细胞迁移侵袭试验技术(Transwell)

细胞迁移侵袭试验技术(Transwell) 迁移实验,cell migration assay， 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤: 1材料准备: 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基(也可加到20%血清)，无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫) 2步骤和流程 2.1基质胶铺板: 用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37?30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ?制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12,24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ?消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS洗1,2遍)，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ?取细胞悬液100µl加入Transwell小室。 ?24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ?培养细胞:常规培养12,48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料 ,1，Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning) ,2，细胞培养相关试剂,无血清培养基,10,血清培养基,PBS,0.02,EDTA ,3，固定液,甲醇 ,4，染色液,Giemsa染液 ,5，封片剂,中性树胶 ,6，其他,小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片 操作步骤 ,1，所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37?温育， ,2，待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗 5 涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×10/ml， ,3，在下室,即24孔板底部，加入600,800μl 含10,血清的培养基,上 室加入100,150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时， ,4，用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇 的孔中,室温固定30分钟， ,5，取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液 的孔中,室温染色15,30分钟， ,6，轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小 心擦去上室底部膜 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面上的细胞， ,7，用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片， ,8，显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。 注意事项 ,1，根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔 径,如AGS细胞，,如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径， ,2，根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well 4chamber接种细胞数约为2?5×10/well,迁移时间12?36小时， ,3，由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber,为了 避免操作污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板,Corning，， ,4，如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得 的上清加50μg/ml FN,Fibronectin，,具体可查阅相关文献， ,5，细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平， ,6，固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜 表面上未迁移的细胞,以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊 子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破， ,7，Chamber和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组， ,8，充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。 细胞侵袭实验 ,cell invasion assay， 实验材料 ,1，Matrigel (BD 5mg/ml),-20?保存 ,2，其余材料同迁移实验 操作步骤 ,1，Matrigel在4?过夜融化， ,2，用4?预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操作， ,3，在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel,37?温 育4,5小时使其干成胶状， ,4，后续步骤同迁移实验,1-8，。 注意事项 ,1，Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提 前在4?预冷， ,2，铺胶时保证液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡， ,3，其他注意事项同迁移试验。 其他 Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤 (1) 基质胶准备:将冻存于,80度冰箱的BD matrigel 4度过夜(24h)，变成液态; (2) 取300ul无血清培养基，加入60ul(或50ug/每室)Matrigel ，混匀，( 4?操作，最好在冰浴上)，加入上室各100ul(3个室);放入37?培养箱中，孵育4-5h(>5h);此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。 注释:无血清培养基和基质胶按1:5稀释，每孔加50ul，在37?培养箱中1-2h。 (3) 消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液; (4) 用无血清培养基洗 Matrigel洗1次;每孔加入100ul细胞悬液; (5) 下腔室中加入500ul含有20,FBS条件培养基; (6) 37?培养箱中，孵育20-24h; (7) 取出transwell用PBS洗2遍， 5%戊二醛固定，4?; (8) 加入结晶紫(0.1%)染色或Giemsa染色(5,10min)，室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。 迁移实验 transwell 在 24 孔板中浸泡 1 小时;消化细胞，无血清培养基 洗 2 次，计数，配成 细胞悬液 ，每孔加入 100ul 细胞悬液;加药刺激;下腔室中加入 条件培养基或其他刺激因子; 37 ? 培养箱中，孵育 20-24h; 取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍， 5% 戊二醛固定， 4 ? ; PBS 洗 2 遍，加入结晶紫( 0.1% )染色，室温 0.5h ， PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数 10 照相，记录。 侵袭实验 取 300ul 无血清培养基 ，加入 30ul (或 50ug/ 每室) Matrigel ，混匀，( 4 ? 操作，最好在冰浴上)，加入上室各 100ul ( 3 个室); 放入 37 ? 培养箱中，孵育 4-5h ( >5h ); 消化细胞，无血清培养基洗 3 次，计数，配成 细胞悬液 ;用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次;每孔加入 100ul 细胞悬液;下腔室中加入 600ul 无血清 条件培养基;37 ? 培养箱中，孵育 20-24h;取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍， 5% 戊二醛固定， 4 ? ;PBS 洗 2 遍，加入结晶紫( 0.1% )染色，室温 0.5h ， PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察 transwell小室是否可以重复利用，该怎样消毒 用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2，效果很好。