】在柠檬组织中对的活性进行了量化研究。 从葡萄柚中纯化得到酶,但由于缺少.鼠李糖,所以对研究该酶的同 质性和酶动力学有了极大的限制性。 等】已从葡萄柚中分离得到的 编码,鼠李糖转移酶,.基天,并进行了功能研 究,证明此酶对类黄酮化合物引起的苦味有直接作用,但专门研究该酶的报 道依 然较少。 第章引言 第章引言 .研究背景 柑橘是柑、桔、橙、金柑、柚、枳等水果的总称,是世界上主要水果之一。 中国柑橘产量仅次于巴西、美国,位居世界第三。柑橘果汁中因含有多种营养成 分,除含有丰富的葡萄糖、果糖外,还有核黄素、类黄酮化合物等物质而倍受青 睐。柑橘的多重加工和综合利用具有很大的利用价值。而柑橘的苦味是柑橘加工 过程中的一个关键问题。现已知柑橘类果汁中的苦味物质主要有以柚皮苷、新橙 皮糖苷等为代表的黄烷酮糖苷类化合物和以柠檬苦素、诺米林等为代表的三萜系 化合物。然而,柑橘中的柚皮苷等黄酮类化合物在抗氧化、抗肿瘤、降血脂等方 面具有很高的生物活性。人们在脱苦的同时,又在研究黄酮类化合物的药理作用。 柑橘风味和香气来源于一些可溶解的、挥发性的复杂化合物。前者含有大量的糖、 有机酸和黄烷酮,黄酮类化合物是葡萄柚和其他柑橘品种苦味的重要组成部分。 柑橘属植物积累大量的黄烷酮影响果实苦味并且已经证明它对身体健康是非常有 利的。苦味的柑橘品种中积累影响苦昧的重要物质黄烷酮...橙皮糖苷,例如: 葡萄柚和柚。无苦味品种中积累大量的黄烷酮...新橙皮糖苷,如桔和橙。柑橘 风味的决定步骤鼠李糖基转移酶催化黄烷酮.配糖体的生物合成,,鼠李糖基转移 酶决定苦味的橙皮糖苷的生物合成,而鼠李糖基转移酶决定无苦味的新橙皮糖 苷的合成。,鼠李糖基转移酶作为合成柚皮苷的关键酶,参与柑橘类植物的次生 代谢过程。 .研究的目的和意义 本试验从梁平柚中分离出,瑾因,并对其序列进行了初步分析。根据 瑾因编码区设计特异引物,采用.克隆梁平柚瑾因。通过构建梁平 柚瑾因融合表达载体.,并在大肠杆菌中进行融合 蛋白的初步表达,旨在探索梁平柚在大肠杆菌中的最适表达条件。分离纯化 融合蛋白并进行酶活性检测,为研究梁平柚瑾因在苦味形成机理上提供理论 依据。也为进一步研究蛋白在调控柚皮苷合成中扮演的角色打下基础。通过 荧光定量分析梁平柚、温州蜜柑、费米耐劳、血橙、沙田柚中的,趿其同 源基因的表达关系,探索柚皮苷在不同柑橘品种间的分布和积累规律。 两南大学硕学位论文 .研究的技术路线第章梁甲枘,基冈的克隆与序列分析 第章梁平柚,基因的克隆与序列分析 .实验材料 ..植物材料 .、费米 梁平柚 .、温州蜜柑 . .、血橙 耐劳 .、沙田柚 ..成年树的幼叶和果实采集于中国农业科学院柑橘 研究所资源圃,新鲜叶片于.?冰箱保存备用。 ..菌株和载体 大肠杆菌菌株购白天根生物技术北京有限公司。 克隆载体.购自于公司。 ..主要试剂 聚合酶、普通聚合酶及相关试剂均购自于大连公司;质 粒提取及胶回收试剂盒均购于公司:氨苄青霉素等抗生素购自于鼎国昌盛 生物技术有限责任公司;等购于杭州博日公司;其它常规试剂 主要购自上海生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司;物合成由华大基因完成。 ..主要仪器设备 仪、高压灭菌锅日本、紫外分光光度计岛津、 高速冷冻离心机、凝胶成像系统.、超净工作台苏州净 化设备厂、制冰机和超低温冰箱、台式冷冻离心机、 型涡旋器广州仪科实验室科技有限公司、培养箱、型电泳仪和琼脂糖水 平电泳槽北京六一厂。 ..自配的主要试剂 .缓冲液:/.,/.。 : /.冰醋酸.,././。 培养基培养大肠杆菌用 ’// 目 琼脂 /液体培养基不. 氨苄青霉素两南大学硕士学伊论文 水溶后超滤,贮存浓度为/,.。避光保存 .实验方法 ..引物设计 根据上公布的鼠李糖基转移酶基因,的全长序列登 录号:,用.软件设计一对特异性引物,使其扩增的产物包括 上游引物: 完整的开放阅读框并尽可能为最大: : ,. 从.’, 下游 引 物 ’..气久?.’。 ..梁平柚叶片的提取 的提取所用的试剂盒是产品,天根生物技术北京有限公司 取植物新鲜组织约 或干重组织约,加入液氮充分研磨。 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有?预热缓冲液的离心管 中实验前在预热的中加入巯基乙醇,使其终浓度为.%,迅速颠倒混匀 后,将离心管放在?水浴分钟,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 加入氯仿,充分混匀,,离心分钟。 小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中,加入缓冲液 ,充分混匀。 将混匀的液体转入吸附柱中, ,离一二秒,弃掉废液。 向吸附柱中加入缓冲液,,离心秒倒掉废液, 将吸附柱放入收集管中。 向吸附柱中加入漂洗液,,离心秒,倒掉废液, 将吸附柱放入收集管中。 重复操作步骤。 将吸附柱放回收集管中,,离一分钟,倒掉废液。将吸附柱 置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加 .洗脱缓冲液,室温放置.分钟,,离心分钟,将溶液手机 到离心管中。 取山的样品于%琼脂糖凝胶上电泳,以检测的质量。 ..梁平柚叶片的提取及第一链的合成 的提取及第一链的合成需要避免酶降解,提取所用的枪头 第章梁甲枘,基冈的克隆与序列分析 与离心管均需用%水溶液处理?,并进行高温灭菌。玻璃制品、镊子及 研磨均需高温烘烤方可使用。 的提取所用的试剂盒是产品,天根生物技术北京有限公司 .植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末,加入,涡旋剧烈震 荡混匀。 将所有溶液转移至过滤柱上,,离心分钟,小心吸取收集 管中的上清至.的离心管中,吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉 淀。 缓慢加入.倍上清体积的无水乙醇,混匀,将得到的溶液和沉淀一起转 入吸附柱中,,离心.秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 放回收集管中。 向吸附柱中加入去蛋白液,,离心.秒,倒掉 收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 工作液的配置:取储存液放入新的.离心管 中,加入溶液,轻柔混匀。 向吸附柱中央加入的工作液,室温放置分钟。 向吸附柱中央加入去蛋白液,,离心.秒, 倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入漂洗液,室温静置分钟,,离 心.秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 重复步骤。 ,离心分钟,倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟, 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 将吸附柱放入一个新的.离心管中,向吸附膜的中间 部位悬空滴加..,室温放置分钟,,离心 分钟,得到溶液。 第一链的合成 以提取的为模板,按水公司试剂盒说 明书合成第一链。所有操作均需在冰上进行。两南大学硕士学何论文 基因组的除去反应。反应体系如下表: 试剂 使用量. 坠丝壁垒望: 婴坐 . 将其混匀后,?变性 反转录反应。反应体系如下表: 成分 用 量 . 。 . 山 的反应液 . 坠竺宝 竖璺旦坦 塑:巳 反转录:将上述混合液混匀后,置于仪中,?反转录。 ?失活后,停止反应。 .冷冻保存。 .. ,基因的获得 扩增 以提取的梁平柚基因组与为模板进行扩增。 反应采用.的体系: .矿 . . ./ / 肛 .? 反应条件为:预变性,变性,退火, 延伸,个循环:延伸。%琼脂糖凝胶电泳检测产物。 第章梁甲枘,基冈的克隆与序列分析 . 回收目的片段 电泳结束后,在紫外灯下用洁净的刀片割下含有目的的琼脂糖凝胶 块,并使其尽可能小,放入.的离心管中。 按:的比例琼脂糖凝胶质量毫克数:溶胶液体积微升数加入 ,置于恒温水浴中温育,直至凝胶完全溶化。期间每隔 颠倒混匀一次。 内,室温静置, 将完全溶化的液全部转移到 于离心,并弃去接液管内的液体。 ,室温静置,于 向 中加入的 ,离心,并弃去接液管内的液体。 向 中加入“的 ,室温静置,于, 离心,并弃去接液管内的液体。 转移至干净的.离 于,再次离心,而后将 心管中。 ,室温静置。 向 中加入山的 于,离心,离心管内的溶液中含有目的片段,.。保 存。 回收的纯化产物与克隆载体的连接 连接体系为山: 片段 . .、,. .“ 肛 ?连接过夜。 大肠杆菌感受态细胞的转化 将连接产物?灭活,加入到感受态细胞中,轻柔混匀,冰上 放置。 ?水浴;冰上放置 .加入的液体培养基,振荡培养。 吸取肛的上清后,重悬,用涂棒将培养物均匀涂布于含相应抗生 素的平板上,?,倒置培养过夜。 转化子的鉴定西南大学硕十学位论文 取个.的无菌离心管,加入.附加有/的液体 培养基,挑取单菌落并接于离心管中,?,振荡培养过夜,以菌液 为模板,参照做检测。 测序分析 选取检测为阳性单克隆的菌液,送华大基因测序。利用. 软件对测序结果进行分析。 .. ,基因的生物信息学分析 生物信息学分析主要利用 .、 .及网上的软件包进行。 主要网址有:通过 ://....//.分析 ,的的开放读码框: 利用 ://../分析蛋白质分子量、等电点和亲水性;利用 软件://..../进行序列相似性搜索。采用 软 件 包://../. // .预测蛋白质的二级结构。蛋白序列的多重比对以及系统进化 树的构建采用本地软件 .与 .软件包进行、利用 ://..//.分析蛋白的疏水性区域。利用 ...//分析信号肽。利用 .://...///来分析蛋白的磷酸化位点。参照 等‘方法并利用软件进行同源比对和氨基酸聚类分析。 .结果与分析 ..梁平柚,基因编码框全长的克隆 电泳显示,从梁平柚嫩叶的基因组和中扩增得到了大小一致的特异 产物图.,分析测序结果,两者都含有一个的开放阅读框,根据, 编码氨基酸均与上公布的其它植物的有很高的同源性。其中最高的 源于 的 。 :.,同一性高达%和%图.。初步获得基因 和序列,且和测序结果一致,推测柚基因组基因中无内含子 存在。 第审梁甲柯 ,堆冈的克降与序列分析 ? ? 鼢 啪 图.梁平柚鼠李糖基转移酶基因的扩增 / .一 . : :梁平柚礁冈::梁平柚基.冈;:阴性对照 : /;: .;: / 拙 .;: ????????一??嘲???一? “ ””’?一 : ?“ ‘??? ’ ,:、 ::盟玉二二 . 神?科巾?蛔捌:“墉引丑 ? ??肝,?州?‘蕾?篝 ?~ ????矗?岫?? 竹 ?止 .佃内“【?? 盥 鲫?’ ? ? 簟璃出山 呐协憎膏耐蜘嘲唧??呻“哪 埘 ? 帆 亚直誓:‘硝咖订?胁 争‘?砒?阳嘲?由,??‘??一’ 囝口 ,、 酽‘:’:砌四?啪,舢? 忡哪? 苫?鼻? 圆 ?~ ??? 曩』苴盆缸】纠帕眦佃?卜,?争‘??争?崩朋憎、向嘲???口越?廿 田 口 ?~ 扯? ???“ 圈口 壁』虹西 ?日?自:‘,? 晴日懈?,“?? 图 基因的蝎分析 . ..梁平柚,尺口丁基因序列特征 应用软件包中的对梁平柚,瑾因编码框分析, 克隆的梁平柚鼠李糖基转移酶基因的编码框由个、个、个和个 组成,其中十的含量为.%,的含量为.%。其编码的蛋白具有个 .%, 氨基酸,个碱性氨基酸,占总数的.%,个酸性氨基酸,占总数的 个极性氨基酸,占总数的.%,含有个疏水氨基酸,占氨基酸总数的 .%,推测其蛋白分子量为.,预测的等电点值.,命名为 ,登录号:。 .. ,基因编码蛋白的同源比对 保守结构域搜索表明,蛋白是属于 超家族,具有典型的糖基转移基团。利用 分析,显示在?位有 .糖基转移酶保守结构。进一步将,与同源蛋白进行序列多重比对和两南人学 硕学何论文 结构预测分析。,具有保守的.糖基转移酶保守结构区域 ?图?,这与 【等研究结果非 常吻合。 ?, ? ;??“..?: ‘:?‘:, :‘ ?,‘? ?.?‘: ?..:?‘?? ?.;:? 计:??‘: 静.’ ??,? 嚣四 ‘??口?口 ?一???工 ?。:??::】 :‘ ,??‘, ?.?,?: ?.:‘?‘ ,.?一?~‘’ ?‘?‘’..‘ ?,“: ’??’: ??:? ??..,??? 图. 蛋白同源比对及编码蛋白序列的保守结构域预测. :拟南芥 ;:柚 ;:彩虹菊 ;:梁平柚:: 烟草 ;:紫苏 ;:矮牵牛 ;:藏垮 ;: 美女樱 ;:黑古豆 ;:葡萄 ;:.米 . .. ,与具有糖基转移基团的基因的氨基酸聚类分析 糖基转移酶在牛物体内催化活化的糖连接到不同的受体上,其家族成员丰富, 糖基转移酶的作用位点不尽相同,根据其催化后羟基连接的位置可以将作用位点 大致分为.、.、.、.,、.,等。将本实验扩增出来的鼠李糖基转移酶 基因与具有糖基转移基团的基因聚类分析,如图所示,可以看出在位置具有糖 基化或糖基转移基团的聚为一类,如:矮牵牛、拟南芥、葡萄、黑吉豆、玉米, 在位置具有糖基化位点或糖基转移基团的作用位点的聚为一类,如:紫苏、美 女樱,在位置具有糖基化位点或糖基转移基团作用位点的聚为一类,如:烟草、 黄芩、彩虹菊,在,位有酶作用位点的柚、梁平柚聚为一类,在,位具有酶作用 位点矮牵牛则单独形成一支。糖基化位点或酶作用位点是形成一类的关键因素。 这也证实了本研究所获得的,瑾因是在,位上有酶作用位点的鼠李糖基 转移酶。 第章梁甲枘.球冈的克降与序列分析 矮牵牛。.?. 臻晕牛.. ;. 拟南芥. 蛳.孤、. ?萄. ,。 黑吉曼.丫口 .弘 眦, 玉米,研. 繁苏。 。。耻明 芙文覆. %.从 烟覃。 锄 曲 从 ?苓.: ..哇 彩虹菊.吼锎咄..嗽 柚.珥?缸..叫 粟平抽,缸 .?城 矮晕牛.矾吼“.砸.蚯 矗阿 ,口 口 口 图. 与具有糖基转移基团的基因的氨基酸聚类图 . , . :,半乳糖转移酶;:。葡萄糖摹转移酶;: 鼠李糖基转移酶 .. ,基因编码蛋白的结构特征 疏水性区域分析 疏水作用是蛋白质折叠的丰要驱动力,是了解蛋白质折叠的第一步,是分析 蛋白质二级结构的基础。同时也是分析跨膜区域的重要一步。疏水性区域能 使蛋 白质部分或全部结构定位于膜上,它的存在是牛物膜蛋白的重要特征之一。 对蛋 白质疏水性区域的分析为其结构域和功能域的划分提供了重要依据。应用 ://..//.对,蛋白的疏水性进 行在线分析,结果显示图.,蛋兰,中疏水性最大值为.,最小值 为.。 ,且亲水性区域和疏水性区域交错出现。 ? 一 一 一 ? 们 ? ‖ ? ??? ?? ??? ?? ??? ??? ????????? ???,.?.????.?? 图 蛋白疏水性区域预测 . 两南人学硕学位论文 二级结构预测 二级结构预测通常被认为是蛋白质结构预测的第一步,有着重要作用。采用 软 件 包 白质的二级结构,结果显示图.,,蛋白二级结构由【螺旋, ,.% .%,延伸链 ,.%,随机卷盐 组成。 碱冒髓肼由】:‘ :. 髓丑 .且 ’. : : 盯弛斛铆阳虹工?髓趣【??仃阳聊姨削 砧牲口工砌? 二::::一一一一:.一:::一一:丑蹦玎丑丑,髓冀髓一:一一丑丑丑舅,一:: 『蜘工工?咐..】彻?帆亨、 ‘ : . :‘: :。。 ’。 舅舅五, 呸 『 :‘::二::.: .丑珏嘲..一: :..: .:一..:一一.一.丑丑苴/点 /一一一一.一一:,一一一一.一一..一一:..一一一一一一一.一一 、?口?工口耻咖唧 日丑丑且丑到瓢.:: :::: 臌..:,二二二:二:二一日丑量暖旺玎田匿丑丑暖口,:二.脚衄 囊?旺,,:’憾 即氇暇田衄一。一一耳邱田瑾田且.:: 强: ?.?’ 胁: ?.% , ‘口’::.? ?. : 暑? .’ ? : ?.% ,:,:.,. 血 :, : 】.? ?.? : .? . 口暑?,,, ?? : ? . 舯?胁艄锄 ?扣一锄帅婚四?心?船四删 四 刚四睁心蕊吡 一 蛋白二级结构预测 图. 信号肽预测 信号肽决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸残基修饰。应用 ...//对,蛋白进行信号肽预测分析, 所有计算值的结果均为‘”图?,认为该蛋白质不具有信号肽序列。第章梁平枘,堆冈的克降与序列分析 图 舱蛋自信号肽预测 . 蛋白质磷酸化预测 蛋白质翻译后修饰在牛物体内有着重要作用,它使得蛋白质的结构更趋完善, 功能更加健全,调节更为精细,作用更加专一。而蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后 最重要的修饰方式之一,在信号转导过程中起着极其重要的作用。通常,丝氨酸 、酪氨酸和苏氨酸是蛋白质的磷酸化位点。利用. ://...///在线分析,蛋白的磷酸化位 点,结果显示图?,,蛋白中存在磷酸化酪氨酸、磷酸化丝氨 酸和磷酸化苏氨酸三种丰要的磷酸化氨基酸,磷酸化位点数量较 多,共个,其中丝氨酸个、苏氨酸个、酪氨酸个。 由此推测翻译后的蛋白很可能存在多样化修饰。 雎,州锄,工?口吃?嚣刺舭捌厄讲.‘眦, 口 :.:::... ??::: 二::江“口::::、:蚍、 口鼻 ::【砧::’馕 ::计:’叶皇 :. ::: 腿?吃 奢,:. ?再口址 : 圊口口.% ? 口?、例?圊州瓤口囊? ?工讧‘口 工口 .工.豫丘 .............................................................................. ............. ‘.............................。................................ ............................................................................ ............,..... ?..’........................................................ ........??.?.?...................................??.?.? .............?.?...........?....................... ? ?。??? ,??土?暑矗?己??口?????????????,???’???? ??????????? 图 蛋白磷酸化位点预测 .筇章梁甲枘,基冈原核表达载体的构建及目的蛋广的融合表达 第章梁平柚,基因原核表达载体的构建及目的蛋 白的融合表达 为了解,基因编码的蛋白质在梁平柚中具体的生物化学及分子生物 学功能,本实验利用大肠杆菌的表达优势,构建了含有,基因的原核表 达载体,并将其转入大肠杆菌中进行目的蛋白的融合表达,获取具有生物活 性的 重组蛋白,并进行酶活性测定。 .实验材料和试剂 ..实验材料 大肠杆菌 克隆菌株、原核表达宿主菌菌 株购置于鼎国昌盛生物技术有限责任公司,原核表达载体,具有 抗性,均由本实验室保存。克隆载体.购自瑚出大连公司。 ..主要试剂 购自 聚合酶及相关试剂、连接试剂盒、. , 有限公司; 限制性内切酶均购自公司: 购自于杭州博日公司;质粒提取及胶回收试剂盒均为公司的 产品;购自公司;氨苄青霉素,及卡那霉素 ,,%的、.%的凝胶贮液、./?.、 ./?.购自于鼎国昌盛生物技术有限责任公司,蛋白质分子量 、上样缓冲液及蛋白电泳相关试剂均购自上海生物工程技术服务有限公司; 引物合成与测序均由华大基因完成。 ..主要设备 型电泳仪北京六一厂;蛋白电泳仪.;超声波细胞破 碎仪宁波新芝生物科技.。仪;凝胶成像系统 .。 ..自配的主要试剂 抗生素的配制 水溶并超滤后,卡那霉素,均 /的浓度避光保存 于.?。 .电泳试剂的配制 %/的过硫酸胺两南大学硕士学位论文 将.过硫酸胺溶于的中。 电极缓冲液 称取.的,.的甘氨酸,,加入蒸馏水使其溶解后定容至。 凝胶与染液的配制 配制 %的分离胶:%的凝胶贮液;./的 %的 %的.;. “。 啊... 配制%的浓缩胶:%的凝胶贮液.:./的.. .:%的:%的;.:。 固定液:%的甲醇,冰乙酸,混匀。 考马斯亮蓝染液:称取考马斯亮蓝.,加上述固定液, 过滤后贮存。 脱色液:甲醇,冰乙酸,加蒸馏水定容至。 缓冲液的配制 用蒸馏水溶解、.、.和.。用 将溶液的值调节至.,加水定容至。高压蒸气灭菌后,保存于冰箱 中。 基本培养基的配方 培养基培养大肠杆菌用 ?胰蛋白胨 酵母提取物 / / 琼脂 /液体培养基不加 .实验方法 ..梁平柚,基因原核表达载体的构建 引物设计 根据,基因序列设计了对特异性引物,分析,基因的限 制性酶切位点并结合表达载体的特点,分别在上、下游引物中引入 和酶切位点。引物合成由华大基因有限公司完成。 构建载体所用引物序列为: 上游引物:’..’; 下游引物:’.广.’。 在上下游引物的’端分别加入锄和酶切位点和保护碱基下划线部分 为酶切位点,斜体部分为保护碱基。 第幸梁甲枘,基冈原核表达载休的构建及目的蛋门的融合表达 扩增与产物的回收 以..构建的/质粒为模板,用..设计好的引物进 行扩增。 反应体系为:. .. 矿 . ..妯. “ . ’ . 扩增条件:?预变性,变性,?退火,?延伸, 个循环;?延伸。%琼脂糖凝胶电泳检测产物。 产物经%琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收,回收方法参考..。 将回收的目的片段连接于载体. 连接按照..的方法进行。 大肠杆菌感受态细胞的转化 将连接的产物转化入大肠杆菌感受态 细胞中,转化方法参考..。 挑取单菌落摇菌,以菌液作为扩增的模板,进行菌液的鉴定。 反应体系及扩增条件同上。 经鉴定后,选取检测为阳性的单克隆,送华大基因测序。 ./质粒与表达载体质粒的双酶切 提取测序验证正确的./质粒,将连有,基因的 ./质粒和表达载体的质粒分别进行和 双酶切。 双酶切体系如下: 西南大学硕十学位论文 / . 一 .“.. .“ ?,酶切。 双